En metode for bestemmelse av permeabilitet i en membran sett systemet for flere bra plater og i sili parameteren optimalisering for beregning av diffusjon koeffisienter bruker simulering presenteres.
In vitro dyrket huden modeller har blitt stadig viktigere for farmasøytisk og kosmetisk programmer, og brukes også i narkotika utvikling, samt stoff tester. Disse modellene er hovedsakelig dyrket i membran-sette systemer, deres permeabilitet mot forskjellige stoffer er en viktig faktor. Vanligvis krever anvendt metoder for fastsettelse av disse parameterne vanligvis store utvalgene (f.eks, Franz diffusjon celle) eller arbeidskrevende utstyr (f.eks, fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP)). Denne studien presenterer en metode for å bestemme permeabilitet koeffisienter direkte i membran-sette systemer med diameter størrelser 4.26 mm og 12.2 mm (dyrking område). Metoden ble validert med agarose og kollagen gels samt en kollagen celle modell som representerer huden modeller. Gjennomtrengning prosessene av stoffer med forskjellige molekylær størrelser og gjennomtrengning gjennom ulike celle modellene (bestående av kollagen gel, fibroblast og HaCaT) var nøyaktig beskrevet.
Videre, for å støtte metoden ovenfor eksperimentelle, en simulering ble etablert. Simuleringen passer eksperimentelle data for stoffer med små molekylære størrelse, opp til 14 x 10-10 m Stokes radius (4000 MW), og er derfor et lovende verktøy for å beskrive systemet. Videre simuleringen kan betydelig redusere eksperimentelle arbeidet og er robuste nok til å bli utvidet eller tilpasset mer komplekse oppsett.
Organo-typisk 3D kulturer har blitt kraftig verktøy for narkotika utvikling og stoff tester1. I denne forbindelse er menneskehud modeller av spesiell interesse regulatoriske krav, som de i kosmetikkindustrien. De har senere førte til utviklingen av mange 3D huden modeller for bruk på egenhånd som enkelt-orgel kulturer multi bra plater eller multi-organ-chips i kombinasjon med ekstra orgel modeller, f.eks, lever2.
Når det gjelder dyrking av huden tilsvarende er air-flytende grensesnittet (ALI) en grunnforutsetning for riktig epidermal differensiering3. Celle kultur setter består av et fartøy med en flytende-gjennomtrengelig membran nederst brukes vanligvis til å etablere ALI. ALIs benyttes mye i kommersielt tilgjengelig huden modeller som EpiDerm4, Phenion5og Episkin6av huden modeller med størrelser fra 96-brønnen (4.26 mm i diameter) regler for opp til 12-vel (12.2 mm i diameter) plater. Metoden beskrevet her bestemmer gjennomtrengning av stoffer i en membran sett inn system.
Den permeabilitet koeffisienten er en viktig parameter for å vurdere kvaliteten på noen kulturperler hud-modell i forhold til opprinnelige huden5, og brukes til å vurdere hvor raskt aktive stoffer vandrer gjennom huden. Spesielt hvis narkotika eller kosmetikk produkter må brukes på huden, er denne parameteren viktig å forstå når nøyaktig den aktive agenter passerer gjennom den. En simulering kan videre hjelpe å forutsi oppførselen til systemet og deretter redusere den nødvendige tidkrevende eksperimentelle innsatsen, særlig når en rekke stoffer er involvert.
Franz diffusjon cellen er state-of-the-art gjennomtrengning eksperimenter med hud og hud modeller5,6,7,8,9. Denne enheten består av to deler med et fast utvalg (diffusjon barriere) i mellom. Stoffet skal testes brukes direkte på toppen av prøven (donor rom) og konsentrasjonen av permeating sammensatte kan oppdages på motsatt (acceptor) rommet. På siden acceptor sikres konstant temperatur og homogen stoff konsentrasjon gjennom en temperatur kammer og en magnetisk rørestang. Prøver kan bli tatt fra en prøvetaking arm på acceptor side av Franz cellen. Med en høyde varierer mellom 19 cm og 179 cm er dette systemet relativt stor10,11. En annen metode for fastsettelse av diffusjon koeffisientene i gel-lignende stoffer og vev er FRAP. Denne teknikken bruker prinsippet om bleking fluorescently merket partikler i gel, og deretter bestemme gjenopprettingstiden av området bleket for å beregne diffusjon koeffisienten12,13,14.
Videre kan Fourier-transform-infrarød (FTIR) spektroskopi brukes til å oppdage partikkel bevegelse med infrarødt lys absorbansen for å bestemme gjennomtrengning prosessen av stoffer i huden15,16. Imidlertid må disse eller andre tenkelig metoder (f.eks, to-fotonet fluorescens korrelasjon spektroskopi17) koste intensiv instrumenter.
I denne artikkelen, er en metode presentert for direkte mål permeabilitet av en barriere i en membran sett inn systemet, hvor huden modell kan dyrkes. Denne metoden kan permeabilitet eksperimenter kjøres med et stort antall små utvalg (vel størrelse opp til 4.26 mm) i et kompakt system. Dette er Franz diffusjon cellen, der en separat enhet kreves for hver probe, som må monteres på enheten og er vanskelig å forstå for små (størrelse 4.26 mm). Videre, siden metoden ikke krever store instrumentation (f.eks, mikroskop AC confocal eller multiphoton), en reduksjon i både tid og kostnader er oppnådd.
Alle forsøkene ble utført i mikroporøs membran sett systemer med en prøve (barriere) som består av agarose gel eller en kollagen celle modell på membranen. Fluorescerende stoffer (giveren) med varierende molekylær størrelser ble anvendt på toppen av prøven, og konsentrasjonen av gjennomsyret stoffet ble oppdaget på bunnen (acceptor) med en fluorescens plate leser (se figur 1). For å validere metoden og teste ut nøyaktigheten av denne simuleringen, ble agarose gels produsert og brukes som en barriere. Hydrogels brukes generelt for etterforskningen av diffusjon og gjennomtrengning prosesser i porøse medium i biologi13. Metoden ble testet i en celle-seeded system består av en kollagen matrise av primære fibroblaster og menneskelige voksne lav kalsium høy temperatur keratinocytter (HaCaT) cellene (celle-matrix modell), som er en forenklet hudpleie modell18,19 .
I tillegg var gjennomtrengning prosessen simulert med flyt simuleringer med computational fluid dynamics. Det ble funnet at ved hjelp av parameteren optimalisering, diffusjon koeffisient kan bli beregnet fra eksperimentelle data. Generelt tilbyr denne simuleringen forskjellige programmer. for eksempel, er det mulig å forutse en gjennomtrengning prosess basert på kort eksperimenter og simuleringen kan redusere antall eksperimenter.
Eksperimentell metode og simulering ble beregnet til påføring på orgel på-chip systemet1,20,21, spesielt 2-orgel-brikken (2-OC) utviklet kommersielt1,22, 23,24,25. I prinsippet kan gjennomtrengning prosessen med noen orgel modell basert på membran sett inn systemer beskrives på denne måten.
Denne studien dokumenter en metode utviklet for å kvantifisere gjennomtrengning gjennom en vev-konstruere konstruert på en membran. Gjennomtrengning av stoffer med varierende molekylær størrelser gjennom agarose gel ble først undersøkt for å teste og validere metoden og tilhørende simuleringen. Det er velkjent at mindre molekyler gjennomsyre raskere gjennom en matrix-maske (med unntak av effekten i gel filtrering av permeabilitet kromatografi). Lignende observasjoner ble gjort med størrelse-utestenging eksperimenter stoffer gjennom sclera26, menneskelige epidermal membran27, menneskelig hud17og rotten huden28. En invers korrelasjon mellom permeabilitet koeffisienter og tilsvarende Stokes radius (radius av en hard kule som flytter med samme spredningen rate som molekyler beskrevet, vanligvis mindre enn effektiv radius av molekylet) har vist 26 , 28, og en tilsvarende forholdet ble observert i eksperimenter med stoffer i ulike molekylær størrelser. En lineær sammenheng over fire grupper med den minste molekylær størrelsen funnet ved å plotte permeabilitet koeffisientene over 1/Stokes radius, (R2 = 0.93) (figur 6). Dette angir at simulert permeabilitet koeffisienter med metoden foreslått i en realistisk området.
Feil på 46.15% i forsøkene er litt større enn rapportert permeabilitet eksperimenter med Franz diffusjon cellen systemet10. En mulig forklaring kan være størrelsesDistribusjon av fluorescein-isothiocyanate-dekstran, som er omtalt senere.
Metoden beskrevet har viktige fordeler sammenlignet med ved hjelp av Franz diffusjon cellen systemet. For det første er oppsettet mer kompakt; eksperimenter utføres direkte i en membran sett inn system, hvilke har omfanget av en kommersiell godt plate (∼ 13 cm x 8,5 cm). Dette gjør at flere prøver å bli løpe samtidig, mens en egen Franz diffusjon celle er nødvendig for hvert utvalg. Dernest kan permeabilitet av huden modell direkte måles i membranen innsatsen, hvor dyrking finner sted. Bruke Franz diffusjon celler, har prøvene tatt ut og montert på systemet, som er mer tungvint for små og er også mer tidkrevende.
Gjennomtrengning eksperimenter med kollagen celle matriser viste at denne metoden kan brukes med hell til celle-seeded systemer. Modellen presentert her ble bekreftet for huden modeller; metoden kan imidlertid brukes på andre typer organisk cellekulturer, f.eks, nyre eller lever.
I denne studien kollagen-celle modell ble brukt som HaCaT cellene helt dekket modelloverflaten (se figur 5). Dette ført til en reduksjon av permeabilitet koeffisienten, demonstrere at metoden er sensitive nok til å skille permeabilitet koeffisient mellom kollagen-celle modell med og uten en HaCaT. Ideelt sett huden modell skal bygge opp en barriere, som nærmer seg epidermis, en ekte huden29, og det er derfor viktig å kontrollere kvaliteten (f.eks, bygging av dermis, overhuden) på huden modellen før faktisk bruk. Utviklingen av en hud-modell kan visualisere med flekker teknikker og kvantifisert fra påvisning av huden protein og collagen30,31,32. Den permeabilitet koeffisienten kan også være en viktig faktor for å vurdere utviklingen av huden modellen, men ytterligere eksperimenter kreves for å bekrefte dette. Som tidligere nevnt kan denne metoden kjører flere eksempler parallelt. Det er også mulig å ta prøver under dyrking å måle permeabilitet, og dermed observere utviklingen av denne parameteren av huden modellen.
Det bør bemerkes at permeabilitet måles gjennom en gel/kollagen-celle-modell og en membran samtidig. Oppdaget permeabilitet koeffisient er system-spesifikk, der resultatene av ulike huden modeller kan bare sammenlignes ved samme membran innsatsen. Videre må hud modellen dekke hele dyrking området for å sikre at testen stoffet vil gjennomsyre gjennom modellen og ikke tilstøtende, som ville forårsake feil i permeabilitet målt. Et annet aspekt som bør vurderes i fremtiden eksperimenter er naturmiljøet rundt huden. Normalt er temperaturen på hudoverflaten lavere i forhold til indre regionen, som kan påvirke gjennomtrengning forhold.
For å justere lab eksperimenter med datasimuleringer, ble en metode som gjør at parameteren optimalisering for anvendt simulering presentert. Simuleringer fant sammenfaller også med eksperimentelle data for stoffer med liten molekylær størrelse. Imidlertid ble avvik mellom simulering og eksperimentelle data observert for stoffer med større molekylær størrelser. Store polysakkarid molekyler kan øke friksjon og tregere diffusjon prosessen i en gel. Dette forårsaker unormale diffusjon, som er en mulig årsak til avviket mellom eksperimentelle og simulering verdier33,34. En annen forklaring kan være tilstedeværelsen av mindre eller større partikler i fluorescein-isothiocyanate-dekstran. Produsenten angir molekylvekt av stoffet som betyr størrelsen med et gitt område, som gir mindre og større partikler til stede. Det er også uklart hvor spredt disse stoffene er, som mindre partikler gjennomsyre raskere gjennom gel og væske kanalen. Er det mulig å utvide simuleringen å vurdere disse diffusjon og friksjon effekter.
Den permeabilitet eksperiment og simulering ble utviklet for bruk i en 2-OC. Med hjelp av simuleringen, kan denne eksperimentell metode direkte overføres til mer avanserte eksperimentelle oppsett. Membran sett inn systemet simuleringen kan for eksempel enkelt overføres geometrien for en 2-OC eller andre systemer med lignende oppsett. Dette alternativet av modulerende simuleringen kan brukes til støtte for utformingen av senere eksperimenter. I tillegg kan bivirkninger som fordampning, unormal diffusjon og membran effekter integreres bedre simulering, og dermed bedre nøyaktighet. Simulering programmet gir muligheten til å endre eller forbedre simulering ligningen, samt for å integrere andre fysiske moduler for å undersøke andre aspekter av skin modellen utvikling. Et eksempel er simulering av glukose forbruk og laktat produksjon i kollagen celle modell.
En spesielt interessant aspekt i testing av medisinske stoffer er hvordan stoffer er fordelt i et organ-on-a-chip system. Parameteren simulering og permeabilitet min hjelp å besvare spørsmål som hvor raskt et stoff som gjennomsyrer i systemet og som konsentrasjon vil være tilgjengelig for andre vev i en multi-organ-chip. Denne metoden kan støtte og styrke utvikling og testing av slike orgel-on-chip-systemer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble opprettet med økonomisk støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under grant. PO413/12-1 og LA 1028/7-1.
Agarose | Carl Roth | K297.2 | High Resolution Powder |
Collagen | Serva | 47256.01 | Collagen R solution 0.4 % |
DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | High Glucose with L-Glutamine |
FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | Fetal Calf Serum |
Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | no calcium, no magnesium , with phenol red |
NaOH | Merck | 1.06467.9010 | granulated |
PBS | Gibco | 18912-014 | tablets |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning | 3391 | 96 well, 0.4 µm pore size |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 well, 0.4 µm pore size |
Trypsin | Biochrom GmbH | L2143 | with EDTA |