Summary
Beschrijven we een niet-invasieve multimodale aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordelingvan de muismodel van lung fibrosis geïnduceerd door dubbele intratracheale instillatietest van bleomycine imaging.
Abstract
Idiopathische longfibrose (IPF) is een dodelijke longziekte, gekenmerkt door de geleidelijke en onomkeerbare vernietiging van Long architectuur, waardoor significante verslechtering in de longfunctie en daaropvolgende dood van respiratoire insufficiëntie.
De pathogenese van IPF in experimentele dierlijke modellen heeft zijn geïnduceerd door bleomycine administratie. In deze studie onderzoeken we een IPF-achtige muismodel geïnduceerd door een dubbele intratracheale bleomycine instillation. Standaard histologische evaluaties gebruikt voor het bestuderen van de Long-fibrose zijn invasieve terminal procedures. Het doel van dit werk is volgen lung fibrosis via noninvasive beeldvormingstechnieken zoals fluorescerende moleculaire tomografie (FMT) en Micro-CT. Deze twee technologieën gevalideerd met de bevindingen van de histologie kunnen vertegenwoordigen een revolutionaire functionele aanpak voor real-time niet-invasieve monitoring van IPF ziekte ernst en progressie. De fusie van verschillende benaderingen stap een verder voor het begrijpen van de IPF ziekte, waar de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden in een pathologische aandoening kunnen worden waargenomen met FMT en de daaropvolgende anatomische veranderingen kunnen worden gecontroleerd door Micro-CT.
Introduction
Idiopathische longfibrose (IPF) is chronische longziekte met progressieve daling van longkanker functies die helaas vaak dodelijk is binnen vier jaar na de diagnose1. De belangrijkste functies van de IPF zijn afzetting van de extracellulaire matrix en fibroblast proliferatie, maar de pathogenese is nog niet volledig begrepen. De meest gesteunde hypothese is dat meerdere cycli van longkanker verwondingen leiden tot de vernietiging van de alveolaire epitheliale cellen die tot wijziging van de proliferatie van de mesenchymale celcyclus, overdreven accumulatie van fibroblasten en myofibroblasts leidt, en verhoogde matrix productie. Bemiddelaars bij deze processen betrokken zijn, zoals matrix metalloproteinasen (MMP) gevonden in fibrose ontwikkeling menselijke IPF of in diermodellen bleomycine-geïnduceerde dysregulated. De ongecontroleerde MMP productie leidt tot een onevenwichtige collageen depositie in de longen interstitium en de alveolaire ruimte, nabootsen van abnormale wond reparatie1,2.
Een van de belangrijkste belemmeringen voor Geneesmiddelenontwikkeling is de beschikbaarheid van toegankelijke Muismodellen die menselijke pathogenese en het fenotype van de ziekte na te bootsen. Verschillende agenten zijn gebruikt voor het opwekken van fibrose van de Long in diermodellen: bestraling schade, beheer van asbest en silica, beheer van fibrinogenic cytokines en bleomycine3,4; maar bleomycine is de meest gebruikte in muizen, ratten, cavia's, hamsters, konijnen5 of in grote dieren (niet-menselijke primaten, paarden, honden en herkauwers)6,7. Bleomycine is een antibioticum dat is gemaakt door de bacterie Streptomyces verticillus8 en wordt gebruikt als een anti-kanker agent9. Longfibrose is een veelvoorkomende bijwerking van de drug en om deze reden, het wordt gebruikt in experimentele dierlijke modellen voor het opwekken van longfibrose.
De fibrotische letsels optreden in Long bleomycine-geïnduceerde fibrose modellen, 14-21 dagen na toediening van bleomycine. In het gepresenteerde werk gebruikten we een nieuw protocol voor het opwekken van fibrose van de Long in muizen door dubbele bleomycine intratracheale instillatietest. De muismodel van bleomycine is zeer tijdrovend, omdat nieuwe geneesmiddelen moeten worden beoordeeld op gevestigde fibrotische laesies en getest om te onderscheiden van hun anti-fibrotische effecten van anti-inflammatoire effecten.
Biochemische bepaling van collageen inhoud, morphometrical en histologische analyse waren gebaseerd op de postmortem analyse, beperking van de mogelijkheid om te volgen van de pathogenese van de ziekte bij hetzelfde dier. Hoewel deze parameters werden beschouwd als een gouden standaard voor de evaluatie van de fibrose, deed ze niet bieden van een tijdelijke of ruimtelijke verdeling van de fibrotische laesie en beletsel voor een manier om het proces van progressie van de ziekte te onderzoeken. 10
Onlangs, niet-invasieve imaging-technologieën zijn toegepast op de monitor airway remodelleren, ontsteking en fibrose progressie in lymfkliertest modellen: Magnetic Resonance Imaging (MRI), Micro Computer Tomografie (Micro-CT), moleculaire fluorescentie Tomografie (FMT) en bioluminescente (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 2120, ,. Stellen wij een niet-invasieve beeldvormende aanpak als u wilt controleren lengterichting lung fibrosis progressie door FMT en Micro-CT op verschillende tijdstippen na een bleomycine challenge22.
Vele trajecten zijn betrokken bij de oprichting en de ontwikkeling van fibrose, en is niet veel bekend. Alleen een dieper inzicht in deze processen kan vertalen naar meer drug targets die in de kliniek overdragen mag. De mogelijkheid om te controleren lengterichting MMP activering door fluorescentie moleculaire tomografie gekoppeld aan de detectie van Long parenchymal veranderingen door Micro-CT misschien in de toekomst worden gebruikt voor toegang tot de klinische respons op behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven hierin beschreven werden goedgekeurd door de intramurale dierenwelzijn Comité voor dierlijke proefneming van Chiesi Farmaceutici en ERASMUS MC onder protocolnummer: EMC 3349 (138-14-07) voldoen aan de Europese richtlijn 2010/63 UE, Italiaanse D.Lgs 26/2014 en de herziene "Gids voor de zorg en gebruik van proefdieren"23.
Opmerking: Vóór gebruik, vrouwelijke ingeteelde C57Bl/6 (7-8 weken oud) muizen werden geacclimatiseerd gedurende ten minste 7 dagen aan de lokale vivarium omstandigheden (kamertemperatuur: 20-24 ° C, relatieve vochtigheid: 40-70%, 12 uur licht-donker cyclus), gratis toegang hebben tot standaard knaagdier chow en onthard water van de kraan.
1. intratracheale behandeling van muizen met bleomycine
- De apparatuur voor de intra-tracheale instillation12,13,14te bereiden.
- Zet de muizen in de verdoving zaal verbonden aan een Isofluraan vaporisator vastgesteld op 2,5% gemengd met zuurstof. Selectievakje voor diepte van verdoving door het ontbreken van een teen-snuifje reactie. Het effect van de narcose is opgetreden na 3-5 min.
- Positie van de narcose muis op het platform van de intubatie, hangende het door haar snijtanden geplaatst op de draad.
- Zet de Laryngoscoop, neem een paar botte eindigde pincet en gebruik van de verlostang of de Laryngoscoop tip voorzichtig openen van de mond.
- Trek de tong en vasthoudt aan de kant met de pincet. Plaats de Laryngoscoop blade naar de achterkant van de mond tot de opening van de luchtpijp is gevisualiseerd en bewaar de Laryngoscoop op plaats.
- Met de andere hand, plaatst u de gasinleidbuis verbonden aan het einde van de PE-buis in de luchtpijp, het draaien van de drie-weg klep. Leveren van 50 µL van bleomycine (0.020 µg/muis). Na instillation, snel de buis uit de luchtpijp te voorkomen verstikking te verwijderen. De muizen rechtop houden voor een paar seconden.
- Beheren van bleomycine intratracheally op dag 0 en herhalen op dag 4 (Figuur 1).
- Verwijder de muis uit de intubatie platform en controleren de muis voor 30 min (de tijd die nodig is om volledig herstellen van anesthesie).
- Uitvoeren in vivo imaging van de longen van de muizen door FMT en Micro-CT na dubbele bleomycine instillation op dag 7, 14 en 21.
2. in vivo Imaging door fluorescentie moleculaire tomografie
Opmerking: Vooraf, bereiden een verse stamoplossing 6 nmol/ml MMP gevoelige fluorescerende substraat 680 in zoutoplossing (0,9% natriumchloride) en store beschermd tegen het licht bij 4 ° C vóór gebruik. Het is stabiel voor maximaal 6 maanden bij 4 ° C. MMP imaging agent equilibreer tot kamertemperatuur vóór het injecteren in dieren toestaan.
-
Sonde injectie
- De apparatuur voor intraveneuze injectie van de MMP sonde oplossing voor te bereiden. Vooraf warm water bij 50 ° C te verwarmen van de staart van de muis.
- Om de muis nekvel stevig te begrijpen, nemen hetzelve met de staart en laat ze aan de greep van de deksel van de kooi. Houd de muizen over de schouders van het dier en zetten de staart in een bekerglas van warm water, voor 4 tot maximaal 8 s thermische schade ter voorkoming van thermische schade aan de huid van de staart. Controleer de aderen zwelling voor gemakkelijker visualisatie en inbrengen van de naald.
- Tijdens de injectie-procedure, de muizen gebracht in een plastic afdekking te houden het gestage en trekken de staart door een speciale gat in de rug. Vinden de twee caudal aderen aan weerszijden van de staart; niet de slagader aan de onderzijde van de staart.
- Steek de naald (26G) van de 1 mL spuit in de ader. Als de naald correct geplaatst wordt, injectie zal gemakkelijk en de oplossing van de sonde zal uitmonden in het schip.
- Injecteer de MMP sonde oplossing bij 10 mL/kg.
- Gooi de naald.
Opmerking: De optimale imaging tijdstip is 24 uur na de injectie van de sonde MMP want het is de tijd die nodig is door de sonde te worden geactiveerd. Als longitudinale studies worden uitgevoerd, is de optimale opnieuw injectie tijd 7 dagen, waardoor voor de volledige goedkeuring van de agent van de muis.
-
FMT imaging
Opmerking: Voordat u begint, altijd verwijderen de vacht op en rond de gebieden van het dier die naar zijn beeld, in dit geval de borst, om te voorkomen dat verstrooiing en absorptie in weefsel.- Anesthetize van de muis, zet het in de verdoving kamer en zet het wiel Isofluraan tot 2,5% voor inductie en 2% voor onderhoud.
- Initialiseren van de data-acquisitie software en open een nieuwe studie in de database voor het experiment.
- Voordat u begint de beeldvorming met FMT, overdracht van de muis in de beeldvorming cassette. Plaats de narcose muis in het midden van de cassette voor het optimaal gebruik van het gezichtsveld van de FMT imaging. Houden de muizen veilige, vlakke zachtjes gecomprimeerde tegen beide vensters van de beeldvorming cassette. De hoogte aanpassen door knoppen op de cassette en schuif het vervolgens in het docking station.
- Klik op een onderwerp in het scannen venster en klikt u op voorbeeld om te zien het live beeld.
- Trekken de scan regio groot genoeg zodat weefsel rondom het verwachte gebied van fluorescentie is vastgelegd. Met inbegrip van een totaal van 25 scan punten garanties zullen de longen regio volledig gescande.
- Zodra de ROI wordt getekend, klikt u eerst op toevoegen aan wederopbouw wachtrij en klik vervolgens op scannen naar image van de muis. Zorg ervoor dat de juiste laser op 680 nm is geselecteerd.
- Wanneer het image aquisition is voltooid, plaatst u de muisaanwijzer weer in zijn kooi. Zorg ervoor dat het volledig herstelt van anesthesie.
- Kwantificeren van de picomoles van fluorescentie in het venster van de analyse van de analysesoftware met behulp van de ROI tool en de ROI rond 700-800 mm3 op het signaal afkomstig uit de regio van de longen te verminderen. Wees voorzichtig om uit te sluiten van de lever signaal. Kopieer de ROI op de andere onderwerpen hebben ze gelijk in de dimensie en hun positie in elke dierlijke afbeelding aan te passen.
- Afbeeldingen exporteren als jpg-bestanden.
3. in Vivo Imaging door Micro-CT
Let op: Voordat u begint, en Verwijder altijd alle metalen sieraden of de metalen voorwerpen in de buurt van het imaginggebied, om te voorkomen dat verstrooiing van röntgenstraling in.
Opmerking: Long straling geïnduceerde fibrose is dat een gemeenschappelijk vinden tijdens straling geïnduceerde long letsel24. Micro-CT afgeleid indexcijfers noch histologische bevindingen geassocieerd met lung fibrosis waren aanwezig in zoute behandelde controle muizen op dag 21 onderworpen aan vier Micro-CT beeldvorming van sessies, die aangeeft dat de X-ray dosis afgeleverd aan de dieren tijdens de Micro-CT examens was niet voldoende om te beïnvloeden de bevindingen.
- De Micro-CT inschakelen door op de knop van de groene stroom en start de software te warmen de x-ray-bron. Gebruik de kleine boring en het dierlijke bed voor muizen imaging.
- Maak de database door te klikken op nieuwe database voor een nieuwe en bouwen de browser gebaseerd op aantal muizen in de experiment, of klikt u op verbinding maakt met een bestaande database als u wilt opslaan van de gegevens naar een eerder gemaakte.
- Voordat u begint met het scannen, selecteert u de overname-parameters in het besturingsvenster software: röntgenbuis spanning, 90 kV; CT X-ray buis stroom, 160 µA; Live röntgenbuis huidige, 80 µA; FOV, 36 mm; Geen gating techniek; Scanresolutie techniek, hoog 4 min.
- Anesthetize van de muizen door inhalatie van 3% Isofluraan en leg ze op het bed in de boring ingevoegd met een neus kegel leveren een constante aanvoer van verdoving. Immobiliseren de poten van de muizen met tape op het bed om de borst te worden blootgesteld.
- Schuif de deur van het instrument en de Live-modus te zien hier de muispositie in real time door op de knop vastleggen inschakelen. Verplaats het dierlijke bed uitlijnen van de borst met de beeldveld (FOV) met behulp van knoppen direct gelegen aan de CT-instrument. Centreren van de scan op de muis; Als dat niet het positie aanpassen met linker- en rechterpijl gelegen op de CT-instrument.
- Optimale bed standpunt bevestigen door het draaien van de gantry door 90 ° te selecteren en te klikken op instellen. Zorg ervoor dat de regio naar afbeelding volledig binnen de FOV is.
- Niet elke gating techniek toepassen en de scan starten door te klikken op de knop van de CT-Scan . Klik op Ja in het bericht waarin informeert dat de x-ray-bron wordt ingeschakeld.
Opmerking: Zodra de x-stralen worden aangezet, de oranje lamp op de top van het instrument zal worden verlicht en de schuifdeur onmogelijk zal zijn te openen voor de veiligheid van de operator. Wanneer de scan voltooid is, verschijnt een nieuw venster van de 2D Viewer software met de transaxial, coronale en Sagittaal segment van de wederopbouw. - Controleer de beeldkwaliteit en zorg ervoor dat u niet hebben wazig beelden van bewegingen als gevolg van het lage niveau van de verdoving. Herhaal indien nodig de scan.
- Plaats de dieren terug in de kooi en zorg ervoor dat ze volledig herstellen van anesthesie.
4. Bronchoalveolar Lavage
- Anesthetize dieren met 3% Isofluraan en offer door bloeden van de abdominale aorta.
- Met schaar waarmee werkmapberekeningen het thoracale kooi en de hals. Dan bloot van de luchtpijp en maak een kleine incisie om de BAL procedure moet worden uitgevoerd met een 21-gauge lavage buis gekoppeld aan een 1 mL spuit zonder de naald. Let niet op het doorsnijden van de luchtpijp.
- Voor het uitvoeren van de BAL, vul de 1 mL spuit zonder naald met 0,6 mL steriele oplossing [10 x Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS) 100 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA); 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic zuur (HEPES); gedistilleerd water].
- De buis lavage invoegen de incisie in de luchtpijp en langzaam injecteren en trekken de oplossing 3 keer, pauzeren op de derde terugtrekking om optimale verzameling van de BALF voor latere analyse.
5. histologie en Histomorphometry
- Bloot en longen, ze opblazen met een canule via de luchtpijp door zachte infusie met 0,6 mL van 10% neutraal gebufferde formaline verwijderen en opslaan van de monsters bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
- Uitdrogen van monsters door verschillende passages in toenemende concentraties van alcohol oplossingen (60% ethanol voor 1 h 70% ethanol voor 1 h, 90% ethanol voor 1 h, 95% ethanol voor 2 h en 100% ethanol voor 2 h) met behulp van een automatische weefsel processor.
- Plaats specimens in xyleen gedurende 2 uur te laten doorschijnend. Aan het einde van uitdroging, infiltreren monsters in paraffine bij 60 ° C gedurende 3 h en insluit in de geautomatiseerde processor.
- 5 µm dik seriële delen gebruikend rotary microtome verkrijgen.
- Deparaffinize en hydrateren van dia's in aflopende rangen van ethanol en vlek met Masson van Trichrome met behulp van een automatische weefsel processor.
- Handmatig focus op longkanker segmenten, scannen met 20 X vergroting met behulp van een dia scanner en digitale foto's vastleggen van gehele Long secties met behulp van de software bekijken met een resolutie van 451 nm/pixel.
- Morfologisch beoordelen fibrotische long letsel door semi-kwantitatieve en kwantitatieve parameters als volgt:
- Het bepalen van de score Ashcroft. Semi-kwantitatief rang morfologische veranderingen in de longen secties volgens de schaal gedefinieerd door Ashcroft10 gewijzigd door Hübner et al. 25 gebruik het systeem van 0-8 score om te beoordelen alle parenchym in de Long-secties.
- Bepaal het gehalte aan collageen. De mate van fibrose10,25 te kwantificeren door de Microscoop software voor de analyse van de afbeelding. Willekeurig drie ROIs op 10 X vergroting, per elke dia selecteren Door standaardisatie van drempel kleurinstellingen, detecteren de collageen als groen-gekleurde gebied.
- Het bepalen van de alveolaire lucht-gebied. De alveolaire lucht gebied als een indirecte parameter van fibrose10,25te kwantificeren. Door middel van dezelfde software en ROIs toegepast voor de Fractie van de fibrose, het gebied van de lucht binnen de ROIs met behulp van een witte drempel te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontane resolutie van de Long-fibrose letsels waargenomen drie weken nadat één bleomycine administratie en gematigde structurele wijzigingen de grenzen van dit model markeren. Alleen preventieve behandeling kan worden uitgevoerd als gevolg van de smalle therapeutische venster dat niet tot klinische praktijk17 leidt.
Hier, wij laten zien dat onze protocol van dubbele bleomycine intratracheale instillatietest kunnen ontwikkelen langdurige Long-fibrose in muizen18. De proefopzet is afgebeeld in Figuur 119,20,21. Het doel van deze studie is om te kijken naar lung fibrosis progressie in muizen met noninvasive imaging-technologieën. Bleomycine was intratracheally tweemaal toegediend (op dag 0 en 4; 1 mg/kg van bleomycine in 50 µL telkens). Twaalf muizen voor elke groep waren intratracheally uitgedaagd met hetzelfde volume van voertuig alleen op hetzelfde moment als de bleomycine groep om te gebruiken als besturingselement. Voor de beoordeling van fibrose, een semi-kwantitatieve histologische analyse gebeurde op basis van de Ashcroft scoring systeem. 10
In het huidige werk beoordeeld wij lung fibrosis ontwikkeling in bleomycine-geïnduceerde muismodel met behulp van Micro-CT en FMT technologieën in combinatie met klassieke histologie. De noninvasive aard van de imaging technologieën vertegenwoordigt echte waarde voor preklinische evaluatie van lung fibrosis progressie en de overeenkomst gevonden met de histologie zit een voortreffelijk trede. Micro-CT imaging een belangrijke rol kan spelen in de kwantificering van de parenchymal veranderingen van de longen als gevolg van fibrotische laesies overlangs.
Histologie foto's van de bleomycine behandeld groep toonde een uitgesproken patroon van fibrose vanaf dag 7, vooral als één fibrotische massa's, en vorderde op dag 14 confluente conglomeraten van afkickprogramma collageen en ongewijzigde bleef tot dag 21 ( Figuren 2A - 2 C). Bleomycine behandeling geïnduceerde Long ontsteking (Figuur 3A), waar het aantal WBC significant hoger in BALF van bleomycine behandeld muizen op 7, 14 en 21 dagen vergelijken met voertuig groep was. Interessant is dat werden de lymfocyt en monocyt breuken eveneens verhoogd op elk tijdstip van bemonstering (cijfers 3B-3 C); in tegenstelling, is een aanzienlijke toename van de neutrofiele breuk geconstateerd bij dag 7 (Figuur 3D).
In deze studie, werd Micro-CT gebruikt voor het controleren van de longen parenchym wijzigingen overlangs. Progressieve anatomische veranderingen van de Long architectuur op verschillende tijdstippen van de waarneming van de basislijn worden duidelijk gezien in Micro-CT projecties (cijfers 4A-4B). De straal van de luchtwegen in het distale deel van de bronchiale boom (cijfers 5A en 5 C)19,20,21 en totale lung fibrosis percentage (cijfers 5B en 5 D) kan kwantificeren fibrose progressie. De kwantificering van de fibrose-percentage in bleomycine behandelde groep op dag 7 (Figuur 5D) was enigszins overschat als ten opzichte van histologie scoren. Dit kan worden verklaard door een dubbele reactie van ontsteking en fibrose intreden, waardoor het moeilijk om te onderscheiden tussen de twee symptomen. De straal van de luchtwegen en het percentage van fibrose werden geselecteerd uit beeldverwerking van de projecties van de Micro-CT voor de kwantificering van de Long parenchymal wijzigingen (Cijfers 5 C-5 D)19,20,21 . Deze Micro-CT-parameters zijn zeer goed in overleg met de histologische bevindingen zoals in Figuren 2A/2 C.
Micro-CT imaging rechtstreeks weerspiegeld de pathologische en therapeutische veranderingen van longkanker parenchym en FMT technologie verstrekte kwantitatieve informatie meer gerelateerd aan eiwit expressie graag IPF. Voor deze studie kozen we een MMP-sonde op basis van de relevantie ervan voor IPF en vonden we specifieke MMP activering van bleomycine behandeld muizen (Figuur 6)18. De rol van MMP is onderzocht door het injecteren van voertuig of bleomycine muizen behandeld MMP activeerbaar fluorescerende sondes op geselecteerde tijdstippen. Vierentwintig uur na de injectie, de image van de muizen werden gemaakt door FMT onthullen dat fibrotische muizen de specifieke MMP fluorescente sonde in vivo (cijfers 6A-6 D)18 en ex vivo (Figuur 6E)18 activeren kunnen .
Figuur 1 : Experimental ingesteld voor bleomycine-geïnduceerde muis lung fibrosis. C57BL/6 vrouwelijke muizen hadden een zoutoplossing of bleomycine ingeprent intratracheally op twee gelegenheden, dag 0 en 4. Muizen werden beeld door een Micro-CT-scanner op basislijn (dag 0), 7, 14 en 21 dagen. Groepen van 12 muizen werden geofferd op 7, 14 en 21 dagen en hun longen werden beoordeeld voor collageen depositie te correleren histologische resultaten met de beelden verkregen door µCT. Dit cijfer is gewijzigd van de gepubliceerde artikel21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: histologische analyse tijdsverloop van bleomycine geïnduceerde fibrose van de Long in muizen.
(A) kwantificering van fibrose van de Long door Ashcroft score ofwel voertuig of bleomycine behandeld muizen op verschillende tijdstippen. Het experiment werd herhaald drie keer, en elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM van 12 dieren. Statistische analyse is verricht door ANOVA gevolgd door Tukey van test. * p < 0.05; ** p < 0,01.
(B) Ashcroft score frequentieverdeling toegewezen in lichte, matige en ernstige subcategorieën.
(C) vertegenwoordiger histologie van de Masson Trichome gekleurd muis Long secties voor intratracheally dubbele ingeprent bleomycine of zoute behandelde muizen op 7, 14 en 21 dagen na de behandeling (vergroting 10 X, schaal bar 200 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: cellulaire infiltratie tijdsverloop in de BALF van bleomycine geïnduceerde fibrose van de Long in muizen.
Het (A) aantal WBC, (B) monocyten, lymfocyten (C) en (D) neutrofiele granulocyten. Cellen gevonden in BALF werden uitgedrukt in aantal cellen * 103/µL. Het experiment werd herhaald drie keer, en elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM van 9 dieren. Statistische analyse is verricht door ANOVA gevolgd door de Dunnett-test. * p < 0.05; ** p < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Longitudinale Micro-CT beeldvorming projecties van longkanker bleomycine-geïnduceerde fibrose en voertuig behandeld muizen. (A) Micro-CT, bleomycine behandeld mouse en (B) Micro-CT, zoute behandelde mouse Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Airways, fibrose Long lobben kwantificering en segmentatie op basis van herhaalde Micro-CT beeldvorming.
(A) Airways werden verdeeld in een centrale en distale deel. (B) het distale deel van de luchtwegen is de intrapulmonary tractus gebruikt voor het identificeren en longkanker lobben als gesplitst: recht craniale kwab (RCrL), rechts midden kwab (RMdL), recht Caudal Lobe (RCdL), rechts accessoire kwab (RAcL) en links Lung (LL). (C) Airway straal en (D) total lung fibrosis quantification voertuig of bleomycine behandeld muizen op verschillende tijdstippen. Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM van 5 dieren, voor een totaal van 30 muizen. Statistische analyse is verricht door ANOVA gevolgd door de Dunnett-test. * p < 0.05; ** p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van de gepubliceerde artikel21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur. 6. tijd loop van fluorescentie signaal gemeten door FMT inbleomycin geïnduceerde lung fibrosis muizen. In vivo (A en B) en ex vivo (C en D) FMT representatieve beelden van muizen geïnjecteerd met MMP sonde behandeld met voertuig of met bleomycine. (E) de totale hoeveelheid Long fluorescentie signaal werd automatisch berekend door FMT beeld software. Het experiment werd herhaald drie keer, en elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde ± standaardafwijking van 9 dieren. Statistische analyse is verricht door ANOVA gevolgd door de Dunnett-test. * p < 0.05; ** p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van de gepubliceerde artikel18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks vele onderzoeksgroepen zich te concentreren op de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van de IPF, op dit moment zijn slechts twee beschikbaar voor patiënten. Er is een dringende medische noodzaak om te vinden van meer effectieve therapieën7 omdat alleen Long transplantationis bekwaam om te overleven van 4-5 jaar26verlengen. De essentiële voorwaarde voor translationeel geneeskunde en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is de beschikbaarheid van een dierlijk model dat de kenmerken van de IPF en bootst in welke interventionele studies voorspellende van succes in de kliniek zijn. Het nut van de bestaande longfibrose diermodellen is echter nog steeds omstreden27. We ontwikkelen een nieuwe muismodel van Long-fibrose waarvoor een dubbele instillation van bleomycine zoals beschreven in Figuur 118. Imaging-technologieën zijn krachtige hulpmiddelen voor het visualiseren van de progressie van de ziekte, en farmacologische reactie op behandeling. Deze diermodel gerecapituleerd beter de menselijke kenmerken van IPF en noninvasive technologieën kunnen leiden tot een brug tussen de instellingen van de preklinische en klinische praktijk27.
Robuust en reproduceerbare om gegevens te verkrijgen, zijn enkele stappen echter cruciaal. De intratracheale instillatietest moet worden uitgevoerd wanneer de muizen zijn volledig verdoofd, met behulp van een gestandaardiseerde procedure. Micro-CT overname vereist zeer nauwkeurige bewaking van de narcose, omdat de CT-projecties zijn gated door de respiratoire frequentie. Imaging, Controleer dat de muizen dezelfde diepte van de verdoving hebben. Een zeer belangrijke stap voor optische beeldvorming door FMT is ontharing. Voordat u begint, moet u altijd de vacht op en rond de borst, om te voorkomen dat verstrooiing en absorptie in weefsel verwijderen. De injectie van de sonde moet worden gecorrigeerd door het lichaamsgewicht van het dier.
De mogelijkheid te onderzoeken en kwantificeren van een specifieke moleculaire uitlezing met anatomische veranderingen in de dezelfde muizen op verschillende tijdstippen is een enorme stap in de ontwikkeling van de fibrose van begrip, een voor de hand liggende voorschot voor zowel de functionele als de farmacologische studies.
Deze multimodale aanpak imaging is een slim hulpmiddel om te evalueren van de werkzaamheid van de drug, veel meer voorlichting ten opzichte van terminal beoordeling, vertalen in een meer efficiënte drug discovery-proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedank Dr. Daniela Pompilio en Roberta Ciccimarra voor technische hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , National Research Council. Washington DC. (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
