Summary
Vi beskriver puff teknik, hvormed farmakologiske reagenser kan administreres under hele-celle patch-klemme optagelse, og fremhæve forskellige aspekter af de funktioner, der er afgørende for dens succes.
Abstract
Farmakologiske administration er almindeligt anvendt, når der udføres hele-celle patch-klemme optagelse i hjernen skiver. En af de bedste metoder til drug application under elektrofysiologiske optagelse er puff teknik, som kan bruges til at studere effekten af farmakologisk reagenser på neuronal aktiviteter i hjernen skiver. Den største fordel af puff ansøgning er, at narkotika koncentrationen omkring optagelse site stiger hurtigt, hvilket forhindrer desensibilisering af membranreceptorer. Vellykket brug af puff anvendelse indebærer omhyggelig opmærksomhed på følgende elementer: koncentrationen af stoffet, parametrene for puff mikropipette, afstanden mellem spidsen af en puff mikropipette og neuron indspillet og varighed og pres kørsel pust (pounds per kvadrattomme, psi). I denne artikel beskrives en trinvis procedure til at optage hele-celle strømninger induceret ved puffing gamma - aminosmørsyre (GABA) på en neuron af en præfrontal kortikale skive. Især, kan den samme procedure anvendes med mindre ændringer til andre områder i hjernen som hippocampus og striatum og til forskellige præparater, såsom cellekulturer.
Introduction
Patch-clamp-teknik, en primære værktøj til at undersøge elektriske signaler i neuroner, blev udviklet i 1970s1,2. En stor fordel ved denne teknik er, at det giver viden om hvordan specifikke behandlinger (fx farmakologiske) kan ændre neuronal funktioner eller kanaler i realtid3. Farmakologiske evaluering af neuronal funktion under hele-celle optagelse i en hjerne skive kræver anvendelse af lægemidler, såsom agonister eller antagonister af specifikke receptorer på neuroner at blive optaget. Denne metode giver mulighed for identifikation af neuronale ændringer, der opstår efter anvendelse af et bestemt stof, hvilket fører til en bedre forståelse af de fysiologiske og patologiske egenskaber af neuroner4. Selv om farmakologiske administration kan foretages via enten perfusion5 eller puff6, er sidstnævnte den overlegne teknik. Navnlig: (i) puff ansøgning hurtigt stigninger narkotika koncentration omkring indspillede neuron til et niveau, således at desensibilisering af membranreceptorer hindres; (ii) mængden af stof pustede er ekstremt lavt, derfor er der ringe effekt på bad-løsning, som derfor reducerer eventuelle uønskede virkninger af de administrerede kemikalier på hjernen udsnit; (iii) puff-protokollen kan blive indstillet og gemt, at gøre forsøget meget præcist reproducerbar; (iv) puff program repræsenterer økonomisk brug af agonister/antagonists, især hvor sådanne reagenser er dyrt eller svært at opnå.
Her vil vi fokusere på optagelsen hele-celle strømninger induceret ved puffing GABA i akut forberedte hjerne skiver, et præparat, der har fordelen, relativt velbevaret hjernens kredsløb. Hvordan vi gennemfører puff-induceret hæmmende strømninger7 vil blive beskrevet i denne artikel. Ved hjælp af cæsium (Cs+)-baseret indre løsninger, og holder neuronerne på 0 mV, vil vi introducere GABA-puff fremkaldte hæmmende postsynaptiske strømme (eIPSCs) med passende tekniske detaljer. Ved hjælp af en musemodel af depression induceret af LPS (LPS) injektion8, vi viser, at eIPSC reduceres amplitude fremkaldt af en GABA puff betydeligt i skiver af LPS-indsprøjtning mus i forhold til køretøjets forskellige betjeningsapparater. Vores hensigt er, at denne artikel bør vise, hvordan puff teknik er alment gældende for undersøgelser med henblik på evaluering af effekten af kemikalier, forbindelser eller narkotika på neuronal aktiviteter i hjernen skiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr bolig og alle dyr eksperimenter blev udført efter procedurer, der er godkendt af den etiske komité til dyreforsøg på South China Normal University, efter retningslinjerne for Animal Care etableret af National Institute of Sundhed.
1. forberedelse af løsninger
- forberede 500 mL af standard kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) der indeholder de komponenter, der er beskrevet i vores offentliggjorte arbejde 7 som anført i tabel 1.
- Brug rene glas bægre med deioniseret vand til at forberede en frisk ACSF løsning. Ren spatler med deioniseret vand og tørre, før du bruger til at tilføje NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucose, og tilføje CaCl 2 efter at have boblede løsning med 95% O 2 / 5% CO 2 blanding for ~ 20 min (som beskrevet i tabel 1) til 500 mL deioniseret vand. Rør indtil helt opløst.
- Sikre ACSF er helt klart uden nogen nedbør. Derefter justere pH til 7.2-7.4. Boble med en gasblanding består af 95% O 2 og 5% CO 2 for ~ 20 min.
- Forberede 250 mL af skive skæring løsning indeholdende kemikalier 7 beskrevet i tabel 2.
- Tilføje KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucose og tilføje CaCl 2 sidst som angivet i punkt 1.1.1, 250 ml deioniseret vand og opløses som beskrevet i 1.1.1 og 1.1.2.
- Efter boblende med 95% O 2 / 5% CO 2, placere løsningen i en fryser i 15-20 min, så skære løsning bliver iskoldt og delvis frosset.
Bemærk: Vi bruger denne skæring løsning når du laver udsnit fra 1-2 måned-gamle mus; formlen kan variere for mus ældre end 2 måneder. - Forberede LP'ER løsning ved at opløse i sterilt endotoxin-fri isotonisk saltvand (0,9% NaCl). LP'ER administreres intraperitoneal (0,5 mg/kg) og begynder at optage 2 h senere.
2. Forberedelse af præfrontal Cortex skive
- tage opskæring løsning ud af fryseren og homogeniseres for at få en slush. Placer løsningen på is og boble hele tiden med 95% O 2 / 5% CO 2.
- Ved hjælp af store, skarpe saks, hurtigt halshugge en mus som beskrevet 9 og straks sætte hovedet i et bægerglas, fyldt med iskolde (0-4 ° C) skære løsning.
- Skære toppen af kraniet langs midterlinjen i retningen caudale til nasal med fine saks og fjerne de laterale kraniet dele. Fjerne hjernen med en fin spatel og drop i iskold skæring løsning.
Bemærk: Trin 2.2-2.3 skal gøres hurtigt (ideelt < 1 min). - Placerer hjernen på låget af en 9 cm petriskål fyldt med is. Skyl hjernen med iskold skæring løsning. Afbrød lillehjernen og olfaktoriske pære med et barberblad.
- Anvend ren lim. modellen indehaveren af en vibratome. Omhyggeligt placere hjernen blok på dråbe lim, rostralt side op, og straks fordybe i iskold skæring løsning.
- Justere klingeholderen af vibratome i en vinkel på 15° med henvisning til det vandrette plan og forberede 350 µm koronale hjernen skiver (blade vibrationer frekvens = 85 Hz, hastighed = 0.1 mm/s).
- Ved hjælp af en pipette, overførsel skiver ind i recovery salen fyldt med ACSF, inkuberes i 1 h (på RT) med konstant gennemstrømning af 95% O 2 / 5% CO 2.
3. Hele-celle Patch optagelse
- gør glas borosilicate Mikropipetter til brug som optagelse elektroder eller puff Mikropipetter efter de specifikke retningslinjer i betjeningsvejledningen Puller. Til optagelse af elektroder, tip resistenser er i størrelsesordenen 4-6 M Ω, mens puff Mikropipetter har tip diametre i området 2-5 µm.
- Tilføje Na + kanal blokker (TTX, 1 µM), at blok hurtig Na + kanal og dermed handling potentialer, til ACSF og opretholde en konstant gennemstrømningshastighed på denne løsning på 2-3 mL/min. i salen optagelse af peristaltiske pumpe ind i kammeret og aspiration ud af det. Boble ACSF med 95% O 2 / 5% CO 2 konstant at sikre levedygtigheden af udsnittene.
- Overføre en hjerne skive ind i optagelse kammeret ved hjælp af en modificeret Pasteur pipette hvis fin spids blev skåret til at passe den skive størrelse. Dække skive med en platin skive anker med parallelle nylon tråde fordelt ≥ 2 mm fra hinanden til at holde skive på platformen.
- Fyld optagelse mikropipette med intern løsning 7 (tabel 3), og udfyld puff Mikropipetter med GABA på 10 µM, 50 µM, og 100 µM (opløst i ACSF) eller ACSF som køretøjet kontrol.
- Til at forhindre blokering med snavs, anvende lys overtryk ved hjælp af en 1 mL sprøjte før nedsænkning optagelse elektroden i ACSF. Ved hjælp af en micromanipulator under et mikroskop (4 x mål linse), Placer optagelse elektrode og puff mikropipette, så tips vises i midten af billedet på skærmen ( figur 1 A).
- Justere mikroskop fokus (40 x mål linse) mens du gradvist sænke puff mikropipette og Placer det over optagelse neuron i en vinkel på 45°. Hold afstand mellem spidsen af puff mikropipette og neuron indspillet mellem 20-40 µm ( figur 1 B). Langsomt og omhyggeligt tilgang neuron med optagelse elektrode og derefter slippe den overtryk. Anvende et kort og svag sugning gennem slangen tilsluttet elektrode indehaveren til at oprette en giga-ohm sæl.
- Vedligehold spænding på 0 mV. Efter dannelsen af giga-ohm segl, kompensere for hurtig og langsom kapacitans manuelt eller automatisk. Anvend derefter en kort og kraftig sug gennem slangen nævnt ovenfor for at komme ind i hele-celle tilstand.
- Posten eIPSC i spænding-clamp tilstand. Anvende lavt gastryk (nitrogen, 4-6 psi) til puff mikropipette ved hjælp af et Picospritzer kontrolleres af en Master 8 spænding trin generator til at levere enkelte eller parret GABA pust ( figur 2).
- Ændre puff varighed for at opnå de bedste eIPSC resultater ( figur 3) og måle eIPSC i LPS-induceret depression model ( figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Puff teknik gør det muligt for forskere at studere effekten af lægemidler på bestemte receptorer på overfladen af en given neuron. I denne artikel vil fokusere vi på strømninger medieret af GABA receptorer. Figur 1 viser de puf og optagelse Mikropipetter. At fjerne nogen effekt på registrerede neuroner i det fysiske pres genereret af puff, ACSF og saccharose pust (fig. 2A) bruges som kontrol. Reaktion fremkaldt af en GABA puff (sort) kan blive blokeret af en GABA-receptor-hæmmer, som picrotoxin som rapporteret10, mens den hidtidige tilstand kan inddrives ved ACSF wash-out (blå), som vist i figur 2B. Navnlig, inducerer hverken en ACSF eller en saccharose puff en svar, tyder på, at svar induceret af GABA puffs er fysiologiske og er medieret af GABA receptorer placeret på overfladen af cellen optaget. Dosis og puff-varighed/respons-kurver er vist i figur 3.
LPS har vist sig at ændre neuronal aktiviteter og dyrs adfærd, men dens virkning på GABA receptor-medieret svar var ikke kendt. Når vi sammenligner strømninger induceret af GABA pust i hjernen skiver af LPS-indsprøjtning og køretøj kontrol mus, observerer vi betydeligt reduceret IPSC amplituder på grund af LP'ER behandling (figur 4).
Figur 1 . Diagram over puff mikropipette og optagelse elektrode.
(A) afstand mellem puff og optagelse Mikropipetter. (B) puff mikropipette (venstre) og optagelse elektrode (til højre) på overfladen af en hjerne skive. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Picrotoxin blokade af IPSC induceret af GABA puff.
(A) Puffing ACSF og saccharose (50 µM) inducerer intet svar. (B) Puffing 50 µM GABA inducerer en IPSC (sort) (puff varighed = 200 ms, 4-6 psi) i ACSF der indeholder TTX (1 µM), CNQX (20 µM) og AP5 (50 µM) at blokere handling potentialer og excitatoriske aktuelle medieret af AMPA og NMDA-receptorer. GABA-induceret IPSC er blokeret af Bad anvendelsen af en GABA-receptor hæmmer, 100 µM picrotoxin (rød). IPSC genopretter efter vask-ud af picrotoxin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Dosis og puff-varighed/respons-kurver.
(A) prøve IPSCs induceret af 10, 50 og 100 µM GABA (puff varighed = 50 ms, 4-6 psi). (B) Puff-varighed respons-kurver. Sort, n = 11; rød, n = 8; blå, n = 10; polynomium passer. Data er vist som middel til flere eksperimenter (8 ≤ n ≤11); fejllinjer angive SEM. (C) gentagne strømninger fremkaldt af GABA (50 µM) pust på Inter puff intervaller af 1, 2 eller 3 s (puff varighed = 100 ms, 4-6 psi). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . eIPSC amplitude er reduceret i LPS-indsprøjtning mus i forhold til køretøjets forskellige betjeningsapparater.
Puffing GABA inducerer en betydeligt reduceret IPSC amplitude i LPS-indsprøjtning vs kontrol neuroner (saltvand, 19.74 ± 1,93 pA/pF; LP'ER, 14.10 ± 1,30 pA/pF; p = 0,02). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stof | g/mol | Koncentration (mM) | Vægt (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26,2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glukose | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Tabel 1. Optagelse ACSF.
| Stof | g/mol | Koncentration (mM) | Vægt (g/L) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1,25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· CL | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glukose | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0,5 | 0.0555 |
Tabel 2. Skive skæring løsning.
| Stof | g/mol | Koncentration (mM) | Vægt (g/L) |
| CS gluconat | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Tabel 3. Intern løsning for hele-celle patch optagelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Puff program er almindeligt anvendt til at evaluere postsynaptiske receptor funktion3,4,7, men kræver præcis kontrol i hvert forsøg. Vi beskriver her en procedure, der omfatter hele-celle patch fastspænding, som demonstrerer GABA-puff induceret IPSCs (dvs. eIPSCs) i præfrontal kortikale hjernen skiver. Modstanden i optagelse elektrode er omkring 5 MΩ, mens puff Mikropipetter tip diameter er omkring 2-5 µm. Puff pres er mellem 4-6 psi: dette interval er kritisk, som en højere tryk kan medføre neuronal skade, mens et lavere tryk kan resultere i utilstrækkelig aktivering af de postsynaptiske GABA receptorer. Den vandrette afstand fra spidsen af puff mikropipette neuron indspillet er omkring 20-40 µm (diameter på 1-2 neuroner), og vinklen mellem puff mikropipette og skive overfladen er omkring 45°. Spidsen af puff mikropipette er lodret 20-40 µm over Skive (z-aksen). Puff varighed skal være i intervallet 10-150 ms. Under de ovennævnte omstændigheder, pust af 10-50 µM GABA fremkalde en passende neuronal svar og eIPSC amplitude og kinetiske parametre opnået er reproducerbare. Selv om protokollen beskrevet her fokuserer på puff ansøgning til en skive patch, er det også velegnet til optagelser i neuronal kulturer, som vist i vores offentliggjorte arbejde7.
Vi viser også her eIPSCs fremkommer parret puff anvendelse af GABA. Parret-puls protokoller har været meget anvendt til at evaluere præsynaptiske egenskaber7,11, men muligt postsynaptiske virkninger, såsom ændringer i neurotransmitter-receptor binding sats og bindende affinitet, som kunne påvirke parret-puls nøgletal, bestemmes ikke ved præsynaptiske parret impuls stimulation. Den protokol, der er beskrevet i denne artikel giver en måde at belyse postsynaptiske ændringer som reaktion på parrede og endda puls-tog stimuli. Reduktion i eIPSC amplitude i præfrontal cortex af LPS-indsprøjtning mus tyder på, at ændrede niveauer eller aktivitet af GABA receptorer kan ligge til grund for LPS-induceret adfærdsændringer.
Men som med de fleste drug delivery teknikker, det er vanskeligt at vide den nøjagtige GABA koncentration at nå målcellen, er det stadig muligt at fastholde koncentrationen af GABA på visse niveauer i væv ved at være i overensstemmelse med typen Mikropipetter bruges, og med parametre sådan som puff drev pres og afstand. I vores tilfælde er mængden af løsning pustede omkring 1,1 µL på 100 ms varighed. Herigennem, pustende tillader kvantitative undersøgelser udføres7,12.
Tilberedning af sund hjerne skiver fra akut præfrontal cortex er kritisk for puff optagelse procedure beskriver vi, og de følgende punkter bør tages i betragtning. Først, dissekere hjernen og adskille den præfrontale cortex hurtigt (< 1 min) og derefter holde hjernen blok i iskold skæring løsning for ikke mere end 1 min. Næste, lim stramt hjernen blok oven på præparatholderen af vibratome, eller ellers den hjerne blok kan flyde under skæring. Hastighed og hyppigheden af vibratome skal indstilles til generere endnu, sund skiver. Indsats til at gennemføre alle ovennævnte procedurer på 0-4 ° C at minimere neuronal ophidselse.
Det er værd at bemærke, at skæring løsning vi beskriver i denne artikel bør anvendes til 1-2 måned-gamle mus. For ældre mus (dvs. > 3 måneder), skæring løsning bør erstattes som beskrevet13. Puff teknik kan anvendes til en række patch-clamp forsøg med farmakologiske behandlinger, og kan også bruges til at teste effekten af lægemidler på den elektriske aktivitet i alle neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke følgende organisationer: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), videnskab og teknologi afdeling af Guangdong (2013KJCX0054), Natural Science Foundation i Guangdong provinsen ( 2014A030313418, 2014A030313440), og Guangzhou videnskab og teknologi Bureau (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
