Summary
Мы описываем слоеного технику, в которой может осуществляться во время записи поклеточного патч зажим фармакологических реагентов и выделить различные аспекты функций, которые имеют решающее значение для его успеха.
Abstract
Фармакологических администрация обычно используется при проведении поклеточного патч зажим запись в срезах головного мозга. Один из лучших методов применения препарата во время электрофизиологических записи является метод слоеного, который может использоваться для изучения влияния фармакологических реагентов на нейрональных деятельности в срезах головного мозга. Самое главное преимущество слоеного приложения является, что концентрации препарата вокруг сайта записи увеличивается быстро, таким образом предотвращая десенсибилизации мембранных рецепторов. Успешное использование слоеного приложения включает в себя пристальное внимание на следующие элементы: концентрация препарата, параметры слоеного микропипеткой, расстояние между кончиком микропипеткой слоеного и Записанная нейрон и продолжительность и вождения слоеные давления (фунтов на квадратный дюйм, psi). Эта статья описывает пошаговые процедуры для записи поклеточного течения индуцированных пыхтя гамма - аминомасляная кислота (ГАМК) на нейрон ломтиком префронтальной коры головного мозга. В частности та же процедура может применяться с незначительными изменениями в других областях мозга, таких как гиппокамп и Полосатое тело и различные препараты, такие как клеточных культур.
Introduction
Патч зажим технику, основным инструментом для исследования электрических сигналов в нейронах, был разработан в 1970-х1,2. Основным преимуществом этого метода является, что она предоставляет знания о как конкретные процедуры (например, фармакологической) может изменить функции нейронов или каналов в реальном времени3. Фармакологических оценки нейрональных функции во время поклеточного запись в срез мозга требует применения препаратов, таких как агонисты и антагонисты специфических рецепторов, записывается нейронов. Этот метод позволяет выявлять нейрональных изменений, которые происходят после применения конкретного препарата, что приводит к более глубокому пониманию физиологических и патологических свойства нейронов4. Хотя фармакологических администрация может проводиться через либо перфузии5 или слоеного6, последний является превосходной техникой. В частности: (i) слоеного приложения быстро увеличивается наркотиков концентрацию вокруг записанные нейрона до уровня таким образом, чтобы предотвратить десенсибилизации мембранных рецепторов; (ii) объем наркотиков пыхтел крайне низка, так что есть мало влияет на раствор для ванн, который таким образом уменьшает любые нежелательные эффекты химических веществ, управляемых на срезах головного мозга; (iii) протокола слоеного можно задать и сохранить, делая эксперимента очень точно воспроизводимый; (iv) слоеного приложения представляет собой экономичное использование агонистов/антагонистов, особенно когда такие реагенты дорогих или трудно получить.
Здесь мы сосредоточимся на запись поклеточного течения индуцированных пыхтя ГАМК в прекрасно подготовленных мозга ломтиками, препарат, который имеет преимущество относительно хорошо сохранились мозга цепей. В этой статье будут описаны как мы проводим слоеного индуцированной ингибирующее течений7 . С помощью цезий (Cs+)-на основе внутреннего решения и проведение нейронов в 0 mV, мы будем вводить ГАМК слоеного вызывали тормозной постсинаптический токов (eIPSCs) с соответствующие технические детали. С помощью мыши модели депрессии, вызванных инъекции липополисахарида (LPS)8, мы показывают, что eIPSC амплитуды, вызываемые ГАМК слоеного значительно уменьшается в ломтики LPS-вводят мышей, по сравнению с контроля автотранспортных средств. Наше намерение заключается, что эта статья должна показать как слоеного техника широко применяется к исследования, направленные на оценку воздействия любых химических веществ, соединений или наркотиков на нейрональных деятельности в срезах головного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животных и всех животных, которые эксперименты были проведены в соответствии с процедурами, одобренный Комитетом по этике для исследований на животных в Южный Китай педагогическом университете, согласно руководящим принципам для животных уход, создан Национальный институт Здоровье.
1. Подготовка решения
- подготовить 500 мл стандартной искусственной спинномозговой жидкости (ФАГО), содержащий компоненты, описанные в нашей опубликовал работу 7, перечисленных в таблице 1.
- Использования чистого стекла стаканы с дейонизированной водой готовить свежий раствор фаго. Шпатели с дейонизированной водой чистой и сухой перед использованием для добавления NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-глюкоза и добавить CaCl 2 после кипела решение с 95% O 2 / 5% CO 2 смесь для ~ 20 мин (как подробно указано в таблице 1) до 500 мл деионизованной воды. Размешайте до полного растворения.
- Обеспечить фаго совершенно ясно без каких-либо осадков. Затем отрегулируйте pH 7,2-7.4. Пузырь с газовой смеси состоит из 95% O 2 и 5% CO 2 на ~ 20 мин
- Подготовить 250 мл ломтик резки раствора, содержащего химических веществ 7, описанные в таблице 2.
- Добавить KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-глюкозы и добавить CaCl 2 последний, как указано в подпунктах 1.1.1, до 250 мл деионизированной воды и растворяются, как описано в разделе 1.1.1 и 1.1.2.
- После восходящей с 95% O 2 / 5% CO 2, поместите решение в морозильник на 15-20 мин, так что становится решение резки ледяной и частично замороженных.
Примечание: Мы используем это решение резки при принятии фрагментов от 1-2 месяца-старых мышей; Формула может отличаться для мышей, старше 2 мес. - Решение подготовить LPS, растворяя в стерильных бесплатно эндотоксина изотонический солевой раствор (0,9% NaCl). LPS администрируется внутрибрюшинно (0,5 мг/кг) и начать запись позднее 2 ч.
2. Подготовка префронтальной коры срез
- взять решение резки из морозильника и гомогенизации получить слякоть. Поместите решение на льду и пузырь постоянно с 95% O 2 / 5% CO 2.
- С использованием больших, острые ножницы, быстро обезглавить мыши как описано 9 и немедленно положить голову в стакан, наполненный ледяной (0-4 ° C) резки решения.
- Вырезать в верхней части черепа вдоль средней линии в направлении хвостового носа с тонкой ножницами и удалить части боковых черепа. Удаление мозга с помощью тонкой шпателя и падение в ледяной резки раствор.
Примечание: Шаги 2.2-2.3 должно быть сделано быстро (в идеале < 1 мин). - Место мозга на крышке 9 см Петри, заполненный льдом. Промывайте мозг с ледяной резки решения. Отрезать мозжечка и обонятельные луковицы с лезвием бритвы. Держатель
- Применить Цианакрилатный клей для образца vibratome. Осторожно поместите блок мозга на каплю клея, Ростральные стороной вверх и немедленно погружают в ледяные резки решения.
- Настроить держатель лезвия vibratome под углом 15° со ссылкой на горизонтальной плоскости и подготовить 350 мкм мозга корональные срезы (частота вибрации лезвие = 85 Гц, скорость = 0,1 мм/сек).
- С помощью пипетки, передачи, ломтики в камеру восстановления заполнены с фаго, инкубировать 1 час (на RT) с постоянным восходящей 95% O 2 / 5% CO 2.
3. Поклеточного патч запись
- сделать Стекло боросиликатное micropipettes для использования в качестве записи электродов или слоеного micropipettes согласно конкретные руководящие указания в руководстве по эксплуатации съемник. Для записи электродов, Совет сопротивления находятся в диапазоне от 4-6 М Ω, в то время как слоеного micropipettes имеют диаметр кончика в диапазоне 2-5 мкм.
- Добавить Na + канала блокатор (TTX, 1 мкм), блок быстро Na + канала и, таким образом, потенциалы действия, чтобы фаго и поддерживать постоянной скорости потока этого решения 2-3 мл/мин в зале записи Перистальтический насос в камеру и стремление из него. Пузырь фаго с 95% O 2 / 5% CO 2 постоянно для обеспечения жизнеспособности ломтиков.
- Передача ломтиком мозга в записи камеру с помощью модифицированных пипетки Пастера чьи штрафа отзыв был сокращен до размеров фрагмента. Накрыть срез с якорем Платиновый ломтик расположенных параллельно Нейлоновая нить ≥ 2 мм друг от друга провести срез на платформе.
- Заполнить микропипеткой записи с внутреннего решения 7 (Таблица 3) и заполнить слойка micropipettes с ГАМК в 10 мкм, 50 мкм и 100 мкм (растворяют в фаго) или фаго как транспортное средство управления.
- Для предотвращения засорения с мусором, применять легких под положительным давлением, с использованием 1 мл шприц перед погружением записи электрод в фаго. С помощью микроманипулятор под микроскопом (4 x объектив), позиция записи электрода и слоеного микропипеткой, так, что советы появляются в центре изображения на мониторе ( рис. 1 A).
- Настройка фокусировки микроскопа (40 x объектив) постепенно снижая микропипеткой слоеного и поместите его выше запись нейрона под углом 45 °. Держите расстояние между кончиком микропипеткой слоеного и нейрон, записанная между 20-40 мкм ( рис. 1 Б). Медленно и осторожно подходить к нейрона с электродом записи и затем отпустите положительным давлением. Применить слабых и краткий всасывания через трубку, подключенных к Электрододержатель для создания гига ом печать.
- Поддерживать напряжение на 0 mV. После формирования уплотнения гига ом компенсировать быстро и медленно емкость вручную или автоматически. Затем применить краткий и сильного всасывания через трубку, упомянутых выше, чтобы попасть в режим поклеточного.
- Запись eIPSC в мембраной режим. Применить давление низкое газа (азот, 4-6 psi) для слоеного микропипеткой, с помощью Picospritzer, контролируемых 8 мастер Генератор напряжения шаг для доставки одного или парные ГАМК затяжек ( рис. 2).
- Изменить длительность слоеного для получения лучших результатов eIPSC ( рис. 3) и измерения eIPSC в депрессии, LPS-индуцированной модели ( рис. 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Слойка техника позволяет исследователям изучить влияние наркотиков на конкретной рецепторами на поверхности данного нейрона. В этой статье мы ориентируемся на токи при посредничестве приемные устройства GABA. Рисунок 1 показывает слоеного и записи micropipettes. Для устранения влияния на записанные нейронов физического давления, порожденных слоеного, фаго и сахароза затяжек (рисA) используются в качестве элементов управления. Ответ, вызванных ГАМК слоеного (черный) может быть заблокирован ингибитор ГАМК рецепторов, такие picrotoxin как сообщили10, в то время как базового условие может быть восстановлен путем вымывания Фаго (синий), как показано на рисунке 2B. Примечательно фаго ни слоеного сахароза вызывает ответ, предполагая, что ответы, вызванных ГАМК затяжек физиологические и посредничестве ГАМК-рецепторов, расположенных на поверхности записанные ячейки. Доза и продолжительность слоеного ответ кривых показано на рисунке 3.
LPS было показано изменение нейрональных деятельность и поведение животных, но ее влияние на ГАМК рецептор опосредованный ответов не было хорошо известно. Когда сравнивать течения индуцированных транспортного средства управления мышей и пуфы ГАМК в мозг ломтики ПЛАСТИНКИ вставлен мы наблюдаем значительное уменьшение амплитуд IPSC связи LPS лечения (рис. 4).
Рисунок 1 . Диаграмма слоеного записи и микропипеткой электрода.
(A) расстояние между слоеного и записи micropipettes. (B) слоеного микропипеткой (слева) и запись электрода (справа) на поверхности среза головного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Picrotoxin блокада IPSC, вызванных слоеного ГАМК.
(A) пыхтя фаго и сахарозы (50 мкм) индуцирует никакого ответа. (B) пыхтя 50 мкм ГАМК индуцирует IPSC (черный) (слоеного длительность = 200 мс, 4-6 psi) в фаго, содержащих TTX (1 мкм), CNQX (20 мкм) и AP5 (50 мкм) для блокирования потенциалы действия и возбуждающих ток при посредничестве АМПА и NMDA рецепторы. ГАМК индуцированной IPSC заблокирован Ванна применение ингибитора рецепторов ГАМК, 100 мкм picrotoxin (красный). ЦУИС восстанавливается после вымывания из picrotoxin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Доза и продолжительность слоеного ответ кривых.
(A) образец IPSCs индуцированных 10, 50 и 100 мкм ГАМК (слоеного длительность = 50 мс, 4-6 psi). (B) слоеного продолжительность ответ кривых. Черный, n = 11; красный, n = 8; синий, n = 10; Полином подходят. Данные отображаются в виде средства нескольких экспериментов (8 ≤ n ≤11); планки погрешностей указывают SEM. (C) повторяющихся течения, вызванные ГАМК (50 мкм) затяжек интервалом между слоеного 1, 2 или 3 s (слоеного длительность = 100 мс, 4-6 psi). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . в LPS-вводят мышей, по сравнению с контроля автотранспортных средств снижается амплитуда eIPSC.
Пыхтя ГАМК вызывает значительное уменьшение амплитуды IPSC в LPS-инъекции против управления нейронов (солевой раствор, ПА 19,74 ± 1,93/pF; LPS, 14.10 ± 1.30 Па/pF; p = 0.02). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Вещество | г/моль | Концентрация (мм) | Вес (г/Л) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| ДКК | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26,2 | 2,2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-глюкоза | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Таблица 1. Запись фаго.
| Вещество | г/моль | Концентрация (мм) | Вес (г/Л) |
| ДКК | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| 2 MgCl | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· CL | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-глюкоза | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0.5 | 0.0555 |
Таблица 2. Ломтик резки решения.
| Вещество | г/моль | Концентрация (мм) | Вес (г/Л) |
| CS-глюконат | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| 2 MgCl | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Таблица 3. Внутреннее решение для записи поклеточного патч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Слойка приложение широко используется для оценки постсинаптических рецепторов функция3,4,7, но требует точного управления в каждом эксперименте. Мы опишем здесь процедура поклеточного патч зажима, который демонстрирует, что ГАМК слоеного наведено IPSCs (т.е. eIPSCs) в префронтальной коры мозга ломтиками. Сопротивление записи электрода около 5 MΩ, хотя диаметр кончика слоеного micropipettes составляет около 2-5 мкм. слоеного давление от 4-6 psi: этот диапазон является критическим, как более высокое давление может повредить нейронов, в то время как более низкое давление может привести к Недостаточная активация постсинаптических рецепторов ГАМК. Расстояние по горизонтали от кончика слоеного микропипеткой нейрон Записанная идет о 20-40 мкм (диаметр 1-2 нейроны) и угол между слоеного микропипеткой и срез поверхности находится около 45°. Кончик слоеного микропипеткой является вертикально 20-40 мкм выше среза (ось z). Слойка продолжительность должна быть в пределах 10-150 г-жа выше обстоятельствах, пуфы 10-50 мкм ГАМК вызвать соответствующий ответ нейронов и eIPSC амплитуды и получены кинетические параметры воспроизводимого. Хотя Протокол описан здесь фокусируется на слоеное приложения к ломтик патч, это также подходит для записей в нейрональных культур, как показано в нашей опубликованные работы7.
Мы также показываем здесь eIPSCs, результатом применения паре слоеного ГАМК. В паре пульс протоколы широко использовались для оценки Пресинаптический свойства7,11, но возможно постсинаптических эффекты, такие как изменения в рецептор нейротрансмиттера скорость и привязки сродство, которые могут повлиять на соотношения в паре пульс, не может определяться Пресинаптический паре импульса стимуляции. Протокол, описанные в этой статье предоставляет способ для выяснения постсинаптических изменения в ответ на раздражители парных и даже импульсов. Снижение амплитуды eIPSC в префронтальной коре LPS-вводят мышей предполагает, что изменены уровни или активность ГАМК-рецепторов может лежать в основе LPS-индуцированные изменения в поведении.
Несмотря на то, как с большинством методов доставки наркотиков, трудно знать точные концентрации ГАМК, достигнув целевую ячейку, это еще возможно сохранить концентрацию ГАМК на определенных уровнях в ткани, будучи в соответствии с типом micropipettes используется, и с параметрами, такими как слоеного привод давление и расстояния. В нашем случае объем раствора пыхтел составляет около 1.1 µL 100 мс продолжительность. Таким образом пыхтя позволяет количественные исследования будет выполняться7,12.
Подготовка фрагментов здорового мозга от острого префронтальной коры имеет решающее значение для слоеного записи процедуры мы описываем, и следует учитывать следующие моменты. Во-первых, вскрыть мозга и быстро отделить префронтальной коры (< 1 мин) и затем сохранить блок мозга в ледяной резки решение для не более 1 мин. Далее, плотно клей блока мозга на вершине держатель образца vibratome, или в противном случае блок мозга может плавать при резании. Скорость и частота vibratome должно быть присвоено даже, создания здоровой ломтиками. Необходимо приложить проводить все выше процедуры на 0-4 ° C для сведения к минимуму возбудимости нейронов.
Стоит отметить, что решение резки, мы расскажем в этой статье следует использовать для 1-2 месяца-старых мышей. Для старых мышей (т.е. > 3 месяца), режущего раствора следует заменить как описано13. Слойка техника применима к ряду патч зажим экспериментов с участием фармакологических препаратов и может также использоваться для проверки эффекта препаратов на электрическую активность любой нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить следующих организаций: национальные естественные науки фонд Китая (31171018, 31171355), Наука и технологии Отдела Гуандун (2013KJCX0054), фонд естественных наук из провинции Гуандун ( 2014A030313418, 2014A030313440), Гуанчжоу науки и технологического бюро (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
