Summary
Vi beskriva puff tekniken, vilket farmakologiska reagenser kan administreras under hela-cell patch-clamp inspelning och belysa olika aspekter av de funktioner som är avgörande för dess framgång.
Abstract
Farmakologiska administration används ofta när de utför hela-cell patch-clamp inspelning i hjärnan skivor. En av de bästa metoderna för läkemedel ansökan under elektrofysiologiska inspelning är puff tekniken, som kan användas för att studera effekten av farmakologisk reagens på neuronala aktiviteter i hjärnan skivor. Den största fördelen med puff ansökan är att drogen koncentrationen runt på inspelning webbplats ökar snabbt, vilket förhindrar Desensibilisering av membranreceptorer. Framgångsrik användning av puff ansökan innebär noggrann uppmärksamhet på följande element: koncentrationen av drogen, parametrar för den puff mikropipett, avståndet mellan spetsen på en puff mikropipett och neuron registreras och varaktighet och Tryck körning puff (pounds per kvadrattum, psi). Denna artikel beskriver en stegvis procedur för att registrera hela-cell strömmar induceras av pustande gamma - aminosmörsyra (GABA) på en neuron prefrontala kortikala bitens. Särskilt, kan samma förfarande tillämpas med smärre ändringar till andra områden i hjärnan som hippocampus och striatum och olika preparat, såsom cellkulturer.
Introduction
Patch-clamp tekniken, en primära verktyg för att undersöka elektriska signaler i nervceller, utvecklades på 1970-talet1,2. En stor fördel med denna teknik är att det ger kunskap om hur specifika behandlingar (t.ex. farmakologiska) kan förändra neuronala funktioner eller kanaler i realtid3. Farmakologiska utvärdering av nervcellernas funktion under hela-cell inspelning i en hjärna bit kräver tillämpning av läkemedel, såsom agonister eller antagonister av specifika receptorer, på nervceller som spelas in. Denna metod möjliggör identifiering av neuronala förändringar som sker efter ansökan av ett specifikt läkemedel, vilket leder till en bättre förståelse av fysiologiska och patologiska egenskaperna av nervceller4. Även farmakologiska administration kan genomföras via antingen perfusion5 eller puff6, är den senare den överlägsna tekniken. I synnerhet: (i) puff ansökan snabbt ökar drog koncentration runt inspelade neuron till en nivå så att Desensibilisering av membranreceptorer är förhindrade. (ii) volymen av drogen svälld är extremt låg, så att det finns liten effekt på bad lösningen, vilket således minskar eventuella oönskade effekter av de administrerade kemikalierna på hjärnan skivor; (iii) protokollet puff kan ställa och sparas, vilket gör experimentet mycket exakt reproducerbara; (iv) puff ansökan representerar ekonomisk användning av agonister/antagonister, särskilt där sådant reagens är dyrt eller svårt att få.
Här fokuserar vi på inspelningen hela-cell strömmar induceras av pustande GABA i akut beredda hjärnan skivor, ett preparat som har fördelen av relativt välbevarad hjärnan kretsar. Hur vi bedriver puff-inducerad hämmande strömmar7 beskrivs i denna artikel. Med hjälp av cesium (Cs+)-baserade interna lösningar, och hålla nervceller vid 0 mV, kommer vi att införa GABA-puff frammanade hämmande postsynaptiska strömmar (eIPSCs) med lämpliga tekniska detaljer. Med hjälp av en musmodell av depression som induceras av lipopolysackarid (LPS) injektion8, vi visar att eIPSC minskas amplitud framkallat av en GABA-puff avsevärt i skivor av LPS-injiceras möss jämfört med fordonets reglage. Vår avsikt är att denna artikel bör visa hur den puff-tekniken är allmänt tillämpliga på studier syftar till att utvärdera effekten av kemikalier, föreningar eller droger på neuronala aktiviteter i hjärnan skivor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstallar och alla djur experiment genomfördes i enlighet med förfaranden som godkänts av den etiska kommittén för djurförsök på South China Normal University, enligt riktlinjerna för Animal Care fastställts av National Institute of Hälsa.
1. beredning av lösningar
- förbereda 500 mL standard konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) som innehåller de komponenter som beskrivs i våra publicerade arbete 7 som anges i tabell 1.
- Använd rent glas bägare med avjoniserat vatten för att förbereda en ny ACSF lösning. Rengör spatlar med avjoniserat vatten och torka innan du använder lägga till NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glukos, och tillsätt den CaCl 2 efter att ha bubblade lösningen med 95% O 2 / 5% CO 2 blandning för ~ 20 min (som beskrivs i tabell 1) till 500 mL avjoniserat vatten. Rör tills fullt upplöst.
- Se till ACSF är helt klart utan någon nederbörd. Sedan justera pH-värdet till 7,2-7,4. Bubbla med en gasblandning som består av 95% O 2 och 5% CO 2 för ~ 20 min.
- Bereda 250 mL slice skärande lösning som innehåller de kemikalier 7 beskrivs i tabell 2.
- Lägg KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgCl 2, choline·Cl, D-glukos och tillsätt den CaCl 2 senast som anges i 1.1.1, till 250 mL avjoniserat vatten och lös som beskrivs i 1.1.1 och 1.1.2.
- Efter bubblande med 95% O 2 / 5% CO 2, placera lösningen i en frys för 15-20 min så att skärande lösningen blir iskall och delvis frysta.
Obs: Vi använder skärande lösningen när du gör skivor från 1-2 månad-gamla möss; formeln kan variera för möss som är äldre än 2 månader. - Förbereda LPS lösning genom upplösning i sterila endotoxinfria isoton saltlösning (0,9% NaCl). LPS administreras intraperitonealt (0,5 mg/kg) och börja spela in 2 h senare.
2. Beredning av prefrontala Cortex Slice
- ta skärande lösningen ur frysen och homogenisera för att erhålla en slush. Placera lösningen på isen och bubbla ständigt med 95% O 2 / 5% CO 2.
- Med stora, vassa saxar, snabbt halshugga en mus som beskrivs 9 och omedelbart sätta huvudet till en bägare fylld med iskall (0-4 ° C) skära lösning.
- Skär toppen av skallen längs mittlinjen i en caudal-till-nasala riktning med fina sax och ta bort de laterala skallbasen delarna. Ta bort hjärnan med en fin spatel och släpp till iskall skärande lösning.
Obs: Steg 2.2-2.3 måste göras snabbt (idealiskt < 1 min). - Placera hjärnan på locket till en 9 cm petriskål fylld med is. Skölj hjärnan med iskall skärande lösningen. Avbröt i lillhjärnan och luktbulben med ett rakblad.
- Tillämpa cyanoakrylat lim med förlagan innehavare av en vibratome. Noggrant placera blocket hjärnan på droppen lim, rostralt sida upp, och omedelbart fördjupa i iskall skärande lösningen.
- Justera bladhållaren av vibratome till en vinkel på 15° med hänvisning till horisontalplanet och förbereda 350 µm koronalt hjärnan skivor (blad vibrationer frekvens = 85 Hz, hastighet = 0,1 mm/s).
- Med pipett överföring skivor in i recovery kammaren fylld med ACSF, inkubera i 1 h (på RT) med konstant bubblande 95% O 2 / 5% CO 2.
3. Hela-cell Patch inspelning
- göra glas Borsilikat Mikropipetter för använda som inspelning elektroder eller puff Mikropipetter enligt de särskilda riktlinjerna i avdragare användarhandboken. För inspelning av elektroder, tip motstånd är i intervallet 4-6 M Ω, medan puff Mikropipetter har tip diametrar i intervallet 2-5 µm.
- Lägga till Na + kanal blockerare (TTX, 1 µM), block snabb Na + kanal och därmed handlingspänningar, till ACSF och upprätthålla ett konstant flöde av denna lösning av 2-3 mL/min i inspelning kammaren, genom peristaltiska pumpen in i kammaren och aspiration ur den. Bubbla ACSF med 95% O 2 / 5% CO 2 ständigt för att säkerställa lönsamhet i skivor.
- Överför en hjärna skiva in i inspelningen kammaren använder en modifierad Pasteur-pipett vars fina spets sänktes till det slice storlek. Täck på segmentet med ett platina skiva ankare med parallella nylontrådar fördelade ≥ 2 mm från varandra att hålla segmentet på plattformen.
- Fyller den inspelning mikropipett med intern lösning 7 (tabell 3) och fylla de puff Mikropipetter med GABA på 10 µM, 50 µM, och 100 µM (upplöst i ACSF) eller ACSF som fordonskontroll.
- Att förhindra blockering med skräp, applicera lätt positiv tryck med en 1 mL spruta innan nedsänkning inspelning elektroden i ACSF. Med hjälp av en micromanipulator under ett mikroskop (4 x objektiv), placera den inspelning elektrod och puff mikropipett så att tips visas i mitten av videobilden på bildskärmen ( figur 1 A).
- Justera Mikroskop fokus (40 x objektiv) samtidigt gradvis sänka den puff mikropipett och placera den ovan inspelning neuron i 45° vinkel. Hålla avståndet mellan spetsen på den puff mikropipett och neuron inspelade mellan 20-40 µm ( figur 1 B). Långsamt och försiktigt närma neuron med inspelning elektroden och släpp sedan realiteten pressar. Tillämpa en svag och kort sugning genom slangen ansluten till elektrodhållare att skapa en giga ohm tätning.
- Underhåll spänningen vid 0 mV. Efter bildandet av giga ohm tätningen, kompensera för snabb och långsam kapacitans manuellt eller automatiskt. Applicera sedan en kort och stark sug genom slangen nämns ovan komma in hela-cell läge.
- Post eIPSC i spänning-clamp-läge. Gälla den puff mikropipett med hjälp av en Picospritzer som styrs av en Master 8 spänningen steg generator för att leverera enstaka eller parkopplade GABA puffar ( figur 2) lågt gastryck (kväve, 4-6 psi).
- Ändra puff varaktighet för att få bästa eIPSC resultat ( figur 3) och mäta eIPSC i LPS-inducerad depression modellen ( figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Puff tekniken tillåter forskare att studera effekten av läkemedel på särskilda receptorer på ytan av en viss neuron. I den här artikeln fokuserar vi på strömmar medieras av GABA-receptorer. Figur 1 visar de puff och inspelning Mikropipetter. Att eliminera eventuella effekt på inspelade nervceller av fysiska trycket som genereras av puff, ACSF och sackaros puffar (figur 2A) används som kontroller. De svar som induceras av en GABA puff (svart) kan blockeras av en GABA-receptor-hämmare, såsom picrotoxin som rapporterade10, medan det ursprungliga tillståndet kan återvinnas genom ACSF wash-out (blå), som visas i figur 2B. Noterbart är inducerar varken en ACSF eller en sackaros puff ett svar, tyder på att svaren som induceras av GABA puffar är fysiologiska och medieras av GABA-receptorer på ytan av den inspelade cellen. Dos och puff-längd-responskurvorna visas i figur 3.
LPS har visat sig förändra neuronala aktiviteter och djurs beteende, men dess effekt på GABA-receptormedierad Svaren var inte känd. När vi jämför strömmarna induceras av GABA puffar i hjärnan skivor av LPS-insprutning och fordon kontroll möss, observerar vi betydligt reducerad IPSC amplituder på grund av LPS behandling (figur 4).
Figur 1 . Diagram över puff mikropipett och inspelning elektroden.
(A) avståndet mellan flåsa och inspelning Mikropipetter. (B) den puff mikropipett (vänster) och inspelning elektroden (höger) på ytan av en hjärna-skiva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Picrotoxin blockad av IPSC induceras av GABA puff.
(A) pustande ACSF och sackaros (50 µM) inducerar inget svar. (B) pustande 50 µM GABA inducerar en IPSC (svart) (puff varaktighet = 200 ms, 4-6 psi) i ACSF innehållande TTX (1 µM), CNQX (20 µM) och AP5 (50 µM) blockera handlingspänningar och retande nuvarande medieras av AMPA och NMDA-receptorer. GABA-inducerad IPSC blockeras av bad tillämpningen av en GABA-receptor hämmare, 100 µM picrotoxin (röd). IPSC återhämtar sig efter wash-out av picrotoxin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Dos och puff-längd-responskurvorna.
(A) prov IPSCs induceras av 10, 50 och 100 µM GABA (puff varaktighet = 50 ms, 4-6 psi). (B) Puff-längd responskurvorna. Svart, n = 11; röd, n = 8; blå, n = 10; polynom passform. Uppgifterna presenteras som medel för flera experiment (8 ≤ n ≤11); felstaplar visar SEM. (C) repetitiva strömmar frammanade av GABA (50 µM) puffar med 1, 2 eller 3 s mellanrum mellan puff (puff varaktighet = 100 ms, 4-6 psi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . eIPSC amplitud minskar i LPS-injiceras möss jämfört med fordonets reglage.
Pustande GABA inducerar en betydligt minskad IPSC amplitud i LPS-insprutning kontra kontroll nervceller (saltlösning, 19.74 ± 1,93 pA/pF; LPS, 14,10 ± 1,30 pA/pF; p = 0,02). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ämne | g/mol | Koncentration (mM) | Vikt (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26,2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glukos | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Tabell 1. Inspelning ACSF.
| Ämne | g/mol | Koncentration (mM) | Vikt (g/L) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1,25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· Cl | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glukos | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0,5 | 0.0555 |
Tabell 2. Skära skära lösning.
| Ämne | g/mol | Koncentration (mM) | Vikt (g/L) |
| CS glukonat | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Tabell 3. Inre lösning för hela-cell patch inspelningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Puff program används ofta för att utvärdera postsynaptiska receptorn funktion3,4,7, men kräver exakt kontroll i varje experiment. Här beskriver vi ett förfarande som inbegriper hela-cell patch fastspänning, vilket visar GABA-puff inducerad IPSCs (dvs. eIPSCs) i prefrontala kortikala hjärnan skivor. Motståndet av inspelning elektroden är ca 5 MΩ, medan puff Mikropipetter spets diameter är om 2-5 µm. Puff trycket är mellan 4-6 psi: detta intervall är kritisk, eftersom ett högre tryck kan orsaka neuronala skador, medan ett lägre tryck kan resultera i otillräckliga aktivering av postsynaptiska GABA-receptorer. Det vågräta avståndet från toppen av den puff mikropipett neuron inspelade handlar om 20-40 µm (diameter 1-2 nervceller) och vinkeln mellan puff mikropipett och skiva ytan är ca 45°. Spetsen på den puff mikropipett är vertikalt 20-40 µm ovan slice (z-axel). Puff varaktighet ska vara i intervallet 10-150 ms. Under ovanstående omständigheter, puffar av 10-50 µM GABA inducera ett lämpligt neuronala svar och eIPSC amplituden och kinetiska parametrar erhålls är reproducerbara. Även om protokollet beskrivs här fokuserar på puff för att en skiva patch, är den också lämplig för inspelningar i neuronala kulturer, enligt våra publicerade arbete7.
Vi visar även här eIPSCs Parade-puff tillämpning av GABA. Parat-pulse protokoll har använts i stor utsträckning att utvärdera presynaptiska boenden7,11, men möjligt postsynaptiska effekter, såsom förändringar i neurotransmittor-receptor bindande rate och bindande samhörighet, som skulle kunna påverka parat-pulse nyckeltal, inte kan fastställas genom presynaptiska Parade-puls stimulering. Protokollet beskrivs i denna artikel ger ett sätt att belysa postsynaptiska förändringar som svar på Parade och jämn puls-tåg stimuli. Minskningen i eIPSC amplitud i prefrontala cortex av LPS-injiceras möss antyder att förändrade nivåer eller aktivitet av GABA-receptorer kan ligga till grund för LPS-inducerad beteendeförändringar.
Även om, som med de flesta drogen leverans tekniker, är det svårt att veta den exakta GABA koncentrationen når målcellen, är det fortfarande möjligt att bibehålla koncentrationen av GABA på vissa nivåer i vävnaden genom att vara konsekvent med vilken typ av Mikropipetter används, och med parametrar sådan som puff drive tryck och avstånd. I vårt fall är volymen av lösning som pustade omkring 1.1 µL på 100 ms varaktighet. Således, pustande kan kvantitativa studier utförs7,12.
Beredning av friska hjärnan skivor från akut prefrontala cortex är kritiska för den puff inspelningtillvägagångssätt vi beskriver, och följande punkter bör beaktas. Först, dissekerar hjärnan och separata prefrontala cortex snabbt (< 1 min) och sedan hålla hjärnan blocket i iskall skärande lösning för mer än 1 min. Nästa, limma tätt hjärnan block ovanpå preparathållaren av vibratome, eller annars blocket hjärnan kan flyta vid snittning. Hastighet och frekvens av vibratome bör fastställas att generera ännu, friska skivor. Ansträngningar måste göras för att genomföra alla över förfaranden på 0-4 ° C att minimera neuronal excitabilitet.
Det är värt att notera att den skärande lösningen vi beskriva i denna artikel bör användas för 1-2 månad-gamla möss. För äldre möss (dvs. > 3 månader), skärande lösningen bör ersättas som beskrivs13. Puff tekniken är tillämplig på en rad patch-clamp experiment med farmakologiska behandlingar och kan även användas för att testa effekten av läkemedel på den elektriska aktiviteten i alla nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka följande organisationer: National Natural Science Foundation Kina (31171018, 31171355), vetenskap och teknik Division Guangdong (2013KJCX0054), den naturvetenskapliga grunden i provinsen Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), och Guangzhou vetenskap och teknik Bureau (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
