Summary
Um método para determinação da permeabilidade de uma membrana inserir sistema para placas multi bem e em silico otimização de parâmetro para o cálculo dos coeficientes de difusão usando simulação são apresentados.
Abstract
Em vitro cultivada pele modelos tornaram-se cada vez mais relevantes para aplicações farmacêuticas e cosméticas e também são usados no desenvolvimento de drogas, bem como a substância de teste. Estes modelos são cultivados principalmente em sistemas de membrana-inserção, sua permeabilidade em direção a diferentes substâncias, sendo um factor essencial. Normalmente, os métodos aplicados para a determinação desses parâmetros geralmente exigem tamanhos de amostra grande (por exemplo, célula de difusão de Franz) ou laborioso equipamento (por exemplo, recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP)). Este estudo apresenta um método para a determinação de coeficientes de permeabilidade diretamente nos sistemas de membrana-inserção com tamanhos de diâmetro de 4,26 e 12,2 mm (área de cultivo). O método foi validado com agarose e gel de colágeno, bem como um modelo de célula de colágeno que representa modelos de pele. Os processos de permeação de substâncias com diferentes tamanhos moleculares e permeação através de modelos de célula diferente (composto de gel de colágeno, fibroblastos e HaCaT) foram descritos com precisão.
Além disso, para apoiar o método experimental acima, estabeleceu-se uma simulação. A simulação se encaixa os dados experimentais bem para substâncias com pequeno tamanho molecular, até 14 x 10-10 m de raio de Stokes (4.000 MW), e, portanto, uma ferramenta promissora para descrever o sistema. Além disso, a simulação pode reduzir consideravelmente os esforços experimentais e é robusta o suficiente para ser estendido ou adaptado para instalações mais complexas.
Introduction
Organo-típico 3D culturas tornaram-se ferramentas poderosas para o desenvolvimento de drogas e substância teste1. Neste aspecto, modelos de pele humana são de especial interesse devido a requisitos regulatórios, tais como aqueles na indústria de cosméticos. Posteriormente, eles levaram ao desenvolvimento de inúmeros modelos 3D da pele, para utilização em suas próprias como culturas de single-órgão em placas multi bem, ou multi-organ-fichas em combinação com modelos de órgão adicional, por exemplo, o fígado2.
Em relação ao cultivo de um equivalente de pele, a interface ar-líquido (ALI) é um elemento essencial para a adequada diferenciação epidérmica3. Inserções de cultura de célula compostas de um navio com uma membrana permeável ao líquido na parte inferior são normalmente usadas para estabelecer um ALI. ALIs são amplamente utilizados em modelos de pele disponível comercialmente como EpiDerm4, Phenion5e Episkin6, para a cultura de modelos de pele com tamanhos de 96 poços (4,26 mm de diâmetro) até placas boas 12 (12,2 milímetros de diâmetro). O método descrito aqui determina a permeação de substâncias em um sistema de inserção de membrana.
O coeficiente de permeabilidade é um parâmetro importante para avaliar a qualidade de qualquer modelo de pele cultivada em comparação com pele nativa5e é usado para avaliar quão rapidamente as substâncias activas migram através da pele. Especialmente se medicamentos ou cosméticos produtos precisam ser aplicado sobre a pele, este parâmetro é essencial para compreender quando precisamente os agentes passam através dela. Uma simulação pode ajudar ainda mais para predizer o comportamento do sistema e posteriormente reduzir o necessário esforço experimental demorado, especialmente quando um grande conjunto de substâncias está envolvido.
A célula de difusão de Franz é o estado-da-arte para permeação experimentos com pele e pele modelos5,6,7,8,9. Este dispositivo consiste de dois compartimentos com uma amostra fixa (barreira de difusão) no meio. A substância a ser testado é aplicada diretamente ao topo da amostra (compartimento doador) e a concentração do composto penetrante pode ser detectada no compartimento do oposto (aceitador). No lado acceptor, temperatura constante e a concentração da substância homogênea são asseguradas através de uma câmara de temperatura e de um agitador magnético. Amostras podem ser recolhidas de um braço de amostragem no lado aceitador da célula de Franz. Com uma faixa de altura entre 19 cm e 179 cm, este sistema é relativamente grande de10,11. Outro método para a determinação dos coeficientes de difusão em substâncias gelatinosa e tecidos é FRAP. Esta técnica usa o princípio de branqueamento fluorescente etiquetado partículas em gel e em seguida determinar o tempo de recuperação da área branqueada para calcular a difusão coeficiente12,13,14.
Além disso, espectroscopia de infravermelho de transformação de Fourier (FTIR) pode ser usada para detectar o movimento de partículas com absorbância de luz infravermelha para determinar o processo de permeação de substâncias na pele15,16. No entanto, estes ou outros métodos de imagem (por exemplo, de espectroscopia de correlação de dois fotões fluorescência17) precisam custar instrumentos intensivos.
Neste artigo, um método é apresentado para medir diretamente a permeabilidade de uma barreira dentro de um sistema de inserção de membrana, onde um modelo de pele pode ser cultivado. Esse método permite experimentos de permeabilidade seja executado com um grande número de pequenas amostras (bem tamanho acima para 4,26 mm) em um sistema compacto. Isto está em contraste com a célula de difusão de Franz, onde um dispositivo separado é necessária para cada teste, o que tem de ser montado no dispositivo e é difícil perceber para amostras pequenas (tamanho de 4,26 mm). Além disso, uma vez que o método não requer grande instrumentação (por exemplo, um microscópio confocal ou do multiphoton), é obter uma redução no tempo e no custo.
Todos os experimentos foram realizados em membrana microporosa inserir sistemas com uma amostra (barreira) consiste em gel de agarose ou um modelo de célula de colágeno estabelecido na membrana. Substâncias fluorescentes (doador) com diferentes tamanhos moleculares foram aplicadas para o topo da amostra e a concentração da substância permeated foi detectada na parte inferior (aceitador) usando um leitor de placa de fluorescência (ver Figura 1). Para validar o método e testar a precisão desta simulação, géis de agarose foram produzidos e utilizados como uma barreira. Hidrogel é geralmente utilizados para a investigação dos processos de difusão e permeação em meio poroso em ciências biológicas13. Então, o método foi testado em um sistema de célula-semeado consiste em uma matriz de colágeno dos fibroblastos primários e adulto baixo cálcio alta temperatura queratinócitos (HaCaT) células humanas (modelo de célula-matriz), que é uma pele simplificado modelo18,19 .
Além disso, o processo de permeação foi simulado através de simulações de fluxo com dinâmica de fluidos computacional. Verificou-se que, por meio da otimização de parâmetro, o coeficiente de difusão poderia ser calculado a partir dos dados experimentais. Em geral, esta simulação oferece diferentes aplicações; por exemplo, é possível prever um processo de permeação com base em experiências curtas e a simulação pode reduzir significativamente o número de experimentos.
Simulação e método experimental foram projetadas para aplicação de um sistema de órgãos-em-um-microplaqueta1,20,21, especificamente o 2-órgão-chip (2-OC) desenvolvido comercialmente1,22, 23,24,25. Em princípio, o processo de permeação de qualquer modelo de órgão com base em sistemas de inserção de membrana pode ser descrito desta forma.
Protocol
1. preparação da amostra para estudos de permeabilidade
Nota: Para verificar as medições de permeação e simulações, foi utilizada uma amostra composta de gel de agarose ou um modelo de matriz celular baseado no cultivo do modelo de pele.
- Gel de agarose
- Dissolva 0,2 g de pó de alta resolução de agarose em 10 mL de H2O (água bidestilada).
- Misturar a solução e aquecê-lo até 80 ° C. Manter a temperatura durante 8 min.
- Aplicar o gel de agarose 28,6 µ l na membrana do sistema de inserção de membrana de 96 poços (4,26 mm de diâmetro) ou uso 226 µ l para a membrana bem 12 inserir sistema (12 mm de diâmetro) (por exemplo, sistema de Transwell).
- Espere 10 minutos até que o gel é solidificado.
- Gel de colágeno
Nota: Todas as etapas são executadas em condições estéreis e as soluções são mantidas no gelo para retardar a polimerização do gel de colágeno.- Mix de 125 µ l de Hanks equilibrado sal solução (HBSS) com 1 mL de solução de colágeno R de 0,4% (colágeno de cauda de rato).
- Titule a solução com 1 M de NaOH (hidróxido de sódio) (~ 6 µ l) até que a cor de vermelho de fenol muda de amarelo para vermelho.
- Adicionar 125 µ l de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) + 10% de soro fetal bezerro (FCS) para o gel de colágeno e misturar cuidadosamente com a ponta da pipeta.
- Aplicam-se à membrana do sistema de inserção de membrana de 96 poços ou 226 µ l para o sistema de inserção de membrana 12-poços 28,6 µ l de gel de colágeno.
- Deixe o gel em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 30 min.
- Modelo de células de colágeno com fibroblastos
Nota: Todas as etapas são executadas sob condições estéreis.- Prepare-se fibroblastos primários 5-7 dias antes do experimento. Cultivar os fibroblastos com DMEM + 10% FCS em frascos de cultura de células (75 cm2) e mudar o médio a cada 2-3 dias.
Nota: Dependendo da configuração experimental, um maior número de células pode ser usado. - Retire o meio do balão de cultura de células (80% de confluencia) e duas lavagens com 10 mL (cultura balão 75 cm2) de soro de tampão fosfato (PBS). Adicionar 3 mL de 0.05% tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 3 min a 37 ° C.
- Bata suavemente sobre o frasco de cultura para separar as células da superfície. Pare a reação adicionando-se 3 mL de DMEM + 10% FCS. Transferi a solução para um tubo de centrifugação.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 120 x g, remover o sobrenadante e ressuspender as células com 0,5 mL de DMEM + 10% FCS.
- Contar as células e ajustar a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL.
Nota: As seguintes etapas são executadas no gelo para retardar a polimerização do gel de colágeno. - Mix de 125 µ l de HBSS com 1 mL de solução de colágeno R de 0,4%.
- Titular a solução com 1 M de NaOH (~ 6 µ l) até que a cor do vermelho de fenol muda de amarelo para vermelho.
- Adicionar 125 µ l de suspensão de células (DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 células/mL) para o colágeno gel e misturar cuidadosamente com uma pipeta.
- Aplica 28,6 µ l de gel de colágeno na membrana do sistema de inserção de membrana de 96 poços ou 226 µ l para o sistema de inserção de 12-poços de membrana.
- Deixe o gel em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 30 min.
- Aplicam-se na superfície do gel 75 µ l de DMEM + 10% FCS e 300 µ l para a placa do receptor da membrana 96 poços inserir sistema. Para a membrana 12-bem inserir sistema, usar um volume de 590 µ l para a superfície e 1.846 µ l para a placa do receptor.
- Remova o meio da superfície do modelo de matriz de célula (elevador de ar) e incubar o modelo de matriz celular mais 7 dias. Use 100 μl médio no fundo e mudar o meio todos os dias.
- Prepare-se fibroblastos primários 5-7 dias antes do experimento. Cultivar os fibroblastos com DMEM + 10% FCS em frascos de cultura de células (75 cm2) e mudar o médio a cada 2-3 dias.
- Modelo de células de colágeno com HaCaT
Nota: Todas as etapas são executadas sob condições estéreis.- Preparar o HaCaT 5-7 dias antes das etapas a seguir. Cultivar a HaCaT com DMEM + 5% FCS em um frasco de cultura celular (75 mm2) e mudar o médio a cada 2-3 dias.
Nota: Dependendo da configuração experimental, um maior número de células pode ser usado. - Retire o meio do balão e lavar duas vezes com (cultura balão 75 cm2) de 10 mL de PBS. Adicionar 3 mL de 0.05% tripsina/EDTA e incubar durante 10 minutos a 37 ° C. Pare a reação com 3 mL de DMEM + 10% FCS. Transferi a solução para um tubo de centrifugação.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 120 x g, remover o sobrenadante e ressuspender as células com 0,5 mL de DMEM + 10% FCS.
- Contar as células e ajustar a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL.
Nota: As seguintes etapas são executadas no gelo para retardar a polimerização do gel de colágeno. - Mix de 125 µ l de HBSS com 1 mL de solução de colágeno R de 0,4%.
- Titular a solução com 1 M de NaOH (~ 6 µ l) até que a cor do vermelho de fenol muda de amarelo para vermelho.
- Adicionar 125 µ l de DMEM + FCS de 10% para o gel de colágeno e misture cuidadosamente com uma pipeta.
- Aplica 28,6 µ l de suspensão de células na membrana do sistema de inserção de membrana de 96 poços ou 226 µ l para o sistema de inserção de 12-poços de membrana.
- Deixe o gel em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 30 min.
- Aplicam-se à superfície do gel 75 µ l de suspensão de células e adicionar 300 µ l de DMEM + FCS de 10% para a placa do receptor da membrana 96 poços inserir sistema. Para a membrana 12-bem inserir sistema, usar um volume de suspensão de células 590 µ l para a superfície e 1.846 µ l de DMEM + FCS de 10% para a placa do receptor.
- O modelo de matriz celular, incubar durante 3 dias; troca o meio depois de 2 dias.
- Remova o meio da superfície do modelo de matriz de célula e incubar o modelo de matriz celular por mais de 7 dias. Use 100 µ l meio no fundo e mudar o meio todos os dias.
- Preparar o HaCaT 5-7 dias antes das etapas a seguir. Cultivar a HaCaT com DMEM + 5% FCS em um frasco de cultura celular (75 mm2) e mudar o médio a cada 2-3 dias.
- Modelo de células de colágeno com fibroblastos e HaCaT
Nota: Todas as etapas são executadas sob condições estéreis no gelo para retardar a polimerização do gel de colágeno. Preparar os fibroblastos, conforme descrito na etapa 1.3 até passo 1.3.5 e preparar um dia mais tarde HaCaT como descrito no passo 1.4 até passo 1.4.4.- Mix de 125 µ l de HBSS em 1 mL de solução de colágeno R de 0,4%.
- Neutralizar a solução com 1 M de NaOH (~ 6 µ l) até que a cor do vermelho de fenol muda de amarelo para uma vermelha violeta.
- Adicionar 125 µ l de suspensão de células de fibroblastos primário composto por DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 células/mL para o colágeno gel e misturar cuidadosamente.
- Aplica 28,6 µ l de suspensão de células para a membrana do sistema de inserção de membrana de 96 poços ou 226 µ l para o sistema de inserção de 12-poços de membrana.
- Deixe o gel em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 30 min.
- Em seguida, aplica 75 µ l de DMEM + 10% FCS na superfície do gel e 300 µ l para a placa do receptor do sistema de inserção de membrana de 96 poços. Para a membrana 12-bem inserir sistema, um volume de 590 µ l é usado para a superfície e 1.846 µ l para a placa do receptor.
- Incube durante 1 dia em 37 ° C e 5% de CO2.
- Remova o meio da superfície e adicionar uma suspensão de células de HaCaT com 0,5 x 106 células/mL. O volume é a mesma descrita antes sob passo 1.5.6.
- O modelo de matriz celular, incubar durante 3 dias; troca o meio depois de 2 dias.
- Remova o meio da superfície do modelo de matriz de célula e incubar o modelo de matriz celular por mais de 7 dias. Use 100 µ l meio no fundo e mudar o meio todos os dias.
Nota: Para esta investigação, 3 amostras de gel/celular-modelo estavam preparadas para o sistema de inserção de 12-poços de membrana. Para a membrana de 96 poços inserir sistema, usamos 6 amostras para o modelo de celular/gel. Para fins estatísticos, 3 amostras são comuns. Mas para os experimentos no sistema de inserção de membrana de 96 poços com modelo de matriz de colagénio que esperávamos falhas e desvios para a cultura de células. Portanto, optamos por um maior número de amostras.
2. estudos de a permeabilidade na membrana inserir sistema
-
Substância de doador
Nota: Dois sais de sódio de fluoresceína (pregarias) são produzidos.- Dissolva pregarias em H2O na concentração de 0,1 mg/mL e 0,01 mg/mL. Os diferentes fluoresceína isotiocianato-dextranos (FD) com um peso molecular de 4.000, 10.000, 20.000 e 40.000 g/mol dissolvem-se em H2O na concentração de 2 mg/mL. Use essas soluções como substância doador para os experimentos de permeabilidade (ver Figura 1) com gel de agarose.
- Para a configuração com o modelo de células de colágeno, prepare todas as soluções com DMEM + 10% FCS em vez de água.
Nota: Prepare soluções estoque (10x maior concentração) da substância de doador. Pequenas variações da concentração dos doadores podem influenciar os resultados do experimento permeabilidade.
-
Método experimental
Nota: O experimento de permeabilidade é executado a 37 ° C e uma humidade de > 90%. Este parâmetro assegura a viabilidade das células. Temperatura influencia o processo de difusão para que os mesmos parâmetros são utilizados para os experimentos com o gel de agarose, gel de colágeno e modelo de células de colágeno. As informações de volume do suporte refere-se ao sistema de inserção de membrana 12-bem.- Prepare-se uma membrana bem 96 (ou 12) sistema de inserção com uma barreira consistindo de agarose gel (ver protocolo 1.1) ou modelo de célula (Veja o protocolo 1.2-1.5) e a substância de doador de fluorescência.
- Preparar diluições de 01:10, 01:20, 01:40, 1:80, 1:160 e 1:320 da substância doador para o estabelecimento de uma curva padrão. Pipete 300 µ l (1.846 µ l) de cada diluição em três poços da placa do receptor. Para a membrana 12-bem inserir sistema utilize uma placa receptor separado. As diluições de série são usadas para converter a medida da fluorescência [RFU] na concentração equivalente [mg/mL].
- Adicione 75 µ l (590 µ l) de substância de doador no topo da amostra (modelo de agarose gel ou celular) e 300 µ l (1.846 µ l) de substância aceitador (H2O ou DMEM + 10% FCS) na placa do receptor (ver Figura 1).
Nota: Certifique-se que as superfícies do líquido na membrana inserir o sistema e a placa do receptor com o mesmo nível para evitar a pressão hidrostática. - Transferi todo o sistema em um shaker na incubadora. Ajustar a agitação para obter uma mistura homogênea (órbita de curso total 1,5 mm, velocidade é ajustada no nível 3.5, que está relacionada com uma rotação de ~ 480 1/min) para evitar um gradiente de concentração, que influencia o processo de difusão.
- Determine a fluorescência periodicamente a cada hora. Para medir a fluorescência, transferir o sistema de inserção de membrana em um prato vazio e medir a fluorescência dentro o receptor usando um leitor de placa. Usar um comprimento de onda de excitação de 485 nm e emissão de 535 nm para fluoresceína.
- Execute o experimento por 5h.
Nota: Durante os experimentos, o líquido evapora-se de todo o sistema. A evaporação altera a concentração no doador e aceptor e influencia os resultados. Este efeito é negligenciado no caso de uma duração de 5 h, mas para tempos mais longos de execução que deve ser considerado.
-
Cálculo do coeficiente de permeabilidade
- Para estabelecer a curva padrão, plotar a fluorescência das diluições de série versus concentração e realizar uma regressão linear sobre os dados.
- Use o declive da regressão linear para converter os dados de fluorescência do experimento permeação em concentração. Para efeitos de simulação, converta unidades em mol/m3.
- Traçar a concentração em função ao longo do tempo e estabelecer o segmento linear de dados (ver Figura 2).
- Determinar a inclinação desta parte linear e calcular o coeficiente de permeabilidade de acordo com a equação seguinte (Veja o exemplo na Figura 2):
onde dcA/ dt é a alteração da concentração da substância na lado acceptor ao longo do tempo (a inclinação); CD é a concentração do lado do doador; P é o coeficiente de permeabilidade; A é a superfície de permeação e VA é o volume do aceitador. Esta equação é derivada da primeira lei de Fick e só pode ser aplicado quando CD » CA6,22. - Nota: As concentrações no doador tem que ser muito maior do que a concentração detectada no aceitador. Isso foi verificado na instalação experimental.
3. simulação
Nota: A simulação foi feita com COMSOL Multiphysics 5.1. É assumido um conhecimento básico do presente. Para a simulação de difusão, são feitas as seguintes premissas: (a) o coeficiente de difusão das substâncias em H2O é muito maior em comparação com o que no gel. Para compensar esta diferença, a simulação utiliza um valor de 1 x 10-9 m2/s, que é maior por um fator de 10 a 100, em comparação com o coeficiente de difusão de pregarias através do gel de agarose 2%. (b) no experimento, a substância difunde através da barreira e através da membrana da membrana inserir sistema. Em contraste com a configuração experimental, a matriz de gel ou células de agarose virtual e membrana são considerados uma fase homogênea. (c) efeitos de fronteira nas paredes são definidos como "nenhum deslizamento", todos os efeito deslizando nas paredes (não entre o líquido e gel ou líquido e célula modelo) do sistema de inserção de membrana são negligenciados e não são significativos para o processo de difusão.
- Configuração da simulação difusão
Nota: Estes passos demonstram a instalação da simulação do experimento permeabilidade. As simulações para os sistemas de inserção de membrana de 96 - e 12-bem foram criadas separadamente. O módulo de "Transporte de espécies químicas" usa uma equação baseada na segunda lei de Fick da difusão:
onde c é a concentração da substância, t é o tempo, u é a velocidade, D é o coeficiente de difusão e R é a taxa de reação. A taxa de reação foi negligenciada porque não há reação química ocorreu no processo de difusão.- Abra o programa e iniciar um novo modelo. Escolheu o "Assistente de modelo", selecione o 3D modelo, adicione "Transporte de dilui-se espécies" para interface física no menu pull-down, clique em "Estudo", selecione o estudo "Dependente do tempo" e clique em "Concluído".
- Ir para as definições de"Global" e adicionar "Parâmetros" com o botão direito. Digite os parâmetros geométricos e físicos na grade (ver tabela 1, tabela 2e Figura 3e).
Nota: A superfície côncava do gel do agarose em um sistema de inserção de membrana de 96 poços foi aproximada com uma bola de imersão. - Configurar a geometria do sistema de inserção de membrana das experiências. No passo 3.2, figura um exemplo de como construir a geometria do sistema de inserção de membrana de 96 poços. A unidade de comprimento é definida para o medidor.
Nota: Não construa a geometria inteira para economizar tempo de cálculo. Em vez disso, a geometria pode ser reduzida por meio de linhas de centro de um bairro de geometria (ver Figura 3a e Figura 3b). - Adicionar duas "sondas de domínio" em "Definições" (direito clique em "Definições" e localize o "Sonda") e selecione uma sonda como domínio o aceitador e o outro, o domínio do doador. Escolha para ambos tipo "Média" e a expressão "c", com a unidade "mol/m3".
Nota: Este passo é opcional e mostra a concentração do doador e aceptor durante a simulação. - Fixar o coeficiente de difusão (Dc) em "Propriedades de transporte 1" em "transporte de espécies diluído"como "Dif_w".
Nota: "Propriedades de transporte 1" são usadas para domínio aceitador e do doador. Na próxima etapa, o domínio de barreira será sobrescrito. - Adicionar um segundo clique "Propriedades de transporte 2" com direito sobre "Transporte de dilui-se espécies" e selecione a barreira (2), na seleção"domínio". Dependendo do objetivo da simulação, o coeficiente de difusão pode ser definido como um valor da barreira ou como uma variável fictícia "D". Para a primeira execução de teste, defina um valor de 2E-10 m2/s.
Nota: "D" será declarado mais tarde no passo 3.3. - Em "Transporte de dilui-se espécies" para "valores iniciais 1" definem a concentração como zero.
Nota: "Valores iniciais 1" são usados para domínio de barreira e aceitador. Na próxima etapa, o domínio do doador será sobrescrito. - Adicionar um segundo clique "Inicial valores 2" com direito sobre "Transporte de dilui-se espécies" e selecione o doador (3), o domínio. Defina a concentração como a concentração inicial da substância doador (por exemplo, C_fl do quadro 2).
- Adicionar "Simetria 1" com o botão direito do mouse sobre "Transporte de dilui-se espécies", adicionar e escolher todas as superfícies da "Seleção limite", que espelham a geometria toda (por exemplo a geometria na etapa 3.2, o limite é o número 1, 2, 4, 5, 7, 8).
Nota: Este ponto pode ser negligenciado, se a geometria inteira foi criada. - Com um clique direito em "Malha" Adicione duas "tetraédrica livre". Selecione a barreira (2), o domínio (alterar o nível de entidade geométrica em "Domínio"). Adicionar o "Tamanho" com o botão direito do mouse na "enciclopédia Tetrahedral 1" e para a malha predefinida "Finos" para a membrana 12-bem inserir sistema ou inserir "extra fino" para uma membrana de 96 poços sistema.
- Na segunda "enciclopédia tetraédrica" Selecione o aceitador e o doador como o domínio e a malha predefinida "Normal" para uma membrana de 12-bem inserem sistema ou inserir mais "fino" para uma membrana de 96 poços sistema (ver Figura 3 c e Figura 3d).
Nota: Também é possível escolher uma malha mais grossa para economizar tempo de computação. Isto pode reduzir a precisão dos resultados. Clique em "Construir tudo" em "Configuração de malha" nas malhas da geometria. - Iniciar a simulação com "computação" "Estudo 1".
- Exemplo de configuração para uma geometria
Nota: Aqui, um exemplo é dado de como configurar a geometria do sistema de inserção de membrana de 96 poços (com barreira côncavo). Todas as etapas são executadas no módulo de geometria do programa. A unidade de comprimento é definida para o medidor.- Gere um cilindro 1 (clique direito em "Geometria 1") com raio de d_w/2 e altura de h_sp + h_b + h_a.
- Gere um cilindro 2 com raio de d_tran/2, altura do h_b + h_a e z-posição de h_sp.
- Use a opção de "Diferença" (clique com o botão direito sobre "geometria 1", localize "Booleanos e partição") para subtrair cilindro 2 do cilindro 1. Escolheu "cyl1" no "Objetos para adicionar," ativar "Objeto subtrair" e escolheu "cyl2". O novo volume é a geometria do aceitador.
- Gere um cilindro 3, com raio de d_a/2, altura de h_b e posição de z do h_sp.
- Gere uma esfera 1 com raio r e z r_z de posição.
- Use a opção de "Diferença" para subtrair a esfera 1 (sph1) do cilindro 3 (cyl3). O novo volume chama-se diferença 2.
- Gerar um cilindro 4, com raio de d_a/2, altura de h_b + h_a e posição z de h_sp.
- Use a opção de "Diferença" para subtrair o cilindro 4 (cyl4), de 2 de diferença. O novo volume é a geometria do aceitador.
- Repita as etapas 3.2.4-3.2.6 para construir a barreira (a agarose gel ou célula modelo no experimento).
- Fazer uma União 1 de todos os elementos de geometria (à direita clique em "Geometria 1", localize "Booleanos e partição").
- Gerar um bloco 1 com todas as bordas definidas para um comprimento de d_tran * 2, posição x de - d_tran e y de d_tran * 2.
- Gerar um bloco 2 com comprimento de borda toda de d_tran * 2, posição x de - d_tran * 2 e y de - d_tran.
- Use a opção de "Diferença" para subtrair a União 1 do bloco 1 e bloco 2.
- Adicionando a parâmetro de otimização para a simulação
Nota: Com a ajuda de otimização de parâmetro, o coeficiente de difusão pode ser equipado para os dados experimentais gerados anteriormente. As instruções a seguir mostram como integrar a parte de otimização para a simulação de difusão. Certifique-se que a simulação de difusão está funcionando antes de iniciar estes passos.- Adicionar o módulo de física "Otimização" usando "Adicionar físico" (otimização pode ser encontrada em "Matemática" na categoria "Otimização e sensibilidade") para a simulação. Clique em "Adicionar ao componente".
- Adicione "Variáveis" com botão direito do mouse em "Definições" (local no componente) e digite nas variáveis de tabela 3.
Nota: A otimização de parâmetro usa números reais, ou seja, o fator 1-10 do coeficiente de difusão deve ser definido separadamente. - Adicione 1 "média" com botão direito em "Definições" na seção "Componente de acoplamento" e digite o nome do operador "Aceptor".
- Gere um documento de texto separado que contém os dados experimentais.
Nota: Um ponto e vírgula separa colunas; uma quebra de linha separa linhas. Declaração de tempo é medida em segundos, a concentração em mol/m3. Retire o primeiro e segundo dados ponto na fase de atraso (ver Figura 2) dos experimentos para evitar erros de montagem possível. Aqui está um exemplo de como o documento de texto pode parecer com:
3540; 0.00216
7140; 0.00724
12240; 0.01707
15180; 0.02230
18660; 0.02697
21540; 0.02931
Este exemplo pode ser usado para testar a simulação. - Adicionar "Objectivo Global de mínimos quadrados" com o botão direito do mouse na "Otimização", anexar o documento de texto da etapa 3.3.4 para os dados"experimentais" e definir a primeira coluna como "tempo coluna 1" com direito clique em "Objectivo Global de quadrados mínimos" e a segunda coluna como "Valor coluna 1" com botão direito do mouse em "Objectivo Global de mínimos quadrados". Na "expressão" da coluna"valor" digite a variável "C".
- Adicione "Controle variáveis globais 1" com botão direito do mouse na "Otimização" e declaram "D_search" como uma variável com o valor inicial "1" e limite inferior "0" limite superior "1000".
- Adicionar "Otimização" com o botão direito do mouse em "Estudo 1" e escolheu "SNOPT" como um método de solucionador de otimização. Defina a tolerância de optimalidade para 1E-9.
Nota: Se a simulação não convergir, aumente a tolerância da Optimalidade. Tenha em mente que a simulação seja imprecisa, se a tolerância de optimalidade é muito grande. - Inicie a otimização de parâmetro com "computação" em "estudo". Não se esqueça de definir o coeficiente de difusão na barreira como "D".
Representative Results
Experimentos de permeabilidade de uma membrana de 96 poços inserir sistema com gel de agarose 2% como uma barreira foram realizados para avaliar a precisão de uma simulação. Sal de sódio de fluoresceína (pregarias) e isotiocianato de fluoresceína-dextranos (FD) foram usados para verificar o impacto do tamanho molecular da substância difusor de 5 x 10-10 m acima de 45 x 10-10 m de raio Stokes (376.27-40.000 mol wt). Otimização de parâmetro nativo da simulação utilizou-se para caber a simulação de dados experimentais.
Para esse fim, encostas das partes apenas lineares da permeabilidade simulada foram comparadas com os resultados experimentais. Para pequenos tamanhos moleculares, simulação e dados experimentais foram em bom acordo com 99,2% para pregarias e 80,2% para FD 4.000 (ver figura 4a e figura 4b). Tamanho molecular maior gerado desvios superiores mostrando correlações de 50,5% para 10.000 FD, 79,7% para 20.000 FD e 53,6% para 40.000 FD. Curva de progressão nas simulações mostrou um atraso no início e um aumento mais forte no curso mais dos gráficos (ver Figura 4 c–4e).
Coeficientes de permeabilidade e coeficientes de difusão simulado são mostrados em tabela 4. O coeficiente de permeação diminui com o aumento de tamanho molecular. Desvio padrão foi entre 0,08 x 10-8 m/s e 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), que correspondeu a um erro absoluto de entre 4,18% e 46.15%. Experimentos com moléculas maiores mostraram um maior erro absoluto. Os coeficientes de difusão simulado comportou-se muito similarmente aos coeficientes de permeabilidade experimental. Substâncias com raios maiores de Stokes mostraram diminuição coeficientes de difusão e o erro absoluto variou entre 9,09% e 18.46% (N = 3).
Em experimentos adicionais de permeação, quatro tipos de modelo de células de colágeno diferentes foram usados como barreiras em uma membrana de 12-bem inserir sistema. Estes modelos incluem um modelo de célula livre e um modelo de celular com diferentes combinações de fibroblastos primários no gel de colágeno e HaCaT na superfície. Foram utilizadas as seguintes combinações: colágeno (col) como um modelo sem célula, colágeno + fibroblastos (Col. + F.), colágeno + HaCaT (Col. + H.) e colágeno, fibroblastos + HaCaT (Col. + f + H.). Sal de sódio de fluoresceína com DMEM + 10% FCS foi utilizado como substância de doador. Para imagem utilizou-se a análise do modelo de células de colágeno, coloração com hematoxilina e eosina (HE). Esta coloração foi feito usando o protocolo do fabricante. Na Figura 5, é mostrada uma mancha com um modelo Col + f + h... O HE manchas ligeiramente a estrutura da matriz de colágeno do tecido. Os fibroblastos estão localizados na matriz, e os núcleos dos fibroblastos e células HaCaT são corados em violeta escura. Sobre a matriz de colagénio, há uma camada que contém muitos núcleos, que devem ser os núcleos de HaCaTs, construindo uma delimitador camada na parte superior do modelo.
Na tabela 5, coeficientes de permeação experimental e coeficientes de difusão simulado são listados. Uma tendência pode ser vista para a maioria dos modelos com HaCaT, que têm coeficientes de permeação/difusão inferiores em comparação com os modelos sem HaCaT. O erro absoluto dos coeficientes de permeação é 10,9-24,4% e para a difusão coeficientes 5.2-12,9%.
Figura 1: vista lateral do experimento em uma membrana de permeabilidade inserir sistema. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: gráfico exemplar de um experimento de permeabilidade. A concentração do aceitador é plotada ao longo do tempo. Duas linhas tracejadas suporte a parte quase linear do gráfico. A inclinação da parte linear é usada para determinar o coeficiente de permeabilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: geometria e malha da membrana inserir sistema na simulação. (a) geometria da membrana 96 poços sistema de inserção. (b), geometria da membrana 12-poços sistema de inserção. sistema de inserção (c), malha da membrana de 96 poços. (d) malha da membrana 12-poços sistema de inserção. (e) seção transversal e parâmetros da membrana inserem sistema. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: comparação dos dados experimentais de uma experiência de permeação para a simulação otimizada. (um) fluoresceína sal de sódio, (b) de fluoresceína isotiocianato-dextrano 4.000 mol peso, peso de mol (c) 10.000, (d) 20.000 mol de peso e peso de mol (e) 40.000 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: representante HE coloração de um modelo de célula de colágeno (fibroblastos, colágeno + HaCaT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: coeficiente de permeabilidade em função do raio 1/Stokes, usando o sal de sódio de fluoresceína e isotiocianato de fluoresceína-dextran em uma membrana de 96 poços inserir sistema. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Experession para 96 sistema bem em mm | Experssion para o sistema de 12-poços em mm | Descrição |
| d_tran | 5.65 [mm] | 14,7 [mm] | Diâmetro do poço |
| d_a | 4.26 [mm] | 12.1 [mm] | Diâmetro da membrana |
| d_w | 8.79 [mm] | 21.97 [mm] | Diâmetro do aceitador |
| h_b | 2 [mm] | 2 [mm] | Heigh da barreira |
| h_sp | 1 [mm] | 1 [mm] | Distância entre o bem e de fundo |
| h_a | 4.73 [mm] | 5.24 [mm] | Alta do aceitador |
| b | h_b/2 | - | Profundidade de imersão |
| r | ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) | - | Raio de bola de imersão+ |
| r_z | r + h_b | - | z-posição da bola de imersão+ |
Tabela 1: parâmetros de geometria para simulação de "Transporte de espécies químicas". + Apenas para ser usado para a simulação de agarose gel em 96 membrana bem inserir sistema.
| Nome | Expressão | Valor | Descrição |
| C_fl | 0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] | 0.26576 mol/m2 | Concentração de Fl.So. |
| C_4 | 2 [mg/ml] / 4000 [g/mol] | 0,5 mol/m2 | Concentração de FD 4.000 |
| C_10 | 2 [mg/ml] / 10000 [g/mol] | 0,2 mol/m2 | Concentração de FD 10.000 |
| C_20 | 2 [mg/ml] / 20000 [g/mol] | 0,1 mol/m2 | Concentração de FD 20.000 |
| C_40 | 2 [mg/ml] / 40000 [g/mol] | 0,05 mol/m2 | Concentração de FD 40.000 |
| Dif_w | 1e-9 [m ^ 2/s] | 1e - 9m2/s | Coeficiente de difusão da água de amassadura |
Tabela 2: Parâmetros físicos para simulação de "Transporte de espécies químicas".
| Nome | Expressão | Descrição |
| C | Acceptor(c) | Definição da concentração aceitador |
| D | D_search * 1e-10 | Mudança de fator para D |
Tabela 3: Parâmetros para simulação de "Otimização".
| Permeiam | Coeficiente de permeabilidade (m/s) x 10-8 | Coeficiente de difusão (m/s2) x 10-10 | Raio de Stokes de permeado (m) x 10-10 |
| Fl.So. | 4,79 ± 0,20 | 1,94 ± 0,34 | 5 |
| FD 4.000 | 2.37 ± 0,31 | 0,65 ± 0,12 | 14 |
| FD10, 000 | 1,67 ± 0,47 | 0,22 ± 0,02 | 23 |
| FD 20.000 | 0,65 ± 0,30 | 0,29 ± 0,04 | 33 |
| FD 40.000 | 0,27 ± 0,08 | 0,14 ± 0,02 | 45 |
Tabela 4: coeficiente de permeabilidade e a difusão de substâncias com raio de Stokes diferente através do gel de Agarose 2% + membrana em uma membrana de 96 poços inserir sistema. (sal de sódio de fluoresceína = FL. So., fitc dextrano = FD).
| Modelo | Coeficiente de permeabilidade (m/s) x 10-8 | Coeficiente de difusão (m/s2) x 10-10 |
| Col. | 2.18 ± 0,29 | 1.22 ± 0,06 |
| Col. + F. | 1,77 ± 0,38 | 0,93 ± 0,12 |
| Col. + H. | 1,64 ± 0,40 | 0,96 ± 0,05 |
| Col. + f + H. | 1,65 ± 0,18 | 0,88 ± 0,11 |
Tabela 5: coeficiente de permeabilidade e a difusão do sal de sódio de fluoresceína através de um modelo de célula de colágeno em um 12-membrana bem inserir sistema (Col. = colágeno, F. = fibroblasto, H. = HaCaT).
Discussion
Este estudo documenta um método desenvolvido para quantificar a permeação através de uma construção de tecido projetada numa membrana. Permeação de substâncias com diferentes tamanhos de moleculares através do gel do agarose analisou-se primeiro para testar e validar o método e a simulação correspondente. É sabido que moléculas menores permeiam mais rápido através de uma malha de matriz (com exceção do efeito em gel filtração por cromatografia de permeabilidade). Observações semelhantes foram feitas com experimentos de tamanho-exclusão de substâncias através da esclera26, membrana epidérmica humano27, pele humana17e de pele de rato28. Uma correlação inversa entre coeficientes de permeabilidade e o correspondente raio de Stokes (o raio de uma esfera dura que se move com a mesma taxa de difusão, como as moléculas descritas, geralmente menores do que o raio eficaz da molécula) tem sido demonstrado 26 , 28e uma relação semelhante foi observada em experimentos com substâncias de diferentes tamanhos moleculares. Plotando-se os coeficientes de permeabilidade ao longo do raio 1/Stokes, verificou-se uma correlação linear sobre os quatro grupos, com o menor tamanho molecular (R2 = 0,93) (Figura 6). Isso indica que coeficientes de permeabilidade simulado com o método sugerido estão em uma escala realista.
O erro de 46.15% nos experimentos é ligeiramente maior do que o relatado por experimentos de permeabilidade com o Franz difusão celular sistema10. Uma explicação possível seria a distribuição de tamanho de fluoresceína-isotiocianato-dextrano, que é discutido mais tarde.
O método descrito tem importantes vantagens em comparação com métodos usando o sistema de célula de difusão de Franz. Em primeiro lugar, a instalação é mais compacta; os experimentos são executados diretamente em um sistema de inserção de membrana, que tem a escala de uma placa bem comercial (∼ 13 x 8,5 cm). Isso permite que várias amostras para serem executados simultaneamente, Considerando que uma célula de difusão de Franz separada é necessária para cada amostra. Em segundo lugar, a permeabilidade de um modelo de pele pode ser medida diretamente na inserção da membrana, onde se realiza o cultivo. Usando células de difusão de Franz, as amostras têm de ser retirado e montado sobre o sistema, que é mais complicado para pequenas amostras e também é mais demorado.
Experimentos de permeação com matrizes de células de colágeno mostraram que esse método pode ser aplicado com sucesso em sistemas celulares-semeado. O modelo apresentado aqui foi verificado para os modelos de pele; no entanto, o método pode ser aplicado a outros tipos de culturas de células orgânicas, por exemplo, renal ou hepática.
Neste estudo, um modelo de colágeno-celular foi usado no qual as células HaCaT coberto completamente a superfície do modelo (ver Figura 5). Isto levou a uma redução do coeficiente de permeabilidade, demonstrando que o método é sensível o suficiente para distinguir o coeficiente de permeabilidade entre um modelo de colágeno-célula com e sem uma camada de HaCaT. Idealmente, um modelo de pele deveria construir uma barreira, que se aproxima da epiderme de uma verdadeira pele de29, e, portanto, é importante verificar a qualidade (e.g., edifício da derme, epiderme) do modelo da pele antes da utilização real. O desenvolvimento de um modelo de pele pode ser visualizado com técnicas de coloração e quantificado de detecção de pele proteína e colágeno30,31,32. O coeficiente de permeabilidade também pode ser um fator importante para avaliar o desenvolvimento do modelo de pele, mas ainda mais experimentos são necessários para confirmar isto. Como mencionado anteriormente, este método permite que várias amostras em execução em paralelo. Também é possível tirar amostras durante o cultivo para medir a permeabilidade e, assim, acompanhar o desenvolvimento deste parâmetro do modelo de pele.
Note-se que a permeabilidade é medida através de um gel/colágeno-celular-modelo e uma membrana simultaneamente. O coeficiente de permeabilidade detectado é específicas do sistema, no qual os resultados de modelos diferentes de pele só podem ser comparados ao usar a mesma inserção de membrana. Além disso, o modelo de pele precisa de cobrir a área de cultivo inteiro para garantir que a substância permeate somente através do modelo e não adjacente a ele, que iria induzir a erros de permeabilidade medida. Outro aspecto que deve ser considerado no futuro experimentos é o ambiente natural em torno da pele. Normalmente, a temperatura da superfície da pele é mais baixa em comparação com a região interna, que pode influenciar as condições de permeação.
A fim de alinhar as experiências de laboratório com simulações de computador, foi apresentado um método que permite a otimização de parâmetro para simulação aplicada. Simulações foram encontradas para coincidir com dados experimentais para substâncias com pequeno tamanho molecular. No entanto, observaram-se desvios entre dados experimentais e de simulação para substâncias com maior tamanho molecular. Polissacarídeo grandes moléculas podem aumentar a fricção e retardar o processo de difusão em um gel. Este efeito provoca difusão anormal, que é uma razão possível para o desvio entre o experimental e simulação os valores de33,34. Outra explicação pode ser a presença de partículas de menores ou maiores em fluoresceína-isotiocianato-dextrano. O fabricante especifica o peso molecular da substância, como o tamanho médio, com um intervalo determinado, que permite que as partículas maiores e menores estar presente. É também incerto dispersos como essas substâncias são, como as partículas menores permeiam mais rápido através do gel e o canal de fluido. É possível estender a simulação para considerar estes difusão e efeitos de atrito.
O experimento de permeabilidade e simulação foram desenvolvidos para uso em um 2-oC. Com a ajuda da simulação, este método experimental pode ser transferido diretamente para as configurações mais sofisticadas de experimentais. Por exemplo, a simulação de sistema de inserção de membrana facilmente pode ser transferida para a geometria de um 2-OC ou outros sistemas com instalações semelhantes. Esta opção de modulação a simulação pode ser usada para apoiar o projeto de experimentos futuros. Além disso, efeitos colaterais, como evaporação, difusão anormal e efeitos de membrana podem ser integrados para reforçar a simulação, melhorando assim a precisão. O programa de simulação dá a oportunidade de alterar ou melhorar a equação de simulação, bem como a integrar outros módulos físicos a fim de investigar outros aspectos do desenvolvimento do modelo de pele. Um exemplo é a simulação da produção de lactato e consumo de glicose em um modelo de células de colágeno.
Um aspecto particularmente interessante no teste de substâncias médicas é como as substâncias são distribuídas em um sistema de órgãos-em-um-microplaqueta. O parâmetro de simulação e permeabilidade minha ajuda para responder a perguntas tais como o quão rápido uma substância permeia o sistema bem como a concentração que estará disponível para outros tecidos em um chip multi-organ. Esse método pode apoiar e reforçar o desenvolvimento e teste de tais sistemas de órgão-em-microplaqueta.
Disclosures
Uwe Marx é o CEO e acionista e Gerd Lindner é uma acionista da TissUse GmbH, uma empresa de fabricação e comercialização da tecnologia MOC. Outros autores não declaram nenhum conflito de interesses sobre a publicação deste artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi criado com o apoio financeiro da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sob concessão não. PO413/12-1 e LA 1028/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Carl Roth | K297.2 | High Resolution Powder |
| Collagen | Serva | 47256.01 | Collagen R solution 0.4 % |
| DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | High Glucose with L-Glutamine |
| FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | Fetal Calf Serum |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | no calcium, no magnesium , with phenol red |
| NaOH | Merck | 1.06467.9010 | granulated |
| PBS | Gibco | 18912-014 | tablets |
| Transwell Cell Culture Inserts | Corning | 3391 | 96 well, 0.4 µm pore size |
| Transwell Cell Culture Inserts | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 well, 0.4 µm pore size |
| Trypsin | Biochrom GmbH | L2143 | with EDTA |
References
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
- Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
- Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
- Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
- Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
- Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
- Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
- Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
- Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
- Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
- Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
- Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
- Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
- Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
- Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
- Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
- Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
- Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
- Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
- Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
- Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
- Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
- Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
- Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
- Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
- Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
- Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
- Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
- Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
- Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).
