En metode til bestemmelse af permeabilitet i en membran indsætte system for multi godt plader og i siliciummangan parameter optimering til beregning af diffusion koefficienter ved hjælp af simulation er præsenteret.
In vitro dyrkede hud modeller er blevet mere og mere relevante for farmaceutiske og kosmetiske programmer, og bruges også i udvikling af lægemidler samt stof test. Disse modeller er for det meste dyrket i membran-Indsæt systemer, deres permeabilitet mod forskellige stoffer, som en væsentlig faktor. Typisk kræver anvendte metoder for bestemmelse af disse parametre, der normalt store stikprøvestørrelser (fx, Franz diffusion celle) eller besværlige udstyr (f.eks., fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP)). Denne undersøgelse præsenterer en metode til bestemmelse af permeabilitet koefficienter direkte i membran-Indsæt systemer med diameter størrelser af 4.26 og 12,2 mm (dyrkningsareal). Metoden blev valideret Agarosen og kollagen geler samt en kollagen celle model repræsenterer hud modeller. Permeation processer af stoffer med forskellige molekylære størrelser og gennemtrængning gennem forskellige cell modeller (bestående af kollagen gel, fibroblast og HaCaT) var præcist beskrevet.
Desuden, for at understøtte ovenstående Eksperimentel metode, en simulation blev etableret. Simuleringen passer forsøgsdata godt for stoffer med små molekylære størrelse, op til 14 x 10-10 m Stokes radius (4.000 MW), og er derfor et lovende redskab til at beskrive systemet. Derudover simuleringen kan betydeligt reducere eksperimentel indsats og er robuste nok til at blive udvidet eller tilpasses mere komplekse opsætninger.
Organo-typisk 3D kulturer er blevet kraftfulde værktøjer til udvikling af lægemidler og stof test1. I denne henseende er menneskelige hud modeller af særlig interesse på grund af lovkrav, som dem i kosmetikindustrien. De har efterfølgende ført til udviklingen af mange 3D hud modeller til brug enten på deres egen som single-orgel kulturer i multi godt plader eller multi-organ-chips i kombination med yderligere orgel modeller, f.eks., at leveren2.
Med hensyn til dyrkning af en hud ækvivalent er air-liquid interface (ALI) et væsentligt element for ordentlig epidermal differentiering3. Celle kultur skær består af en beholder med en væske-permeabel membran i bunden er typisk bruges til at etablere en ALI. ALIs udnyttes bredt i kommercielt tilgængelige hud modeller som EpiDerm4, Phenion5og Episkin6, for kulturen i huden modeller med størrelser fra 96-brønd (4.26 mm i diameter) op til 12-godt (12,2 mm i diameter) plader. Metoden beskrevet her bestemmer gennemtrængning af stoffer i en membran Indsæt system.
Permeabilitetskoefficienten er en betydelig parameter for evaluering af kvaliteten af enhver kulturperler hud-model i forhold til native hud5, og bruges til at vurdere hvordan hurtigt aktivstoffer vandrer gennem huden. Især hvis medicin eller kosmetik produkter skal anvendes på huden, er denne parameter vigtigt at forstå, når netop de overfladeaktive stoffer passerer igennem den. En simulering kan yderligere bidrage til at forudsige opførsel af systemet og efterfølgende reducere den nødvendige tidskrævende eksperimentel indsats, især når en lang række stoffer, der er involveret.
Franz diffusion celle er state-of-the-art for gennemtrængning eksperimenter med hud og hud modeller5,6,7,8,9. Denne enhed består af to rum med en fast prøve (diffusionsspærre) i mellem. Stoffet skal testes anvendes direkte til toppen af prøven (donor rum) og koncentrationen af den gennemsyrer sammensatte kan blive opdaget på den modsatte (acceptor) rum. Acceptor side sikrer konstant temperatur og koncentration af homogene stof gennem en temperatur kammer og en magnetomrører. Prøverne tages fra en prøveudtagning arm i acceptoren side af cellen Franz. Med en højde interval mellem 19 cm og 179 cm er dette system relativt store10,11. En anden metode til bestemmelse af diffusion koefficienter i gel-lignende stoffer og væv er FRAP. Denne teknik bruger princippet om blegning fluorescently mærket partikler i gelen og derefter fastlægge restitutionstid af det blegede område til at beregne diffusion koefficient12,13,14.
Derudover kan Fourier-transformation-infrarød (FTIR) spektroskopi bruges til at registrere partikel bevægelse med infrarødt lys absorbans for at bestemme, hvilken gennemtrængning proces af stoffer i huden15,16. Men disse eller andre Billeddannende metoder (fx, to-foton fluorescens korrelations-spektroskopi17) behøver koste intensiv instrumenter.
I denne artikel præsenteres en metode direkte foranstaltning permeabilitet af en barriere i en membran Indsæt system, hvor huden model kan være dyrket. Denne metode gør det muligt for permeabilitet eksperimenter skal køres med et stort antal små prøver (godt størrelse op til 4.26 mm) i et kompakt system. Dette er i modsætning til Franz diffusion celle, hvor en separat enhed er nødvendig for hver sonde, som skal monteres på enheden og er vanskelige at realisere for små prøver (størrelse af 4.26 mm). Desuden, da metoden ikke kræver store instrumentation (fx, en Konfokal eller multiphoton mikroskop), en reduktion i både tid og omkostninger er opnået.
Alle eksperimenterne blev udført i Mikroporøs membran indsætte systemer med en prøve (barriere) bestående af agarosegel eller en kollagen celle model etableret på membranen. Fluorescerende stoffer (donor) med varierende molekylære størrelser blev anvendt på toppen af prøven, og koncentrationen af gennemsyrede stof blev opdaget i bunden (acceptor) ved hjælp af et fluorescens-Pladelæser (Se figur 1). For at validere metoden og teste rigtigheden af denne simulering, blev agarosegelitris produceret og brugt som en barriere. Hydrogels er generelt bruges til undersøgelse af diffusion og gennemsivning processer i porøst medium i biologiske videnskaber13. Metoden blev derefter testet i en celle-seedede system bestående af en kollagen matrix af primære fibroblaster og menneskelige voksen lavt Calcium høj temperatur keratinocytter (HaCaT) celler (celle-matrix model), som er en forenklet hud model18,19 .
Derudover blev gennemtrængning proces simuleret med flow simuleringer med computational fluid dynamics. Det blev konstateret, at ved hjælp af parameteren optimering, diffusion koefficient kan beregnes ud fra eksperimentelle data. Generelt tilbyder denne simulation forskellige applikationer; for eksempel, det er muligt at forudsige en gennemtrængning proces baseret på korte eksperimenter og simulering kan reducere antallet af eksperimenter.
Eksperimentelle metode og simulering var designet til anvendelse på et orgel-on-a-chip system1,20,21, specielt 2-orgel-chippen (2-OC) udviklet kommercielt1,22, 23,24,25. I princippet kan gennemtrængning processen med nogen orgel model baseret på membran Indsæt systemer beskrives på denne måde.
Denne undersøgelse dokumenterer en metode udviklet til at kvantificere gennemtrængning gennem en væv-konstruere manipuleret på en membran. Gennemtrængning af stoffer med forskellige molekylære størrelser gennem agarosegel blev først undersøgt for at teste og validere metoden og de tilsvarende simulering. Det er velkendt, at mindre molekyler gennemsyre hurtigere gennem en matrix mesh (med undtagelse af effekt i gel filtrering af permeabilitet kromatografi). Lignende observationer blev foretaget med størrelse-udelukkelse eksperimenter af stoffer gennem sclera26, human epidermal membran27, menneskelige hud17og rotte hud28. En invers korrelation mellem permeabilitet koefficienter og den tilsvarende Stokes radius (radius af en hård kugle, der bevæger sig med den samme diffusion sats som molekyler beskrevet, normalt mindre end den effektive radius af molekylet) har vist sig 26 , 28, og et lignende forhold blev observeret i eksperimenter med stoffer i forskellige molekylære størrelser. Ved at plotte permeabilitet koefficienterne over 1/Stokes radius, en lineær korrelation over de fire grupper med den mindste molekylære størrelse blev fundet (R2 = 0,93) (figur 6). Dette angiver, simulerede permeabilitet koefficienter med metoden foreslog i en realistisk rækkevidde.
Fejl på 46.15% i forsøgene er lidt større end rapporteret for permeabilitet eksperimenter med Franz diffusion celle system10. En mulig forklaring kunne være størrelse fordelingen af fluorescein-isothiocyanat-dextran, der diskuteres senere.
Den beskrevne metode har vigtige fordele sammenlignet med metoder, Franz diffusion celle system. For det første, setup er mere kompakt; Forsøgene udføres direkte i en membran Indsæt system, som har skala af en kommerciel godt plade (∼ 13 cm x 8,5 cm). Dette gør det muligt for flere prøver, der skal køres samtidigt, en separat Franz diffusion celle er nødvendigt for hver enkelt prøve. For det andet kan permeabilitet af huden model måles direkte i membranen Indsæt, hvor dyrkningen foregår. Ved hjælp af Franz diffusion celler, skal og prøverne tages og monteres på det system, som er mere besværligt for små prøver og er også mere tidskrævende.
Permeation eksperimenter med kollagen celle matricer viste, at denne metode kan anvendes med succes på celle-seedede systemer. Modellen præsenteres her blev kontrolleret for hud modeller; metoden kan dog anvendes til andre typer af økologisk cellekulturer, fx, nyre eller lever.
I denne undersøgelse, en kollagen-celle model blev brugt som HaCaT cellerne helt dækket modeloverfladen (Se figur 5). Dette førte til en reduktion af permeabilitetskoefficienten, viser, at metoden er følsom nok til at skelne permeabilitetskoefficienten mellem kollagen-celle model med og uden et lag af HaCaT. Ideelt, en hudmodel bør opbygge en barriere, der nærmer sig epidermis af en reel hud29, og det er derfor vigtigt at kontrollere kvalitet (fx, bygning af dermis, epidermis) af hudmodel før faktiske brug. Udvikling af en model, huden kan visualiseres med farvning teknikker og kvantificeres fra påvisning af huden protein og kollagen30,31,32. Permeabilitetskoefficienten kan også være en vigtig faktor for vurderingen af udviklingen af modellens huden, men yderligere eksperimenter er forpligtet til at bekræfte dette. Som tidligere nævnt, giver denne metode mulighed for parallelt flere prøver. Det er også muligt at udtage prøver under dyrkning at måle permeabilitet, og dermed iagttage udviklingen af denne parameter af modellens huden.
Det skal bemærkes, at permeabilitet er målt ved hjælp af en gel/kollagen-celle-model og en membran samtidigt. Den fundne permeabilitetskoefficienten er systemspecifikke, hvorved resultaterne af forskellige hud modeller kun kan sammenlignes når du bruger den samme membran Indsæt. Desuden, huden model skal dække den hele dyrkningsareal for at sikre, at test-kemikaliets vil gennemsyre kun gennem modellen og ikke støder op til det, som ville fremkalde fejl i permeabilitet målt. Et andet aspekt, der bør overvejes i fremtiden eksperimenter er det naturlige miljø omkring huden. Normalt, er hudens overflade temperatur lavere i forhold til den indre region, som kan få indflydelse på gennemtrængning betingelser.
For at justere lab eksperimenter med computersimulationer, blev en metode, som giver mulighed for parameter optimering for anvendt simulation præsenteret. Simuleringer blev fundet til at falde sammen med eksperimentelle data for stoffer med små molekylære størrelser. Dog blev afvigelser mellem simulering og eksperimentelle data observeret for stoffer med større molekylære størrelser. Store polysaccharid molekyler kan øge friktion og bremse udbredelsen proces i en gel. Denne effekt forårsager unormal diffusion, som er en mulig årsag til afvigelsen mellem eksperimentelle og simulation værdier33,34. En anden forklaring kan være tilstedeværelsen af mindre eller større partikler i fluorescein isothiocyanat dextran. Fabrikanten angiver molekylvægt af stoffet som den gennemsnitlige størrelse med et givet område, som giver mulighed for større og mindre partikler til stede. Det er også uklart hvordan spredte disse stoffer er, som de mindre partikler gennemsyre hurtigere gennem gel og væske-kanal. Det er muligt at udvide simulering for at overveje disse diffusion og friktion effekter.
Permeabilitet eksperiment og simulation blev udviklet til brug i en 2-OC. Med hjælp fra simuleringen, kan denne eksperimentelle metode overføres direkte til mere avancerede eksperimentelle opsætninger. Membran Indsæt system simulering kan for eksempel nemt overføres til en 2-OC geometri eller til andre systemer med lignende set-ups. Denne indstilling af modulerende simulering kan bruges til at støtte udformningen af fremtidige eksperimenter. Derudover kan bivirkninger såsom fordampning, unormal diffusion og membran effekter integreres for at forbedre simulation, dermed forbedre nøjagtighed. Simulation program giver mulighed for at ændre eller forbedre simulation ligning, samt for at integrere andre fysiske moduler for at undersøge andre aspekter af huden modeludvikling. Et eksempel er simulering af glucose forbrug og laktat produktion i en kollagen celle model.
Et særligt interessant aspekt til afprøvning af medicinske stoffer er, hvordan stofferne, der er fordelt i et orgel-on-a-chip-system. Parameteren simulering og permeabilitet min hjælp til at besvare spørgsmål, såsom hvor hurtigt et stof, der gennemsyrer ind i systemet og hvilken koncentration vil være tilgængelige for andre væv i en multi-organ-chip. Denne metode kan støtte og forbedre udvikling og afprøvning af sådant orgel-on-chip systemer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev skabt med finansiel støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under grant nr. PO413/12-1 og LA 1028/7-1.
Agarose | Carl Roth | K297.2 | High Resolution Powder |
Collagen | Serva | 47256.01 | Collagen R solution 0.4 % |
DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | High Glucose with L-Glutamine |
FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | Fetal Calf Serum |
Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | no calcium, no magnesium , with phenol red |
NaOH | Merck | 1.06467.9010 | granulated |
PBS | Gibco | 18912-014 | tablets |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning | 3391 | 96 well, 0.4 µm pore size |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 well, 0.4 µm pore size |
Trypsin | Biochrom GmbH | L2143 | with EDTA |