Summary
Descriviamo la tecnica di soffio, da cui reagenti farmacologici possono essere somministrati durante la registrazione di cellule intere patch-clamp ed evidenziano vari aspetti delle caratteristiche che sono cruciali per il suo successo.
Abstract
Amministrazione farmacologica è comunemente usato quando lo svolgimento di cellule intere patch-clamp registrazione nelle fette del cervello. Uno dei migliori metodi di applicazione della droga durante la registrazione elettrofisiologica è la tecnica di soffio, che può essere utilizzata per studiare l'effetto dei reagenti farmacologici sulle attività neuronale nelle fette del cervello. Il grande vantaggio di applicazione puff è che la concentrazione di droga intorno al sito di registrazione aumenta rapidamente, impedendo così la desensibilizzazione dei recettori di membrana. Riuscito uso di applicazione di soffio comporta particolare attenzione ai seguenti elementi: la concentrazione del farmaco, i parametri della micropipetta soffio, la distanza tra la punta di una micropipetta di soffio e il neurone registrati e la durata e pressione guidando il puff (libbre per pollice quadrato, psi). Questo articolo descrive una procedura dettagliata per la registrazione di cellule intere correnti indotte da sbuffando acido gamma - aminobutirrico (GABA) su un neurone di una fetta di corticale prefrontale. In particolare, la stessa procedura può essere applicata con lievi modifiche per altre zone del cervello come l'ippocampo e lo striato e per diverse preparazioni, quali colture cellulari.
Introduction
La tecnica del patch-clamp, uno strumento primario per lo studio di segnali elettrici nei neuroni, è stata sviluppata in anni 19701,2. Dei principali vantaggi di questa tecnica è che esso fornisce conoscenza su come specifici trattamenti (ad es., farmacologico) può alterare funzioni neuronali o canali in tempo reale3. Valutazione farmacologica di funzione di un neurone durante la registrazione in una fetta di cervello cellule intere richiede l'applicazione di farmaci, come gli agonisti o antagonisti dei recettori specifici, i neuroni in fase di registrazione. Questo metodo permette l'identificazione di alterazioni neuronali che si verificano dopo l'applicazione di un farmaco specifico, portando così a una migliore comprensione delle proprietà fisiologiche e patologiche dei neuroni4. Sebbene amministrazione farmacologica possa essere condotte via sia5 o soffio di aspersione6, quest'ultima è la tecnica superiore. In particolare: (i) puff applicazione rapidamente aumenta farmaco concentrazione intorno il neurone registrato ad un livello tale che è impedita la desensibilizzazione dei recettori di membrana; (ii) il volume di droga soffiato è estremamente basso, affinché ci sia scarso effetto sulla soluzione del bagno, che pertanto riduce eventuali effetti indesiderati dei prodotti chimici amministrati su fettine di cervello; (iii) il protocollo di soffio può essere impostato e salvato, rendendo l'esperimento molto precisamente riproducibile; (iv) soffio applicazione rappresenta l'uso economico di agonisti/antagonisti, in particolare qualora tali reagenti siano costose o difficili da ottenere.
Qui, ci concentreremo sulla registrazione cellule intere correnti indotte da sbuffando GABA nelle fette del cervello acutamente preparato, una preparazione che ha il vantaggio di circuiti cerebrali relativamente ben conservato. Come conduciamo correnti inibitorie indotta da soffio7 sarà descritti in questo articolo. Utilizzando cesio (Cs+)-base di soluzioni interne e che tiene i neuroni a 0 mV, introdurremo GABA-puff evocato correnti postsinaptiche inibitorie (ampiezza) con dettagli tecnici appropriati. Utilizzando un modello murino di depressione indotta dal lipopolysaccharide (LPS) iniezione8, indichiamo che il eIPSC ampiezza evocata da un soffio di GABA è ridotta significativamente in fette di topi iniettati LPS rispetto ai comandi del veicolo. La nostra intenzione è che questo articolo dovrebbe mostrare come la tecnica di soffio è ampiamente applicabile a studi mirati a valutare l'effetto di sostanze chimiche, farmaci o composti sulle attività neuronale nelle fette del cervello.
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Protocol
e tutti gli animali sono stati condotti esperimenti secondo procedure approvate dal comitato etico per la ricerca animale presso South China Normal University, secondo le linee guida per la cura degli animali, istituito dall'Istituto nazionale di Salute.
1. preparazione di soluzioni
- preparare 500 mL di standard cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente i componenti descritti nel nostro lavoro pubblicato 7 come elencato nella tabella 1.
- Vetro pulito uso becher con acqua deionizzata per preparare una soluzione fresca di ACSF. Pulire la spatola con acqua deionizzata e asciugare prima dell'uso aggiungere NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucosio e aggiungere il CaCl 2 dopo aver fatto gorgogliare la soluzione con 95% O 2 / 5% CO 2 miscela per ~ 20 min (come descritto in dettaglio nella tabella 1) a 500 mL di acqua deionizzata. Mescolare fino a quando completamente sciolto.
- Assicurarsi la ACSF è completamente chiaro senza alcuna precipitazione. Quindi regolare il pH a 7,2-7,4. Bolla con una miscela di gas composta da 95% O 2 e 5% CO 2 per un minimo di 20 ~
- Preparare 250 mL di soluzione di taglio fetta che contiene i prodotti chimici 7 descritto in tabella 2.
- Aggiungere KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucosio e aggiungere il CaCl 2 Ultima come indicato al punto 1.1.1, 250 ml di acqua deionizzata e sciogliere come descritto in 1.1.1 e 1.1.2.
- Dopo spumeggiante con 95% O 2 / 5% CO 2, posizionare la soluzione in un congelatore per 15-20 min in modo che la soluzione di taglio diventa ghiacciata e parzialmente congelati.
Nota: Usiamo questa soluzione di taglio quando si effettuano le fette da 1-2 mese-vecchi topi; la formula può differire per topi più vecchi di 2 mesi. - Soluzione di LPS preparare sciogliendo in soluzione salina sterile privo di endotossina isotonica (0,9% NaCl). LPS è somministrato per via intraperitoneale (0,5 mg/kg) e iniziare la registrazione dopo 2 h.
2. Preparazione della fetta di corteccia prefrontale
- prendere la soluzione di taglio fuori dal freezer e omogeneizzare per ottenere una granita. Mettere la soluzione sul ghiaccio e bolla costantemente con 95% O 2 / 5% CO 2.
- Utilizzando le forbici grandi, nitide, rapidamente decapitare un mouse come descritto 9 e subito messo la testa in un becher pieno di ghiacciata (0-4 ° C) soluzione di taglio.
- Tagliare la parte superiore del cranio lungo la linea mediana in direzione caudale--nasale con forbice e rimuovere le porzioni laterale del cranio. Rimuovere il cervello con una spatola fine e goccia in soluzione di taglio ghiacciata.
Nota: Passaggi 2.2-2.3 devono essere fatto rapidamente (idealmente < 1min). - Mettere il cervello sul coperchio di una scatola Petri 9 cm riempito con ghiaccio. Sciacquare il cervello con soluzione di taglio ghiacciata. Tagliare il cervelletto e bulbo olfattivo con una lama di rasoio.
- Colla del cianoacrilato applica alla provetta titolare di un vibratomo. Posizionare con cura il blocco di cervello su goccia di colla, rostrale rivolta verso l'alto e subito immergere in soluzione di taglio ghiacciata.
- Regolare il portalama del vibratome ad un angolo di 15° con riferimento al piano orizzontale e preparare 350-µm fette coronali del cervello (frequenza di vibrazione della lama = 85 Hz, velocità = 0,1 mm/s).
- Utilizzando una pipetta, trasferire le fette nella camera di recupero riempite con ACSF, incubare per 1 h (a RT) con costante ribollimento di 95% O 2 / 5% CO 2.
3. Intero-cellula Patch registrazione
- Make vetro Micropipette di borosilicato per utilizzare come elettrodi di registrazione o soffio Micropipette secondo le linee guida specifiche del manuale di Puller. Per la registrazione di elettrodi, punta resistenze sono nel range 4-6 M Ω, mentre soffio Micropipette hanno diametri di punta nella gamma 2-5 µm.
- Aggiungere stampo della scanalatura del Na + (TTX, 1 µM), blocco veloce Na + canale e quindi i potenziali di azione, a ACSF e mantenere una portata costante di questa soluzione di 2-3 mL/min in camera di registrazione, di pompa peristaltica nella camera e aspirazione fuori di esso. Bubble ACSF con 95% O 2 / 5% CO 2 costantemente per garantire la redditività delle fette.
- Trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione utilizzando una pipetta Pasteur modificata cui punta fine è stato tagliato per adattarsi alle dimensioni della fetta. Coprire la fetta con un ancoraggio di platino fetta con fili di nylon paralleli distanziati ≥ distanziate per contenere la fetta sulla piattaforma di 2 mm.
- Riempire la micropipetta di registrazione con soluzione interna 7 (tabella 3) e riempire le micropipette puff con GABA a 10 µM, 50 µM e 100 µM (disciolto in ACSF) o ACSF come controllo del veicolo.
- Per prevenire l'occlusione con detriti, applicare una leggera pressione positiva utilizzando una siringa da 1 mL prima di immergere l'elettrodo di registrazione nel ACSF. Utilizzando un micromanipolatore sotto un microscopio (4 x lente dell'obiettivo), posizionare la micropipetta di elettrodo e puff di registrazione in modo che le punte appaiono al centro dell'immagine video nel monitor ( Figura 1 A).
- Regolare il fuoco del microscopio (obiettivo obiettivo di 40 x) riducendo gradualmente la micropipetta puff e posizionarlo sopra il neurone di registrazione ad un angolo di 45°. Mantenere la distanza tra la punta della micropipetta soffio e il neurone registrate tra 20-40 µm ( Figura 1 B). Il neurone con l'elettrodo di registrazione si avvicinano lentamente e con attenzione e poi rilasciare la pressione positiva. Applicare una debole e breve di aspirazione attraverso il tubo collegato alla pinza porta elettrodo per creare un sigillo di giga-ohm.
- Mantenere la tensione a 0 mV. Dopo la formazione del sigillo giga-ohm, compensare per una rapida e lenta capacità manualmente o automaticamente. Quindi applicare un breve e forte aspirazione attraverso il tubo di cui sopra per entrare nel modo della intero-cellula. Modalità di
- record eIPSC in tensione-morsetto. Applicare la bassa pressione del gas (azoto, 4-6 psi) alla micropipetta puff utilizzando un Picospritzer controllato da un generatore di Master 8 tensione passo per fornire singolo o accoppiato GABA soffi ( Figura 2).
- Modificare la durata del soffio per ottenere i migliori risultati di eIPSC ( Figura 3) e misurare la eIPSC nel modello di depressione indotta da LPS ( Figura 4).
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Representative Results
La tecnica di soffio consente ai ricercatori di studiare l'effetto di droghe, in particolari recettori sulla superficie di un dato neurone. In questo articolo, ci concentriamo su correnti mediate da recettori GABA. La figura 1 Mostra le micropipette puff e registrazione. Per eliminare qualsiasi effetto sui neuroni registrati della pressione fisica generata da Sfoglia, ACSF e soffi di saccarosio (Figura 2A) vengono utilizzati come controlli. La risposta indotta da un soffio di GABA (nero) può essere bloccata da un inibitore del recettore GABA, come picrotoxin come segnalato10, mentre la condizione di base possa essere recuperata da ACSF wash-out (blu), come illustrato nella Figura 2B. In particolare, né un ACSF né un soffio di saccarosio induce una risposta, suggerendo che le risposte indotte da sbuffi di GABA sono fisiologiche e sono mediate da recettori GABA che si trova sulla superficie della cellula registrata. Le curve di risposta dose e puff-durata sono illustrate nella Figura 3.
LPS è stato indicato per alterare l'attività neuronale e comportamento animale, ma il suo effetto sulle risposte di recettore GABA non era ben noto. Quando confrontiamo correnti indotte da sbuffi di GABA in fettine di cervello di LPS-iniettato e topi di controllo del veicolo, osserviamo ampiezze IPSC significativamente ridotte a causa di trattamento LPS (Figura 4).
Figura 1 . Diagramma dell'elettrodo puff micropipetta e registrazione.
(A) la distanza tra il soffio e la registrazione micropipette. (B) la micropipetta puff (a sinistra) e l'elettrodo di registrazione (a destra) sulla superficie di una fetta di cervello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Blocco di picrotoxin di IPSC indotta dal soffio di GABA.
(A) ACSF sbuffando e saccarosio (50 µM) non induce alcuna risposta. (B) sbuffando 50 µM GABA induce un IPSC (nero) (durata del soffio = 200 ms, 4-6 psi) in ACSF contenente TTX (1 µM), CNQX (20 µM) e AP5 (50 µM) per bloccare potenziali d'azione e corrente eccitatoria mediata dai recettori AMPA e NMDA. L'IPSC GABA-indotta è bloccata da bagno applicazione di un inibitore del recettore GABA, 100 picrotoxin µM (rosso). IPSC recupera dopo wash-out di picrotoxin. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Curve di risposta dose e puff-durata.
(A) campione IPSCs indotta da 10, 50 e 100 µM GABA (durata del soffio = 50 ms, 4-6 psi). Curve di risposta Puff-durata (B) . Nero, n = 11; rosso, n = 8; blu, n = 10; polinomio in forma. I dati sono mostrati come mezzo di esperimenti multipli (8 ≤ n ≤11); barre di errore indicano correnti ripetitive SEM. (C) evocate da GABA (50 µM) soffi a intervalli Inter-soffio di s 1, 2 o 3 (durata del soffio = 100 ms, 4-6 psi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . eIPSC ampiezza è ridotto in topi LPS-iniettato rispetto ai comandi del veicolo.
Sbuffando GABA induce una significativamente ridotta ampiezza IPSC in LPS-iniettato vs neuroni di controllo (saline, pF/19.74 ± 1.93 pA; LPS, 14.10 ± 1,30 pA/pF; p = 0,02). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sostanza | g/mol | Concentrazione (mM) | Peso (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26,2 | 2,2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glucosio | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Tabella 1. Registrazione ACSF.
| Sostanza | g/mol | Concentrazione (mM) | Peso (g/L) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· CL | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glucosio | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0,5 | 0,0555 |
Tabella 2. Soluzione di taglio della fetta.
| Sostanza | g/mol | Concentrazione (mM) | Peso (g/L) |
| Gluconato di CS | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Tabella 3. Soluzione interna per le registrazioni della intero-cellula patch.
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Discussion
Applicazione di soffio viene ampiamente utilizzata per valutare il recettore postsinaptico funzione3,4,7, ma richiede un controllo preciso in ogni esperimento. Descriviamo qui una procedura che coinvolge cellule intere patch di bloccaggio, che dimostra che GABA-puff indotto IPSCs (cioè, ampiezza) nelle fette del cervello corticale prefrontale. La resistenza dell'elettrodo di registrazione è MΩ circa 5, mentre il diametro della punta di micropipette puff è di circa 2-5 µm. Puff pressione è tra 4-6 psi: questa gamma è critica, come una pressione superiore può causare danno neuronale, mentre una pressione più bassa può causare insufficiente attivazione dei recettori GABA postsinaptici. La distanza orizzontale tra la punta della micropipetta soffio per il neurone registrato è circa 20-40 µm (il diametro di 1-2 neuroni) e l'angolo tra la superficie di una micropipetta e fetta di soffio è di circa 45°. La punta della micropipetta soffio è verticalmente il 20-40 µm sopra la fetta (asse z). La durata del soffio deve essere nel range 10-150 ms. le circostanze sopra, soffi di 10-50 µM GABA inducono una risposta adeguata di un neurone e l'ampiezza di eIPSC e parametri cinetici ottenuti sono riproducibili. Sebbene il protocollo qui descritto si concentra sull'applicazione di soffio di una patch di fetta, è anche adatto per registrazioni in colture neuronali, come mostrato nel nostro lavoro pubblicato7.
Indichiamo anche qui ampiezza risultante dall'applicazione di accoppiato-soffio di GABA. Protocolli di accoppiare-impulso sono stati ampiamente utilizzati per valutare le proprietà presinaptica7,11, ma possibili effetti postsinaptici, quali i cambiamenti nel neurotrasmettitore-recettore tasso e associazione affinità di legame, che potrebbe influenzare rapporti di accoppiare-impulso, non può essere determinato dalla stimolazione presinaptica di accoppiare-impulso. Il protocollo descritto in questo articolo fornisce un modo per delucidare postsinaptiche alterazioni nella risposta agli stimoli accoppiati tra loro e anche a treno di impulsi. La riduzione in ampiezza di eIPSC nella corteccia prefrontale di topi iniettati LPS suggerisce che livelli alterati o attività dei ricevitori di GABA potrebbe essere alla base LPS indotto cambiamenti comportamentali.
Anche se, come con la maggior parte delle tecniche di consegna di droga, è difficile sapere l'esatta concentrazione di GABA raggiungendo la cella di destinazione, è ancora possibile mantenere la concentrazione di GABA a certi livelli nel tessuto da essere coerente con il tipo di Micropipette utilizzato, e con tali parametri come puff pressione di azionamento e distanza. Nel nostro caso, il volume di soluzione soffiato è circa 1,1 µ l a 100 ms di durata. Quindi, sbuffando permette studi quantitativi essere eseguiti7,12.
La preparazione di fettine di cervello sano dalla corteccia prefrontale acuta è critica per il soffio di registrazione procedura Descriviamo, e i seguenti punti da tener in mente. In primo luogo, sezionare il cervello e separare rapidamente la corteccia prefrontale (< 1 min) e poi mantenere il blocco di cervello in soluzione di taglio ghiacciata per non più di 1 min. Poi, colla strettamente il blocco di cervello sopra il portacampioni del vibratome, o altrimenti il blocco del cervello può galleggiare durante il sezionamento. La velocità e la frequenza del vibratome deve essere impostate anche, generare sani fette. Sforzo deve essere fatto per condurre tutti di sopra delle procedure a 0-4 ° C per ridurre al minimo l'eccitabilità neuronale.
Vale la pena notare che la soluzione di taglio descriviamo in questo articolo dovrebbe essere usata per 1-2 mese-vecchi topi. Per i più vecchi topi (cioè > 3 mesi), la soluzione di taglio dovrebbe essere sostituita come descritto13. La tecnica di soffio è applicabile ad una serie di esperimenti di patch-clamp su trattamenti farmacologici e può essere utilizzata anche per testare l'effetto dei farmaci sull'attività elettrica di qualsiasi neuroni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare le seguenti organizzazioni: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), scienza e tecnologia divisione di Guangdong (2013KJCX0054), la Fondazione di scienze naturali della provincia di Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), Guangzhou scienza e tecnologia Bureau (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
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