提出了一种用于多井板和在硅片中的膜插入系统中渗透率的测定方法, 并利用仿真对扩散系数进行了优化计算。
体外培养的皮肤模型已经越来越多地与药物和化妆品的应用相关, 也被用于药品开发和物质检测。这些模型主要培养在膜-插入系统, 它们的渗透性对不同的物质是一个重要的因素。通常, 用于确定这些参数的应用方法通常需要较大的样本大小 (例如、Franz 扩散单元) 或费力的设备 (例如, 漂白后的荧光恢复 (酶))。本研究提出了在4.26 毫米和12.2 毫米 (栽培面积) 直径大小的膜插入系统中直接测定渗透系数的方法。用琼脂糖和胶原凝胶以及代表皮肤模型的胶原细胞模型对该方法进行了验证。准确地描述了不同分子尺寸和通过不同细胞模型 (由胶原凝胶、成纤维细胞和 HaCaT) 渗透的物质的渗透过程。
此外, 为了支持上述实验方法, 建立了仿真模型。模拟实验数据很好地适合于小分子量的物质, 多达 14 x 10-10 m 斯托克斯半径 (4000 兆瓦), 因此是描述该系统的一个有希望的工具。此外, 模拟可以大大减少实验工作, 并且足够健壮, 可以扩展或适应更复杂的设置。
有机典型的3D 文化已成为药物开发和物质测试的有力工具1。在这方面, 人类皮肤模型是特殊的兴趣, 由于监管要求, 如在化妆品行业。随后, 它们导致了许多3D 皮肤模型的发展, 用于在多井板上使用自己作为单器官培养, 或在多器官芯片中结合附加的器官模型,例如, 肝脏2。
关于皮肤当量的培养, 空气液界面 (阿里) 是正确的表皮分化的一个重要因素3。细胞培养插入物组成的容器, 在底部的液体渗透膜通常用于建立阿里。ALIs 广泛应用于商业可用的皮肤模型, 如表皮4, Phenion5和 Episkin6, 为皮肤模型的文化, 大小从 96-井 (4.26 毫米直径), 由 12-井 (12.2 毫米直径) 板。此处描述的方法决定了膜插入系统中物质的渗透。
渗透系数是评价任何培养皮肤模型的质量的一个重要参数, 与本机皮肤相比5, 用于评估活性物质在皮肤中的快速迁移。特别是如果药物或化妆品产品需要应用到皮肤, 这个参数是必要的, 以了解确切的是什么时候有效的药物通过它。模拟可以进一步帮助预测系统的行为, 并随后减少必要的耗时的实验努力, 特别是当涉及到大量的物质。
Franz 扩散细胞是最先进的渗透实验与皮肤和皮肤模型5,6,7,8,9。该装置由两个车厢组成, 其中有一个固定样品 (扩散屏障)。要测试的物质直接应用于样品的顶端 (供料室), 并且在相对 (受体) 隔间可以检测到渗透化合物的浓度。在接受方方面, 通过温度室和磁力搅拌器保证恒温和均匀的物质浓度。样品可以取自 Franz 细胞受体侧的取样臂。与高度范围在 19 cm 和 179 cm 之间, 这个系统是相对地大10,11。酶了另一种测定凝胶状物质和组织中扩散系数的方法。该技术采用漂白荧光标记颗粒在凝胶中的原理, 然后确定漂白面积的恢复时间, 计算扩散系数12,13,14。
此外, 傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱可用于检测红外光吸收粒子运动, 以确定皮肤中物质的渗透过程15,16。然而, 这些或其他成像方法 (例如, 双光子荧光相关光谱学17) 需要耗费大量的仪器。
本文提出了一种在膜插入系统中直接测量屏障渗透性的方法, 该模型可以培养出一种皮肤模式。这种方法使渗透实验可以运行与大量的小样本 (以及大小高达4.26 毫米) 在紧凑的系统。这与 Franz 扩散单元形成对比, 每个探头需要一个单独的装置, 必须安装在设备上, 并且很难实现小样本 (尺寸为4.26 毫米)。此外, 由于该方法不需要主要的仪器 (例如, 共焦或光子显微镜), 因此缩短了时间和成本。
所有的实验都是在微孔膜插入系统中进行的, 其样本 (屏障) 由琼脂糖凝胶或膜上建立的胶原细胞模型组成。将不同分子量的荧光物质 (施主) 应用于样品的顶端, 并使用荧光板读取器在底部 (受体) 检测到渗透物质的浓度 (参见图 1)。为了验证该方法的正确性, 并对该模拟结果进行测试, 制备了琼脂糖凝胶, 并作了屏障。水凝胶一般用于研究生物科学中多孔介质中的扩散和渗透过程13。该方法随后在一个细胞种子系统中进行测试, 它由原发成纤维细胞的胶原基质和成人低钙高温角质细胞 (HaCaT) 单元 (细胞基质模型) 组成, 它是一种简化的皮肤模型18,19.
此外, 通过计算流体力学的流动模拟, 对渗透过程进行了模拟。结果表明, 通过参数优化, 可以从实验数据中计算出扩散系数。一般情况下, 该仿真提供了不同的应用;例如, 有可能预测一个基于短实验的渗透过程, 模拟可以显著减少实验次数。
实验方法和仿真设计用于在一个芯片系统1,20,21, 特别是2器官芯片 (2-OC) 开发商业1,22, 23,24,25。在原理上, 可以用这种方法描述任何基于膜插入系统的器官模型的渗透过程。
本研究记录了一种通过在膜上工程组织结构来量化渗透的方法。首先通过琼脂糖凝胶对不同分子量的物质进行了渗透试验, 验证了该方法的有效性, 并进行了相应的仿真研究。众所周知, 小分子通过基质网的渗透速度更快 (除了渗透色谱法在凝胶过滤中的作用除外)。通过巩膜26、人表皮膜27、人皮肤17和大鼠皮肤28等物质的大小排斥实验进行了类似的观察。渗透系数与相应的斯托克斯半径之间的反相关 (一个硬球体的半径与所描述的分子的扩散速率相同, 通常小于分子的有效半径) 已显示26,28, 在实验中观察到不同分子大小物质的相似关系。通过绘制 1/斯托克斯半径的渗透系数, 发现了四组具有最小分子尺寸的线性相关性 (R2 = 0.93) (图 6)。这表明, 模拟渗透系数的方法建议是在一个现实的范围。
在实验中, 46.15% 的误差比用 Franz 扩散单元系统10的渗透性实验报告的略大。一个可能的解释可能是荧光素-异硫氰酸酯-葡聚糖的大小分布, 稍后讨论。
所述方法与使用 Franz 扩散细胞系统的方法相比具有重要的优越性。首先, 设置更加紧凑;实验直接在膜插入系统中执行, 它具有商业井板 (∼13厘米 x 8.5 厘米) 的刻度。这样可以同时运行多个示例, 而每个示例都需要一个单独的 Franz 扩散单元。其次, 皮肤模型的渗透性可以直接测量在膜插入物, 在那里耕种发生。使用 Franz 扩散细胞, 样品必须取出并安装在系统上, 这对小样本来说更繁琐, 也更费时。
经胶原细胞基质渗透实验表明, 该方法可成功应用于细胞种子系统。本模型对皮肤模型进行了验证;然而, 该方法可应用于其他类型的有机细胞培养, 如肾脏或肝脏,如。
在本研究中, 采用胶原细胞模型, HaCaT 细胞完全覆盖模型表面 (参见图 5)。这导致了渗透系数的降低, 表明该方法灵敏度足以区分胶原细胞模型与无 HaCaT 层之间的渗透系数。理想的情况下, 皮肤模型应该建立一个屏障, 接近皮肤的真正皮肤29, 因此, 重要的是要验证的质量 (例如, 建立真皮, 表皮), 在实际使用之前。皮肤模型的发展可以可视化染色技术和量化的检测皮肤蛋白和胶原蛋白30,31,32。渗透系数也可能是评估皮肤模型发展的一个重要因素, 但需要进一步的实验来证实这一点。如前所述, 此方法允许并行运行多个示例。在培养过程中, 也可以采集样本来测量渗透性, 从而观察皮肤模型的这个参数的发展。
应注意的是, 渗透率通过凝胶/胶原细胞模型和膜同时测量。检测到的渗透系数是系统特有的, 因此不同皮肤模型的结果只能在使用相同的膜插入时进行比较。此外, 皮肤模型需要覆盖整个种植区, 以确保测试物质只渗透通过模型, 而不是相邻的, 这将诱发错误的渗透率测量。在未来的实验中应该考虑的另一个方面是皮肤周围的自然环境。通常情况下, 皮肤表面的温度与内区比较较低, 这会影响渗透条件。
为了使实验室实验与计算机模拟相结合, 提出了一种应用仿真的参数优化方法。实验结果表明, 与小分子尺寸的物质吻合良好。然而, 对于具有较大分子量的物质, 模拟结果与实验数据之间存在偏差。大的多糖分子可以增加摩擦和减缓扩散过程中的凝胶。此效果导致异常扩散, 这是实验和模拟值之间偏差的可能原因33,34。另一种解释可能是荧光素-异硫氰酸酯-葡聚糖中较小或更大颗粒的存在。制造商指定物质的分子量作为平均大小以一个指定的范围, 允许更小和更大的微粒存在。还不清楚这些物质是如何分散的, 因为较小的粒子通过凝胶和流体通道渗透得更快。可以扩展模拟来考虑这些扩散和摩擦效应。
研制了 2-OC 的渗透率试验和模拟实验。在仿真的帮助下, 该实验方法可以直接转移到较为复杂的实验装置中。例如, 膜插入系统模拟可以很容易地转移到 2 OC 或其他系统的几何类似的设置。这种调制模拟的选择可以用来支持未来实验的设计。此外, 蒸发、异常扩散、膜效应等副作用可以结合起来进行模拟, 从而提高精度。仿真程序给出了改变或增强模拟方程的机会, 以及集成其他物理模块, 以研究皮肤模型开发的其他方面。一个例子是模拟葡萄糖消耗量和乳酸生产在胶原细胞模型。
在医疗物质的测试中, 一个特别有趣的方面是这些物质是如何分布在一个芯片系统上的。模拟和渗透参数我的帮助回答的问题, 如如何快速的物质渗透到系统中, 以及哪些浓度将可用于其他组织在多器官芯片。该方法能够支持和加强对此类机构芯片系统的开发和测试。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是在德国 Forschungsgemeinschaft (DFG) 的资助下创建的。PO413/12-1 和 LA 1028/7-1。
Agarose | Carl Roth | K297.2 | High Resolution Powder |
Collagen | Serva | 47256.01 | Collagen R solution 0.4 % |
DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | High Glucose with L-Glutamine |
FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | Fetal Calf Serum |
Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | no calcium, no magnesium , with phenol red |
NaOH | Merck | 1.06467.9010 | granulated |
PBS | Gibco | 18912-014 | tablets |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning | 3391 | 96 well, 0.4 µm pore size |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 well, 0.4 µm pore size |
Trypsin | Biochrom GmbH | L2143 | with EDTA |