En metod för bestämning av permeabilitet i ett membran infoga system för plattor med flera och i silico parametern optimering för beräkning av Diffusionskoefficienterna med hjälp av simulering presenteras.
In vitro odlade hud modeller har blivit alltmer relevant för farmaceutiska och kosmetiska applikationer, och används också i läkemedelsutveckling samt ämnet tester. Dessa modeller är mestadels odlas i membran-infoga system, deras permeabilitet mot olika ämnen är en viktig faktor. Vanligtvis, tillämpade metoder för bestämning av dessa parametrar kräver oftast stora urvalsstorlekar (t.ex., Franz diffusion cell) eller mödosamma utrustning (t.ex., fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP)). Denna studie presenterar en metod för bestämning av permeabilitet koefficienter direkt i membran-infoga system med diameter storlekar 4,26 mm och 12,2 mm (odlingområde). Metoden validerades med agarosgelelektrofores och kollagen geler samt en kollagen cell modell som representerar hud modeller. Permeation processerna för ämnen med olika molekylära storlekar och genomträngning genom annan cellmodeller (bestående av kollagen gel och fibroblast HaCaT) var korrekt beskrivna.
Dessutom stöd för ovanstående experimentell metod, var en simulering etablerad. Simuleringen passar experimentella data för ämnen med liten molekylstorlek, upp till 14 x 10-10 m Stokes radie (4 000 MW), och är därför ett lovande verktyg för att beskriva systemet. Dessutom simuleringen kan avsevärt minska experimentella insatserna och är tillräckligt robust för att fördjupa eller anpassade till komplexare uppställningar.
Organo-typiska 3D kulturer har blivit kraftfulla verktyg för läkemedelsutveckling och ämne test1. I detta avseende är mänsklig hud modeller av särskilt intresse på grund av myndighetskrav, till exempel i kosmetikaindustrin. De har därefter lett till utvecklingen av många 3D hud modeller, för användning antingen på sina egna som singel-orgel kulturer i plattor med flera eller multi-organ-chips i kombination med ytterligare orgel modeller, t.ex., levern2.
När det gäller odling av en hud motsvarande är luft-vätska gränssnittet (ALI) avgörande för korrekt epidermal differentiering3. Cell kultur skär består av ett kärl med en vätska-permeable membranet längst vanligtvis används för att upprätta en ALI. ALIs är allmänt utnyttjas i kommersiellt tillgängliga hud modeller såsom EpiDerm4, Phenion5och Episkin6, för kulturen i huden modeller med storlekar från 96 brunnar (4,26 mm i diameter) upp till 12-brunn (12,2 mm i diameter) plattor. Den metod som beskrivs här bestämmer genomträngning av ämnen i ett membran infoga system.
Permeabilitetskoefficienten är en viktig parameter för att utvärdera kvaliteten på alla odlade hud-modellen jämfört med infödda hud5, och används för att bedöma hur snabbt verksamma ämnen vandrar genom huden. Särskilt om läkemedel eller kosmetika produkter behöver appliceras på huden, är denna parameter viktigt att förstå när just de aktiva agenterna passera genom den. En simulering kan ytterligare bidra till att förutsäga beteendet hos systemet och därefter minska det krävs tidskrävande experimentella arbetet, särskilt när ett stort antal ämnen är involverat.
Franz diffusion cellen är state-of-the-art för genomträngning experiment med hud och hud modeller5,6,7,8,9. Denna enhet består av två fack med ett fast prov (diffusionsspärr) mellan. Ämnen som testas appliceras direkt på toppen av provet (givare fack) och koncentrationen av permeating föreningen kan upptäckas på motsatta (acceptor) fack. På acceptor sida säkerställs konstant temperatur och homogen koncentration genom en temperatur-kammare och en magnetisk omrörare. Prover kan tas från en provtagning arm på acceptor sida av cellen Franz. Med en höjd varierar mellan 19 cm och 179 cm är detta system relativt stora10,11. En annan metod för bestämning av Diffusionskoefficienterna i gel-liknande ämnen och vävnader är FRAP. Denna teknik använder principen om blekning fluorescently märkt partiklar i gelen och sedan bestämma tiden för återhämtning av blekt området för att beräkna diffusion koefficient12,13,14.
Fourier-transform-infraröd (FTIR) spektroskopi kan dessutom användas för att upptäcka partikel rörelse med infraröd ljusabsorbans för att fastställa permeation processen av ämnen i huden15,16. Dock behöver dessa eller andra avbildningsmetoder (t.ex., två-photon fluorescens korrelation spektroskopi17) kosta intensiv instrument.
I denna artikel presenteras en metod att direkt mäta genomträngligheten av en barriär i ett membran infoga system, där en hud modell kan odlas. Denna metod gör permeabilitet experiment ska köras med ett stort antal små prover (väl storlek upp till 4,26 mm) i ett kompakt system. Detta är i motsats till Franz diffusion cellen, där en separat enhet behövs för varje sond, som måste monteras på enheten och är svårt att inse för små prover (storleken på 4,26 mm). Eftersom metoden inte kräver stora instrumentering (t.ex., en confocal eller multiphoton Mikroskop), uppnås dessutom en minskning av både tid och kostnader.
Alla experimenten utfördes i mikroporös membran infoga system med ett prov (barriär) bestående av agarosgel eller en kollagen cell modell etablerade på membranet. Fluorescerande ämnen (givare) med varierande molekylära storlekar tillämpades till toppen av provet, och koncentrationen av genomsyras ämnet upptäcktes på botten (acceptor) använder en Plattläsare med fluorescens (se figur 1). För att validera metoden och testa riktigheten i denna simulering, agaros gel producerades och använde som en barriär. Hydrogeler används oftast för utredning av diffusion och permeation processer i poröst medium i biologiska vetenskaper13. Metoden testades sedan i en cell-seedade system bestående av en kollagen matris av primära fibroblaster och mänskliga vuxen låg kalcium hög temperatur keratinocyter (HaCaT) celler (cell-matrix modell), som är en förenklad hud modell18,19 .
Dessutom var permeation processen simuleras med hjälp av flödet simuleringar med computational fluid dynamics. Det konstaterades att den diffusionskoefficienten med hjälp av parametern optimering, kunde beräknas från experimentella data. I allmänhet erbjuder denna simulering olika applikationer; exempelvis är det möjligt att förutsäga en genomträngning process baserat på kort experiment och simulering kan avsevärt minska antalet experiment.
Experimentell metod och simulering var avsedd för applicering på en organ-på-ett-chip system1,20,21, specifikt 2-orgel-chip (2-OC) utvecklat kommersiellt1,22, 23,24,25. I princip kan genomträngning processen någon orgel modell baserat på Infoga membransystem beskrivas på detta sätt.
Denna studie dokumenterar en metod utvecklad för att kvantifiera genomträngning genom en vävnad-konstruktion konstruerad på ett membran. Genomträngning av ämnen med varierande molekylära storlekar genom agarosgel undersöktes först för att testa och validera metoden och den motsvarande simuleringen. Det är väl känt att mindre molekyler genomsyra snabbare genom en matris mesh (med undantag av effekten i gelfiltrering av permeabilitet kromatografi). Liknande observationer gjordes med storlek-utslagning experiment av ämnen genom sklera26, human epidermal membran27, mänsklig hud17och råtta hud28. En omvänd korrelation mellan permeabilitet koefficienter och motsvarande Stokes radien (radien av en hård sfär som rör sig med samma diffusion takt som molekylerna beskrivs, vanligtvis mindre än effektiva radien av molekylen) har visat 26 , 28, och ett liknande förhållande observerades i experiment med ämnen av olika molekylära storlekar. Genom att rita permeabilitet koefficienter över 1/Stokes radie, en linjär korrelation över de fyra grupperna med minsta molekylära storlek hittades (R2 = 0,93) (figur 6). Detta indikerar att simulerade permeabilitet koefficienter med metoden föreslog i en realistisk utbud.
Felet för 46,15% i experimenten är något större än vad som rapporterats för permeabilitet experiment med Franz diffusion cell system10. En möjlig förklaring skulle kunna vara storleksfördelning av fluorescein-isotiocyanat-dextran, vilket diskuteras senare.
Den metod som beskrivs har viktiga fördelar jämfört med metoder med hjälp av Franz diffusion cellen systemet. För det första är installationen mer kompakt; experimenten utförs direkt i ett membran infoga system, vilken har omfattningen av en kommersiell väl platta (∼ 13 cm x 8,5 cm). Detta möjliggör flera prover ska köras samtidigt, medan en separat Franz diffusion cell behövs för varje prov. För det andra kan genomträngligheten av en hud modell mätas direkt i membranet Infoga, där odlingen sker. Med Franz diffusion celler, måste proverna tas och monteras på systemet, som är mer betungande för små prover och är också mer tidskrävande.
Permeation experiment med kollagen cell matriser visade att denna metod kan tillämpas framgångsrikt till cell-seedade system. Den modell som presenteras här har verifierats för huden modeller; men kan metoden tillämpas på andra typer av organiska cellkulturer, t.ex., njur- eller leverproblem.
I denna studie användes en kollagen-cell modell där HaCaT celler helt täckt modellens yta (se figur 5). Detta ledde till en minskning av permeabilitetskoefficienten, visar att metoden är tillräckligt känslig för att skilja permeabilitetskoefficienten mellan en kollagen-cell modell med och utan ett lager av HaCaT. Helst en hud modell bör bygga upp en barriär, som närmar sig epidermisen av en riktig hud29, och det är därför viktigt att kontrollera kvaliteten (t.ex., byggnaden av dermis, epidermis) av hud modell före faktiska användning. Utvecklingen av en hud modell kan visualiseras med färgningsteknik och kvantifieras från detektion av huden protein och kollagen30,31,32. Permeabilitetskoefficienten kan också vara en viktig faktor för att bedöma utvecklingen av huden modellen, men ytterligare experiment krävs för att bekräfta detta. Som tidigare nämnts kan denna metod kör flera prover parallellt. Det är också möjligt att ta prov under odling att mäta permeabilitet och därmed följa utvecklingen av denna parameter av hud modell.
Det bör noteras att permeabilitet mäts genom en gel/kollagen-cell-modell och membran samtidigt. Upptäckta permeabilitetskoefficienten är systemspecifik, whereby resultaten av olika hud modeller endast kan jämföras när du använder samma membran vändskär. Dessutom behöver huden modellen omfattar hela odling för att säkerställa att testsubstansen kommer genomsyra endast genom modellen och inte intill det, som skulle framkalla fel i permeabiliteten mätt. En annan aspekt som bör beaktas i framtida experiment är den naturliga miljön som omger huden. Temperaturen på ytan av huden är vanligtvis lägre jämfört med regionen inre, vilket kan påverka permeation villkor.
För att anpassa labbexperiment med datorsimuleringar, presenterades en metod som möjliggör parametern optimering för tillämpad simulering. Simuleringar visar att de sammanfaller väl med experimentella data för ämnen med små molekylära storlekar. Dock observerades avvikelser mellan simulering och experimentella data för ämnen med större molekylära storlekar. Stora polysackarid molekyler kan öka friktionen och långsam diffusion processen i en gel. Denna effekt orsakar onormal diffusion, vilket är en möjlig orsak till avvikelsen mellan experimentell och simulering värden33,34. En annan förklaring kan vara förekomst av mindre eller större partiklar i fluorescein-isotiocyanat-dextran. Tillverkaren anger molekylvikten för ämnet som den genomsnittliga storleken med ett givet intervall, vilket gör att mindre och större partiklar att närvara. Det är också oklart hur spridda dessa ämnen är, som de mindre partiklarna genomsyra snabbare genom gelen och vätska kanalen. Det är möjligt att förlänga simuleringen att överväga dessa diffusion och friktion effekter.
Den permeabilitet experiment och simulering har utvecklats för användning i en 2-OC. Med hjälp av simulering, kan denna experimentella metod överföras direkt till mer sofistikerade försöksuppställningar. Exempelvis kan den membran infoga systemsimulering enkelt överföras till geometrin för en 2-OC eller till andra system med liknande uppställningar. Denna möjlighet för modulerande simuleringen kan användas för att stödja utformningen av framtida experiment. Dessutom kan biverkningar såsom avdunstning, onormal diffusion och membran effekter integreras för att förbättra simuleringen, därigenom förbättra noggrannhet. Programmet simulering ger möjlighet att ändra eller förbättra simulering ekvationen, samt för att integrera andra fysiska moduler för att undersöka andra aspekter av hud modellutveckling. Ett exempel är simulering av produktion av glukos förbrukning och laktat i kollagen cell modell.
En särskilt intressant aspekt för testning av Mediciniska substanser är hur ämnena fördelas i ett organ-på-ett-chip system. Simulering och permeabilitet parametern min hjälp att besvara frågor såsom hur snabbt ett ämne genomsyrar i systemet samt vilken koncentration kommer att vara tillgängliga för andra vävnader i en multi-organ-chip. Denna metod kan stödja och stärka utvecklingen och testningen av sådana organ-på-chip system.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete skapades med ekonomiskt stöd från Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) under lån nej. PO413/12-1 och LA 1028/7-1.
Agarose | Carl Roth | K297.2 | High Resolution Powder |
Collagen | Serva | 47256.01 | Collagen R solution 0.4 % |
DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | High Glucose with L-Glutamine |
FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | Fetal Calf Serum |
Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | no calcium, no magnesium , with phenol red |
NaOH | Merck | 1.06467.9010 | granulated |
PBS | Gibco | 18912-014 | tablets |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning | 3391 | 96 well, 0.4 µm pore size |
Transwell Cell Culture Inserts | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 well, 0.4 µm pore size |
Trypsin | Biochrom GmbH | L2143 | with EDTA |