Summary
Мы представляем протокол вскрыть гипофиза и подготовить гипофиза коронковой части из развивающихся мышей.
Abstract
Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза. Он состоит из двух желез с отдельным эмбриональное происхождение и функций — neurohypophysis и adenohypophysis. Развивающихся гипофиза мыши маленькие и тонкие с удлиненной овальной формы. Корональных разделе предпочтителен для отображения в adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши.
Целью настоящего Протокола является достижение надлежащего гипофиза корональных секции с архитектурами хорошо сохранившиеся ткани из развивающихся мышей. В этом протоколе мы подробно описывают, как анализировать и обрабатывать гипофиза правильно из развивающихся мышей. Во-первых мыши фиксируются transcardial перфузии формальдегида до вскрытия. Затем три различных рассечения методы применяются для получения нетронутыми гипофиза в зависимости от возраста мышей. Для плода мышей возрасте от новорожденных и эмбриональных дней (E) 17.5-18,5 до 4 дней, разделяются всей Селла регионов, включая клиновидной кости, железы и тройничного нервов. Для щенков возрасте послеродовой (P) 5-14 дней, гипофиза связано с тройничного нервов разделяются в целом. Для мышей более 3 недель гипофиза тщательно расчлененный бесплатно от окружающих тканей. Мы также отображать как внедрять гипофиза в надлежащей ориентации с помощью окружающих тканей как ориентиры для получения удовлетворяющих корональных секций. Эти методы полезны при анализе гистологические и развития функции гипофиза в разработке мышей.
Introduction
Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза1,2. Анатомически гипофиз является '' два в одном '' структура, состоящая из neurohypophysis и adenohypophysis. Эти компоненты имеют разные эмбриональное происхождение и функции очень по-разному. Neurohypophysis является производным от нейронных эктодермы и выделяет окситоцина и антидиуретического гормона. Adenohypophysis происходит от Ратке в мешочек и несет ответственность за освобождение гормонов, в том числе гормон роста, пролактина, тиреотропный гормон, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, Адренокортикотропный гормон, и 3,– меланоцитов, стимулирующий гормон4,5.
Гипофиз опирается на дорсальной поверхности клиновидной кости (турецкого седла) мыши черепа и прикреплена к полу мозга хрупкий стебель. Он окружен боково тройничного нервов и кпереди от зрительных нервов6,7. Железы обладает удлиненной овальной формы с его длинной оси, перпендикулярной, головы. На спинной поверхности neurohypophysis и adenohypophysis можно легко быть разграничены, с бывших оккупирующих спинной медиальной региона и последнего расширения боков и вентрально. Во время послеродового развития размер гипофиза увеличивается быстро, в первый месяц после рождения8,9. Тем не менее гипофиза мыши все еще очень маленький в размер, средний вес 1,9 мг и Лонг ось диаметром ~ 3 мм в взрослых10, длинные оси диаметром 2-2,5 мм на послеродовой день 21 (P21) и только 1-1,5 мм на P0.
Корональных разделе предпочтителен для отображения adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши. Однако некоторые технические навыки требуются для получения удовлетворяющих коронковой части гипофиза из развивающихся мышей из-за его исключительно небольшой размер и собственный анатомии. В этом видео статьи мы демонстрируем как вскрыть гипофиза мыши и подготовить гипофиза корональных секции на различных этапах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
мышей C57BL/6 разводят в конкретных условиях возбудителя бесплатно. Всех животных экспериментальные методы в соответствии с руководящими принципами, утвержденными животное уход и Комитета по этике на второй военный медицинский университет.
1. рассечение из послеродового развития гипофиза
- выполнения анестезии: состоится дробленый лед, чтобы побудить гипотермии новорожденных мышей (P0 - P5). Для мышей старше 5 дней возраста придать 5% уретана (30 мкл/г веса тела) внутрибрюшинно побудить анестезии. Оценка ответов на хвост/мыс щепотки. Только после того, как мышь не реагирует на раздражители вредных.
- Обеспечения мыши в лежачем положении (лежа на спине с лицом вверх), осторожно лентой передних лапах и hindpaws к рабочей поверхности, которая может быть закреплена (т.е., пенопласт) внутри Химический вытяжной шкаф.
- Выполнения transcardial перфузии.
- Разрезать грудную клетку мыши с Ножницы хирургические подвергать сердца (и других органах грудной клетки).
- Безопасный бьющееся сердце с тупым щипцами и вставьте иголку 26G (0,45 мм) левого желудочка. Игла крепится к 10 мл шприц, наполненный гепаринизированным фосфатный буфер (PBS; дополнена нитрит натрия 5 мг/мл и 10 ед/мл гепарина, рН 7,4, нагреть до 37 ° C перед использованием). Немедленно сократить правое предсердие с тонкой ножницы и приступить к perfuse тела с теплым PBS, до тех пор, пока жидкость, выход из правого предсердия ясно.
Примечание: Приблизительно 5-10 мл, PBS требуется для новорожденных мышей и 10-20 мл PBS для взрослых мышей. - Храните иглу в месте и изменить на другой шприц, наполненный параформальдегида 4% (PFA; рН 7,4). Perfuse 10 мл и 20 мл фиксатором для новорожденных и P21 мышь, соответственно.
Предупреждение: PFA является токсичным. Это может вызвать кожи и раздражения дыхательных путей и повреждение глаз. Надевайте перчатки и работают под капотом химического.
- Обезглавить PFA-Исправлена мыши и разрезали кости черепа с ножницами.
- Аккуратно снять задний мозг от основания черепа с небольшой щипцами. При первых признаках турецкого седла отмены остановки, но держите задний мозг, вырезать гипофиза стебля и нервных волокон, подключение к основанию мозга с тонкой ножницами. Этот шаг очень важен для обеспечения что гипофиза не ликвидируется прочь с мозгом.
- Затем держать подъема мозга и удалите весь мозг полностью подвергать гипофиза. Вырезать весь sella региона, в том числе гипофиза, боковые тройничного нервов и под клиновидной кости с ножницами (примерно 3 x 5 мм 2).
- Положить Иссеченную ткань в блюдо 35 мм или одной скважиной 6-ну пластины, содержащий 2 мл холодной 4% PFA (рН 7,4). Исправить ткани на 4 ° C для 40 мин для P0 - P7 pituitaries, 1 ч для P14 pituitaries, 1,5 ч за P21 - P28 pituitaries и 3 h для взрослых pituitaries.
- Дальнейшее диссоциации гипофиза
- мыть фиксированной ткани с 10 мл PBS, 5 изменения, 15 мин. Новорожденных гипофиза вместе с его окружающих тканей и под клиновидной кости могут быть обработаны непосредственно к обезвоживанию. Однако, следует отделить гипофиза от мышей старше 5 дней далее под микроскопом стерео.
- Поместить фиксированный ткани в блюдо 35 мм, содержащие 1 мл PBS. Для P5 - P14 pituitaries, удалите соединительной оболочки между нервов и костей с тонкой щипцами и ножницы и тщательно изолировать гипофиза вместе с боковыми тройничного нервов в целом, но оставляя турецкого седла. Изолированные железы и нервов связаны соединительной оболочки с " H "-нравится внешний вид ( рис. 1B). Pituitaries
- за P21 и взрослых, удалить нервы и соединительной мембраны вокруг гипофиза и свободного железа от окружающих тканей. Оберните гипофиза ткани с объективом, очистка папиросной бумаги и положить его в внедрения кассету.
Примечание: Упаковка крошечные гипофиза с объективом, очистка папиросной бумаги помогает предотвратить любые потенциальные потери образцов и сохранения целостности тканей в следующей процедуре парафин встраивание. Это не может быть необходимо обернуть гипофиза, если оно обрабатывается в маленькую бутылку в процедуре крио встраивание.
2. Парафин встраивание и Sectioning
- дигидрат образцов в встраивание кассеты с 50%, 65%, 75% и 95% растворы этанола за 15 мин. Впоследствии обезвоживает с 3 изменения чистого этанола, 3 мин для P0 - P4 желез, 4 мин для P5 - P14 желез и 5 мин за P21 и старше желез. Снимите с ксилол 3 изменения, 3 мин для P0 - P4 желез, 4 мин для P5 - P14 желез и 5 мин за P21 и старше желез. Проникнуть в расплавленный парафин, 3 изменения, 7 мин для P0 - P4 желез, и 8 мин дважды следуют 6 мин один раз для P5 и старше желез.
Примечание: Оптимальные параметры для обработки ткани может быть эмпирически скорректирована. Для получения высокого качества разделы, следует избегать недостаточно или более обезвоживания. То же самое верно для очистки ткани, используя ксилол. - Ориентация при внедрении
- на ткани, встраивание консоль системы, удалить образцы из кассеты и поместить его в базовой формы наполовину заполненный с расплавленного парафина. Правильной ориентации внедрения гипофиза имеет важное значение для удовлетворения корональных секций.
- За P21 и взрослых гипофиза, позиция гипофиза с ее короткой оси перпендикулярно нижней поверхности базовой формы (плоскости сечения). Используйте клиновидной кости и тройничного нервов анатомические ориентиры для P0 - P4 и P5 - P14 pituitaries, соответственно. Ориент образцов с их тройничного нервов или поперечные пластинки клиновидной кости перпендикулярно нижней поверхности базы плесень.
- Аккуратно прижмите ткани в нужном положении с утепленным тонкой щипцами, до тех пор, пока воск становится полутвердых на охлаждения пластины. Долейте плесень с расплавленного парафина. Разрешить блок парафином остыть до тех пор, пока воск полностью затвердевшим.
Примечание: Гипофиза в эмбриональных день 18,5 (E18.5) могут рассматриваться таким же образом как новорожденных гипофиза. Но pituitaries (Ратке ' s Чехлы) моложе E16.5 должны быть внедрены с всю голову и ориентированы с сагиттальной оси (от устья до затылка) перпендикулярно нижней поверхности базы плесень.
- Chill блоком парафина в-20 ° C для 10-20 мин и затем сократить его на тонкие ломтики (4 мкм толщина предпочтительнее) с микротома. Чтобы получить удовлетворительный корональных секции, тонкой настройки позиции парафиновых блоков при резании. Смонтировать фрагменты тканей на polylysine покрытием стекла слайды для предотвращения отряд срезов в следующих процедурах.
Примечание: Кроме того, образцы могут быть обезвоженной в 15%, 30% (W/V) сахарозы решения (PBS) при 4 ° C до тех пор, пока они опускаться на дно, встроенных в крио встраивание соединение, используя тот же метод ориентации и быстро заморожены на сухой лед. Затем нарежьте ломтиками 8-10 мкм, с помощью криостата блоков замороженные ткани. Морфология крио секции, однако, уступает часто парафин секций.
3. H & E окрашивание и Этикетировочный иммунофлуоресценции
- теплый слайды на огне блокировать при 55 ° C и dewax ксилол, 2 изменения, 4 мин. Обезвоживает образцы с дважды этанола 95% и 75% этанола дважды, 3 мин. Вымойте слайды с дистиллированной водой для 5 мин на шейкере.
- Для H & E окрашивание, краситель разделы в раствор квасцов гематоксилином 6 мин, промойте в РаннING водопроводной воды для 2 мин, дифференцировать с 0,2% аммиачной воды для 45 s и повторно промыть в проточной воде в течение 2 мин. Затем обезвоживает секции с 95% этиловом спирте, за 1 мин и окрашиваются эозином на 2 мин последовательно обезвоживать, очистить и смонтировать.
- , Этикетировочный иммунофлуоресценции
- лечения разделы с метанолом, содержащие 3% H 2 O 2 и 0,01% НАН 3 20 мин при комнатной температуре для инактивации эндогенной пероксидазы. Извлечение антигены путем кипячения секций в буфере извлечения (ЭДТА 1 мм и 1 мм трис-HCl, рН 7,4) в скороварку на 2 мин инкубировать в разделах с блокирующий буфер (5% козьего сыворотки в PBS) за 30 мин при 37 ° с.
- Инкубировать секции с кролик гормон против роста (GH) антитела (1:2, 000) или антител анти глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) Кролик (1:2, 000) разводят в блокирующем буфере на ночь в отеле 4 ° C.
- Секции с вторичное антитело (коза анти кролик IgG-ПХ, 1: 300 в блокирующем буфере) Инкубируйте 35 мин 37 ° C.
- Усилить сигналов с помощью Biotinyl Tyramide (1:50 в буфер Tris физиологического раствора, содержащего 0,3% H 2 O 2) для 15 мин при комнатной температуре и визуализировать стрептавидина-Alexa594 или 488 (1: 300 в блокирующем буфере, 30 мин, 37 ° C).
- Counterstain ядер с DAPI (50 мг/Л в PBS) за 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: Это не может быть необходимо усилить сигнал с помощью системы Tyramide усиления сигнала (TSA). Кроме того, вторичное антитело проспряганное флуоресценции может использоваться для визуализации сигнала.
- Получить изображения с помощью микроскопа флуоресценции оснащены × 4/0,13 DAPI, Техас красный и FITC наборы фильтров, чтобы × 40/0,75 цели и 5,0 мегапиксельной камерой. Используйте 360, 488 и 594 Нм лазер длиной волны для визуализации DAPI, Alexa 488 - и Alexa 594-окрашенных участков, соответственно. Оптимизировать мощность лазера (0,8 был использован как правило) и время экспозиции для желаемого уровня для каждого канала. Захватить изображение под контролем образ приобретение программного обеспечения и наложения изображений флуоресценции, впоследствии с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол предоставляет метод для того чтобы рассечь гипофиза из развивающихся мышей. Для новорожденных мыши, регионов всей Селла, содержащей гипофиза, тройничного нервов и под клиновидной кости были расчленены от основания черепа. Крошечные и деликатный гипофиза остались нетронутыми во время процесса (рис. 1A). Для мышей старше 5 дней, гипофиза, прилагается к боковой тройничного нервов затем были изолированы. Валового структура гипофиза, изолированы от P7, хорошо сохранился мыши (рис. 1B). За P21 мыши увеличен размер гипофиза, замечательно по сравнению с новорожденным мыши. Гипофиз был успешно изолирован с невидимые повреждения при удалении его окружающих тканей (рис. 1 c).
Чтобы просмотреть максимум региона adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза, корональных разделе является предпочтительным. Расчлененный гипофиза были должным образом ориентированы на достижение удовлетворения коронковой части. H & E, окрашивание показал хорошо сохранились морфология adenohypophysis и neurohypophysis в P0, P7 и P21 гипофиза (рис. 2).
Обработанных фрагментов также были совместимы с Этикетировочный иммунофлуоресценции. Например, adenohypophysis и neurohypophysis показал конкретные immunolabeling GH и СВМС, соответственно (рис. 3).
Рисунок 1: рассечение постнатального развития гипофиза. Дорсальная виды расчлененных гипофиза и окружающих тканей от P0, P7 и P21 мышей. A, передней; P, задняя; L, слева; R, справа; SB, клиновидной кости; TN, тройничного нерва; AH adenohypophysis; NH, neurohypophysis. Масштаб баров, 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: гистология мыши гипофиза. H представитель & E окрашивания на гипофиза корональных секций от P0, P7 и P21 мышей. (A, Bи C), малое увеличение виды корональных pituitaries. (D, Eи F) являются расширение подставил областей (A, Bи C) соответственно. Масштаб баров = 1 мм (A, B и C); и 20 мкм (D, E и F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель immunofluorescent окрашивания на гипофиза. (A) GH (красный) специально была выражена в adenohypophysis от P7 мышей. (B) в neurohypophysis от мышей P21 специально была выражена Magnified изображение области оформлена в СВМС а. (C) (зеленый). (D) Magnified образ рамку в ядрах C. окрашивали DAPI (синий). Шкалы бар = 300 мкм (A и C); и 30 мкм (B и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для разработки мышиных pituitaries, он был технически трудно получить правильное корональных секции из-за их маленькие и хрупкие особенности и уникальные анатомические характеристики6,8. Таким образом, некоторые исследовательские группы выбрал середине сагиттальной разделы для анализа морфологии гипофиза эмбрионов и новорожденных в11,12. Хотя в середине сагиттальной части гипофиза способен также показаны переднего, промежуточного и заднего долями в один срез, корональных разделе более предпочтителен, как она может показать максимальное представление этих трех долей. В частности для количественной оценки исследований, таких как определение объема и области гипофиза и подсчитывать количество apoptotic и пролиферирующих клеток, корональных секции превосходят середине сагиттальной разделы с точки зрения их представителя. Здесь мы представляем метод полезным анализировать гипофиза и подготовить гипофиза коронковой части из развивающихся мышей.
Во избежание повреждения гипофиза во время процесса, некоторые методы были использованы в настоящем Протоколе. Во-первых мыши фиксируются transcardial перфузии формальдегида до вскрытия. Этот фиксатор не только помогает сохранить орган архитектуры, но и для удаления красных кровяных клеток, которые часто приводят к авто флуоресценции13. Во-вторых вся sella региона рассекается не прикасайтесь к гипофиза с любой жесткий хирургические инструменты. Окружающие ткани помогают держать гипофиза в свое первоначальное положение и также служить в качестве ориентиров для встраивания ориентации. С эти методы меньше в послеродовом pituitaries от молодых животных можно расчлененный, хотя снижение вероятности возникновения нежелательных повреждений.
Процедура вскрытия в этот Протокол применяется также изолировать мышиных гипофиза, который не был предварительно установленные перфузии. В этом случае больше следует проявлять осторожность, чтобы избежать нежелательных повреждений и железы также быть расчленены как можно быстрее.
Поскольку развивающиеся мышиных pituitaries очень малы по размеру, это было очень трудно ориентироваться их должным образом при внедрении. Этот протокол использует тройничного нервов или клиновидной кости как достопримечательности, делая шаги ориентации намного проще. Правильно ориентированных на pituitaries необходимы для достижения удовлетворения корональных секций.
В целом мы предоставляем улучшение гипофиза диссекции и встраивание протокол, который подходит для мышей на различных этапах. Применение этих процедур можно получить удовлетворение коронковой части мышиных гипофиза, который будет использоваться для анализа обычных гистологии, иммуногистохимия, в situ Гибридизация и развития исследований14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана субсидии от национального естественных наук фонд Китая (31201086, 31470759 и 31671219) и Шанхай фонда естественных наук (12ZR1436900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
