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Immunology and Infection

चूहों में ब्लीयामीसिन-प्रेरित फेफड़ों की फाइब्रोसिस के अनुदैर्ध्य आकलन के लिए माइक्रो-सीटी और प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी पर आधारित एक Multimodal इमेजिंग दृष्टिकोण

Published: April 13, 2018 doi: 10.3791/56443
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 4, 1, 2, 5, 1
1Corporate Preclinical R&D, Chiesi Farmaceutici S.p.A., 2Department of Veterinary Science, University of Parma, 3Department of Molecular Genetics, Erasmus MC, 4Department of Molecular Genetics, Vascular Surgery, Radiation Oncology, Erasmus MC, 5Fluidda NV

Summary

हम एक गैर इनवेसिव multimodal इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन माइक्रो-सीटी और प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी पर आधारित माउस फेफड़े फाइब्रोसिस मॉडल के अनुदैर्ध्य आकलन के लिए डबल intratracheal जगाकर ब्लीयामीसिन के द्वारा प्रेरित ।

Abstract

अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस (आईपीएफ) फेफड़ों की वास्तुकला के प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय विनाश द्वारा विशेषता एक घातक फेफड़ों की बीमारी है, जो फेफड़ों समारोह में महत्वपूर्ण गिरावट और सांस की विफलता से बाद में मौत का कारण बनता है ।

प्रायोगिक पशु मॉडलों में आईपीएफ की रोगजनन को ब्लीयामीसिन प्रशासन द्वारा प्रेरित किया गया है । इस अध्ययन में, हम एक आईपीएफ की तरह माउस एक डबल intratracheal ब्लीयामीसिन जगाकर द्वारा प्रेरित मॉडल की जांच । फेफड़े फाइब्रोसिस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल मानक ऊतकवैज्ञानिक आकलन आक्रामक टर्मिनल प्रक्रियाओं हैं । इस काम का लक्ष्य फ्लोरोसेंट आणविक टोमोग्राफी (FMT) और माइक्रो-सीटी जैसे इनवेसिव इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से फेफड़ों की फाइब्रोसिस की निगरानी करना है । इन दो प्रोटोकॉल निष्कर्षों के साथ मांय प्रौद्योगिकियों आईपीएफ रोग गंभीरता और प्रगति के वास्तविक समय गैर इनवेसिव निगरानी के लिए एक क्रांतिकारी कार्यात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकता है । विभिन्न दृष्टिकोणों का फ्यूजन आईपीएफ रोग को समझने के लिए एक कदम आगे का प्रतिनिधित्व करता है, जहां एक रोग हालत में होने वाली आणविक घटनाओं FMT के साथ मनाया जा सकता है और बाद में संरचनात्मक परिवर्तन माइक्रो सीटी द्वारा निगरानी की जा सकती है ।

Introduction

अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस (आईपीएफ) फेफड़ों के कार्यों की प्रगतिशील कमी के साथ पुरानी फेफड़ों की बीमारी है कि दुर्भाग्य से अक्सर1निदान के चार साल के भीतर घातक है । आईपीएफ की प्रमुख विशेषताएँ हैं extracellular मैट्रिक्स साठा और fibroblast प्रसार, लेकिन रोगजनन अभी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहा है. सबसे समर्थित परिकल्पना है कि फेफड़ों की चोटों के कई चक्र वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के विनाश का कारण है कि mesenchymal कोशिका चक्र प्रसार के परिवर्तन की ओर जाता है, fibroblasts और myofibroblasts के अतिरंजित संचय, और मैट्रिक्स उत्पादन में वृद्धि हुई । इन प्रक्रियाओं में शामिल मध्यस्थों जैसे मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs) को फाइब्रोसिस विकास में dysregulated पाया गया है या तो मानव आईपीएफ में या ब्लीयामीसिन-प्रेरित पशु मॉडलों में । अनियंत्रित एमएमपी उत्पादन फेफड़ों interstitium और वायुकोशीय अंतरिक्ष के भीतर एक असंतुलित कोलेजन जमाव की ओर जाता है, असामांय घाव की मरंमत1,2नकल उतार ।

दवा की खोज और विकास के लिए मुख्य बाधाओं में से एक है कि मानव रोगजनन और रोग phenotype नकल सुलभ माउस मॉडल की उपलब्धता है । विकिरण क्षति, अदह और सिलिका, प्रशासन के fibrinogenic साइटोकिंस और ब्लीयामीसिन3,4के व्यवस्थापन: विभिन्न एजेंटों पशु मॉडल में फेफड़े फाइब्रोसिस प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि ब्लीयामीसिन सबसे चूहों में इस्तेमाल किया है, चूहों, गिनी सूअर, हंसटर, खरगोशों5 या बड़े जानवरों में (गैर मानव रहनुमाओं, घोड़ों, कुत्तों और ruminants)6,7. ब्लीयामीसिन एक एंटीबायोटिक है जीवाणु Streptomyces verticillusद्वारा बनाई गई8 और एक विरोधी कैंसर एजेंट9के रूप में प्रयोग किया जाता है । फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस दवा का एक आम पक्ष प्रभाव है और इस कारण के लिए, यह प्रयोगात्मक पशु मॉडलों में प्रयोग किया जाता है फेफड़े की फाइब्रोसिस पैदा करने के लिए ।

ब्लीयामीसिन-प्रेरित फेफड़ों फाइब्रोसिस मॉडल में, fibrotic घावों ब्लीयामीसिन प्रशासन के बाद 14-21 दिन होते हैं । प्रस्तुत काम में, हम डबल ब्लीयामीसिन intratracheal जगाकर द्वारा चूहों में फेफड़ों की फाइब्रोसिस पैदा करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया । ब्लीयामीसिन माउस मॉडल बहुत समय लगता है क्योंकि नई दवाओं के लिए स्थापित fibrotic घावों पर मूल्यांकन की जरूरत है, और विरोधी भड़काऊ प्रभाव से उनके विरोधी fibrotic प्रभाव भेद करने के लिए परीक्षण किया ।

कोलेजन सामग्री, morphometrical और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के जैव रासायनिक निर्धारण पोस्ट मार्टम विश्लेषण पर आधारित थे, संभावना सीमित करने के लिए एक ही जानवर में रोग के रोगजनन का पालन करें । हालांकि इन मापदंडों फाइब्रोसिस मूल्यांकन के लिए एक सोने का मानक माना जाता था, वे किसी भी लौकिक या स्थानिक fibrotic घावों के वितरण प्रदान नहीं किया है और एक तरह से रोग प्रगति की प्रक्रिया की जांच बाधा । 10

हाल ही में, गैर इनवेसिव इमेजिंग प्रौद्योगिकियों airway remodeling, सूजन, और murine मॉडल में फाइब्रोसिस प्रगति की निगरानी करने के लिए लागू किया गया है: चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), माइक्रो कंप्यूटर टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी), प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी (FMT) और Bioluminescent (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. हम एक गैर इनवेसिव इमेजिंग दृष्टिकोण FMT और माइक्रो सीटी द्वारा longitudinally फेफड़ों फाइब्रोसिस प्रगति पर नजर रखने के लिए एक ब्लीयामीसिन चुनौती के बाद अलग समय-अंक का प्रस्ताव22।

कई रास्ते फाइब्रोसिस की स्थापना और विकास में शामिल हैं, और बहुत ज्यादा नहीं जाना जाता है । केवल इन प्रक्रियाओं की गहरी समझ और अधिक दवा लक्ष्य है कि क्लिनिक में स्थानांतरित कर सकते है अनुवाद सकता है । माइक्रो-सीटी द्वारा फेफड़े parenchymal परिवर्तन का पता लगाने के लिए युग्मित प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी द्वारा निगरानी एमएमपी सक्रियण longitudinally करने के लिए उपचार के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए भविष्य में इस्तेमाल किया जा सकता है की क्षमता.

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों के साथ यहां वर्णित अंदर पशु-कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया Chiesi Farmaceutici और इरास्मस एम सी के अंतर्गत प्रोटोकॉल संख्या: EMC ३३४९ (138-14-07) यूरोपीय निर्देश के साथ अनुपालन 2010/63 यत, इतालवी मृ. Lgs 26/2014 और संशोधित "प्रयोगशाला जानवरों के देखभाल और उपयोग के लिए गाइड"23।

नोट: उपयोग करने से पहले, महिला C57Bl/6 (7-8 सप्ताह पुराना) चूहों को स्थानीय vivarium शर्तों (कमरे का तापमान: 20-24 डिग्री सेल्सियस; सापेक्ष आर्द्रता: 40-70%; 12-एच प्रकाश-अंधेरे चक्र), मानक मूषक चाउ करने के लिए नि: शुल्क उपयोग कर रहे है और नरम नल का पानी ।

1. ब्लीयामीसिन के साथ चूहों का Intratracheal उपचार

  1. अंतरराज्यीय सांस जगाकर12,13,14के लिए उपकरण तैयार करें ।
  2. संवेदनाहारी चैंबर में चूहों एक isoflurane vaporizer ऑक्सीजन के साथ मिश्रित २.५% पर सेट करने के लिए जुड़े रखो । एक पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई के लिए जांच करें । संज्ञाहरण के प्रभाव 3-5 मिनट के बाद हुई ।
  3. इंटुबैषेण मंच पर anesthetized माउस की स्थिति, यह उसके तार पर रखा कृन्तक द्वारा लटका ।
  4. laryngoscope पर मुड़ें, कुंद संदंश समाप्त की एक जोड़ी ले और या तो संदंश या laryngoscope टिप का उपयोग करने के लिए धीरे से मुंह खोलो ।
  5. जीभ बाहर खींचो और संदंश के साथ यह पक्ष को पकड़ो । laryngoscope ब्लेड को मुंह के पीछे की ओर रखें जब तक कि श्वासनली के खुलने की कल्पना न की जाए और laryngoscope को स्थान पर रखें ।
  6. दूसरे हाथ से, श्वासनली में पीई टयूबिंग के अंत करने के लिए कनेक्ट प्रसव ट्यूब डालें, तीन तरह के वाल्व घूर्णन । ब्लीयामीसिन (०.०२० µ g/माउस) के ५० µ l को वितरित करना । जगाकर के बाद, घुटन को रोकने के लिए श्वासनली से ट्यूब को जल्दी से हटा दें । चूहों को कुछ सेकंड के लिए ईमानदार पकड़ो ।
    1. प्रशासन 0 दिन में ब्लीयामीसिन intratracheally और 4 दिन में दोहराएं (चित्रा 1) ।
  7. इंटुबैषेण मंच से माउस को निकालें और 30 मिनट (पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने के लिए आवश्यक समय) के लिए माउस की निगरानी ।
  8. 7, 14 और 21 दिन में डबल ब्लीयामीसिन जगाकर के बाद FMT और माइक्रो-सीटी द्वारा चूहों के फेफड़ों की इमेजिंग में प्रदर्शन ।

2. प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी द्वारा vivo इमेजिंग में

नोट: पहले, खारा समाधान (०.९% सोडियम क्लोराइड) में एमएमपी संवेदनशील फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट ६८० के 6 nmol/एमएल के एक ताजा स्टॉक समाधान तैयार है, और उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित स्टोर । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने के लिए स्थिर है । जानवरों में इंजेक्शन लगाने से पहले एमएमपी इमेजिंग एजेंट को कमरे के तापमान पर equilibrate करने की अनुमति दें ।

  1. जांच इंजेक्शन
    1. एमएमपी जांच समाधान के नसों में इंजेक्शन के लिए उपकरण तैयार करें । ५० ° c पर पूर्व गर्म पानी के लिए माउस पूंछ गर्मी ।
    2. दृढ़ता से माउस scruff समझ, यह पूंछ द्वारा ले और यह पिंजरे ढक्कन पकड़ करने के लिए अनुमति देते हैं । पशु के कंधों भर में चूहों जोत, एक गर्म पानी चोंच में पूंछ डाल, 4 से अधिकतम 8 एस थर्मल चोट पूंछ त्वचा को थर्मल चोट को रोकने के लिए ।  आसान दृश्य और सुई प्रविष्टि के लिए नसों में सूजन की जाँच करें ।
    3. इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान, चूहों एक प्लास्टिक निरोधक में डाल करने के लिए यह स्थिर रखने के लिए और पीठ में एक विशेष छेद के माध्यम से पूंछ खींच. पूंछ के दोनों ओर दो caudal नसों का पता लगाएं; नहीं पूंछ के नीचे पर धमनी ।
    4. नस में 1 मिलीलीटर सिरिंज की सुई (26G) डालें. सुई सही ढंग से रखा गया है, तो इंजेक्शन आसान हो जाएगा और जांच समाधान पोत में प्रवाह होगा ।
    5. एमएमपी जांच समाधान पर 10 मिलीलीटर/
    6. सुई त्यागें ।
      नोट: एमएमपी जांच इंजेक्शन के बाद इष्टतम इमेजिंग समय बिंदु 24 एच है क्योंकि यह जांच द्वारा आवश्यक समय पर सक्रिय हो जाता है । यदि अनुदैर्ध्य अध्ययन किया जाता है, इष्टतम पुनः इंजेक्शन समय 7 दिन है, जो माउस से एजेंट की पूरी मंजूरी के लिए अनुमति देता है ।
  2. FMT इमेजिंग
    नोट: शुरू करने से पहले, हमेशा पर और आसपास के क्षेत्रों में फर को दूर करने के लिए कर रहे हैं कि जानवर की छवि, इस मामले में छाती, तितर बितर और ऊतक में अवशोषित से बचने के लिए.
    1. माउस anesthetize करने के लिए, यह संवेदनाहारी चैंबर में डाल दिया और २.५% के लिए प्रेरण और रखरखाव के लिए 2% के लिए isoflurane डायल बारी ।
    2. डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और प्रयोग के लिए डेटाबेस में एक नया अध्ययन खोलें ।
    3. FMT के साथ इमेजिंग शुरू करने से पहले, माउस इमेजिंग कैसेट में स्थानांतरण । इमेजिंग कैसेट के बीच में anesthetized माउस जगह को बेहतर FMT के दृश्य के क्षेत्र का उपयोग करें । रखने के चूहे फ्लैट, सुरक्षित और धीरे इमेजिंग कैसेट की दोनों खिड़कियों के खिलाफ संकुचित । कैसेट पर knobs के द्वारा ऊंचाई समायोजित करें, और फिर डॉकिंग स्टेशन में स्लाइड ।
    4. स्कैनिंग विंडो में विषय पर क्लिक करें और लाइव छवि देखने के लिए पूर्वावलोकन क्लिक करें ।
    5. स्कैन क्षेत्र पर्याप्त रूप से बड़े ताकि प्रतिदीप्ति के प्रत्याशित क्षेत्र के आसपास के ऊतकों पर कब्जा कर लिया है ड्रा । सहित कुल 25 स्कैन बिंदुओं की गारंटी फेफड़ों क्षेत्र पूरी तरह से स्कैन किया जाएगा ।
    6. ROI आरेखित किए जाने के बाद, पहले पुनर्निर्माण कतार में जोड़ें क्लिक करें और फिर माउस को छवि के लिए स्कैन करें क्लिक करे । सुनिश्चित करें कि ६८० एनएम पर सही लेजर चयनित है ।
    7. जब छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, माउस को वापस अपने पिंजरे में जगह है । सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक हो ।
    8. रॉय टूल का उपयोग करके विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के विश्लेषण विंडो में प्रतिदीप्ति की picomoles को बढ़ाता है और फेफड़ों के क्षेत्र से आने वाले सिग्नल पर 700-800 mm3 के आसपास रॉय को कम करता है । लिवर सिग्नल को बाहर करने के लिए सावधान रहें । अंय विषयों पर रॉय कॉपी करने के लिए उंहें आयाम में समान है और प्रत्येक जानवर छवि में अपनी स्थिति को समायोजित ।
    9. jpg फ़ाइलों के रूप में निर्यात छवियां ।

3. माइक्रो-सीटी द्वारा Vivo इमेजिंग में

चेतावनी: शुरू करने से पहले, हमेशा किसी भी धातु गहने या इमेजिंग क्षेत्र के पास धातु की वस्तुओं को हटाने, एक्स-रे के बिखरने से बचने के लिए ।

नोट: विकिरण प्रेरित फेफड़ों की फाइब्रोसिस विकिरण प्रेरित फेफड़ों की चोट24के दौरान एक आम खोज है । न तो माइक्रो-सीटी व्युत्पंन सूचकांक और न ही ऊतकवैज्ञानिक फेफड़ों फाइब्रोसिस से जुड़े निष्कर्षों खारा में उपस्थित थे 21 दिन पर नियंत्रण चूहों चार माइक्रो सीटी इमेजिंग सत्र के अधीन, यह दर्शाता है कि एक्स-रे सूक्ष्म सीटी के दौरान जानवरों को दिया खुराक परीक्षाओं के निष्कर्षों को प्रभावित करने के लिए पर्याप्त नहीं था ।

  1. ग्रीन पावर बटन दबाकर माइक्रो-सीटी चालू करें और सॉफ्टवेयर को एक्स-रे सोर्स को गर्म करने के लिए लॉन्च कर दें । छोटे बोर और चूहों इमेजिंग के लिए पशु बिस्तर का उपयोग करें ।
  2. एक नए के लिए नए डेटाबेस पर क्लिक करके डेटाबेस बनाएं और प्रयोग में चूहों की संख्या के आधार पर ब्राउज़र बनाएं, या पहले बनाए गए डेटा को सहेजने के लिए मौजूदा डेटाबेस से कनेक्ट करना क्लिक करें ।
  3. स्कैनिंग शुरू करने से पहले, सॉफ्टवेयर नियंत्रण विंडो में अधिग्रहण मापदंडों का चयन करें: एक्स-रे ट्यूब वोल्टेज, ९० केवी; सीटी एक्स-रे ट्यूब चालू, १६० µA; लाइव एक्स-रे ट्यूब चालू, ८० µA; FOV, ३६ मिमी; कोई गेटिंग तकनीक नहीं; स्कैन तकनीक, उच्च संकल्प 4 मिनट ।
  4. Anesthetize 3% isoflurane की साँस लेना द्वारा चूहों और एक नाक शंकु संवेदनाहारी की एक निरंतर आपूर्ति प्रदान करने के साथ बोर में डाला बिस्तर पर उन्हें जगह. बिस्तर पर टेप के साथ चूहों के पंजे को लगाने के लिए छाती उजागर करने की अनुमति ।
  5. साधन दरवाजे स्लाइड और कब्जा बटन दबाकर वास्तविक समय में माउस की स्थिति को देखने के लिए लाइव मोड पर बारी. सीधे सीटी साधन पर स्थित बटन का उपयोग दृश्य (FOV) के क्षेत्र के साथ छाती संरेखित करने के लिए पशु बिस्तर हटो । माउस पर स्कैन केंद्र; यदि सीटी साधन पर स्थित बाएँ और दाएँ तीर के साथ स्थिति को समायोजित नहीं ।
  6. ९० ° का चयन करके और Set क्लिक करके गैन्ट्री को घुमाकर इष्टतम बिस्तर की स्थिति की पुष्टि करें। सुनिश्चित करें कि छवि के लिए क्षेत्र FOV के अंदर पूरी तरह से है ।
  7. किसी भी गेटिंग तकनीक को लागू न करें और सीटी स्कैन बटन को क्लिक कर स्कैन शुरू कर दीजिये । उस संदेश के लिए हां क्लिक करें जो सूचित करता है कि x-ray स्रोत चालू हो जाएगा ।
    नोट: एक बार एक्स-रे चालू हो जाने के बाद यंत्र के ऊपर नारंगी रंग का दीपक रोशन हो जाएगा और फिसलने का दरवाजा ऑपरेटर की सुरक्षा के लिए खोलना असंभव हो जाएगा । एक बार स्कैन समाप्त हो गया है, 2d दर्शक सॉफ्टवेयर की एक नई खिड़की transaxial, राज्याभिषेक, और पुनर्निर्माण के sagittal टुकड़ा दिखा दिखाई देता है ।
  8. छवि गुणवत्ता की जाँच करें और संज्ञाहरण के निम्न स्तर के कारण आंदोलनों से धुंधला छवियों के लिए सुनिश्चित नहीं है । यदि आवश्यक हो, तो स्कैन दोहराएं ।
  9. जानवरों को पिंजरे में वापस रखें और सुनिश्चित करें कि वे पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने ।

4. Bronchoalveolar लेवेज

  1. पेट के महाधमनी से रक्तस्राव द्वारा 3% isoflurane और बलिदान के साथ जानवरों Anesthetize ।
  2. वक्ष पिंजरे और गर्दन को बेनकाब करने के लिए कैंची का प्रयोग करें । तो श्वासनली बेनकाब और एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए बाल प्रक्रिया एक 21 गेज लेवेज सुई के बिना एक सिरिंज से जुड़ी ट्यूब के साथ प्रदर्शन किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं । ध्यान देना श्वासनली के माध्यम से कटौती नहीं है ।
  3. बाल प्रदर्शन करने के लिए, एक सुई के बिना 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें बाँझ समाधान की ०.६ मिलीलीटर [10x हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS); १०० mm ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA); 1 मिमी 4-(2-hydroxy-एथिल) -1-piperazineethansulphonic एसिड (HEPES); आसुत पानी] ।
  4. श्वासनली में चीरा में लेवेज ट्यूब डालें और धीरे सुई और समाधान 3 बार वापस लेने, तीसरे आहरण पर रोक के बाद विश्लेषण के लिए BALF के इष्टतम संग्रह की अनुमति दें ।

5. प्रोटोकॉल और Histomorphometry

  1. बेनकाब और फेफड़ों को दूर, उंहें 10% तटस्थ बफर formalin के ०.६ मिलीलीटर के साथ कोमल अर्क द्वारा श्वासनली के माध्यम से एक प्रवेशनी के साथ फुलाना और कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए नमूनों की दुकान ।
  2. शराब समाधान की सांद्रता बढ़ाने में विभिंन मार्ग के माध्यम से निर्जलीकरण नमूने (1 एच के लिए ६०% इथेनॉल, 1 एच के लिए ७०% इथेनॉल, 1 एच के लिए ९०% इथेनॉल, 2 घंटे के लिए ९५% इथेनॉल, और 2 घंटे के लिए १००% इथेनॉल) एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग कर ।
  3. उंहें पारदर्शी बनाने के लिए 2 घंटे के लिए xylene में नमूनों प्लेस । निर्जलीकरण के अंत में, 3 घंटे के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर आयल में नमूनों की घुसपैठ और स्वचालित प्रोसेसर में उंहें एंबेड ।
  4. एक रोटरी microtome का उपयोग कर 5 µm मोटी धारावाहिक वर्गों प्राप्त करें ।
  5. Deparaffinize और इथेनॉल के उतरते ग्रेड में reहाइड्रेट और Masson के Trichrome के साथ दाग एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग कर स्लाइड ।
  6. मैन्युअल रूप से फेफड़ों के स्लाइस पर ध्यान केंद्रित, एक स्लाइड स्कैनर का उपयोग कर 20X आवर्धन पर स्कैनिंग और ४५१ एनएम/पिक्सेल के एक संकल्प के साथ देखने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरे फेफड़ों वर्गों के डिजिटल छवियों पर कब्जा ।
  7. आकृति विज्ञान इस प्रकार के रूप में अर्द्ध मात्रात्मक और मात्रात्मक मापदंडों द्वारा fibrotic फेफड़ों की चोट का आकलन:
    1. Ashcroft स्कोर निर्धारित करते हैं । अर्द्ध मात्रात्मक Hübner एट अल द्वारा संशोधित Ashcroft10 द्वारा परिभाषित पैमाने के अनुसार फेफड़ों के वर्गों में ग्रेड रूपात्मक परिवर्तन । 25 फेफड़ों के वर्गों में सभी पैरेन्काइमा का आकलन करने के लिए 0-8 स्कोर की प्रणाली का प्रयोग करें ।
    2. कोलेजन सामग्री का निर्धारण । फाइब्रोसिस10,25 माइक्रोस्कोप छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के द्वारा की डिग्री को बढ़ाता है । प्रत्येक स्लाइड के अनुसार, 10x आवर्धन पर तीन ROIs का बेतरतीब ढंग से चयन करें । रंग थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स का मानकीकरण करके, हरे दाग क्षेत्र के रूप में कोलेजन का पता लगाने ।
    3. वायुकोशीय हवाई क्षेत्र का निर्धारण । फाइब्रोसिस10,25के एक अप्रत्यक्ष पैरामीटर के रूप में वायुकोशीय वायु क्षेत्र को बढ़ाता है । एक ही सॉफ्टवेयर और फाइब्रोसिस अंश के लिए लागू ROIs के माध्यम से, एक सफेद दहलीज का उपयोग कर ROIs के भीतर हवा क्षेत्र का पता लगाने ।

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Representative Results

फेफड़े फाइब्रोसिस घावों के सहज संकल्प एक ब्लीयामीसिन प्रशासन और उदारवादी संरचनात्मक परिवर्तन के बाद तीन सप्ताह मनाया इस मॉडल की सीमा पर प्रकाश डाला । केवल निवारक उपचार नैदानिक अभ्यास17का प्रतिनिधित्व नहीं करता है कि संकीर्ण चिकित्सीय खिड़की के कारण किया जा सकता है ।

यहां, हम प्रदर्शित करते है कि हमारे प्रोटोकॉल डबल ब्लीयामीसिन intratracheal जगाकर के चूहों में लंबे समय से स्थाई फेफड़ों की फाइब्रोसिस को विकसित करने में सक्षम है18। प्रायोगिक डिजाइन चित्रा 119,20,21में दिखाया गया है । इस अध्ययन के लक्ष्य को आक्रामक इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ चूहों में फेफड़े फाइब्रोसिस प्रगति को देखने के लिए है । ब्लीयामीसिन था intratracheally दो बार प्रशासित (दिन में 0 और 4; ५० में ब्लीयामीसिन के 1 मिलीग्राम/किलोग्राम प्रत्येक अवसर पर µ l). प्रत्येक समूह के लिए बारह चूहों intratracheally केवल एक ही समय में ब्लीयामीसिन समूह के रूप में एक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए वाहन के एक ही मात्रा के साथ चुनौती दी गई । फाइब्रोसिस के आकलन के लिए, एक अर्द्ध मात्रात्मक ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण Ashcroft स्कोरिंग प्रणाली के आधार पर किया गया था. 10

वर्तमान काम में, हम शास्त्रीय प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में माइक्रो सीटी और FMT प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके ब्लीयामीसिन प्रेरित माउस मॉडल में फेफड़ों फाइब्रोसिस विकास का आकलन किया । इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के इनवेसिव प्रकृति फेफड़ों फाइब्रोसिस प्रगति के नैदानिक मूल्यांकन के लिए वास्तविक मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है और प्रोटोकॉल के साथ पाया करार एक उत्कृष्ट कदम है । माइक्रो-सीटी इमेजिंग fibrotic घावों longitudinally के कारण फेफड़े parenchymal परिवर्तन के ठहराव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।

ब्लीयामीसिन इलाज समूह के प्रोटोकॉल चित्रों फाइब्रोसिस का एक स्पष्ट पैटर्न 7 दिन से शुरू दिखाया, मुख्य रूप से एकल fibrotic जनता के रूप में, और 14 दिन में प्रगति की प्रतिस्थापन कोलेजन के समूह के लिए धाराप्रवाह और 21 दिन तक अनछुए रह ( आंकड़े 2a-2c) । ब्लीयामीसिन उपचार प्रेरित फेफड़ों की सूजन (चित्रा 3ए), जहां WBC की संख्या ब्लीयामीसिन के BALF में काफी अधिक था 7, 14, और 21 दिनों में इलाज चूहों वाहन समूह की तुलना करें । दिलचस्प बात यह है कि लिम्फोसाइट और monocyte अंश भी नमूने के हर समय पर बढ़ गए थे (आंकड़े बी 3सी); इसके विपरीत, न्युट्रोफिल अंश की एक महत्वपूर्ण वृद्धि 7 दिन में मनाया गया है (चित्रा 3डी) ।

इस अध्ययन में माइक्रो-सीटी का इस्तेमाल फेफड़े के पैरेन्काइमा परिवर्तन longitudinally पर नजर रखने के लिए किया गया था । आधारभूत से अवलोकन के अलग समय अंक पर फेफड़े वास्तुकला के प्रगतिशील संरचनात्मक परिवर्तन स्पष्ट रूप से माइक्रो-सीटी अनुमानों (आंकड़े 4a-4B) में देखा जाता है । (आंकड़े 5 ए और 5C)19,20,21 और कुल फेफड़े फाइब्रोसिस प्रतिशत (आंकड़े 5B और 5d) के बाहर के भाग में airway त्रिज्या फाइब्रोसिस बढ़ सकता है । 7 दिन में ब्लीयामीसिन उपचार समूह में फाइब्रोसिस प्रतिशत ठहराव (चित्रा 5डी) प्रोटोकॉल स्कोरिंग की तुलना में थोड़ा अधिक आंका गया था. यह सूजन और फाइब्रोसिस शुरुआत की दोहरी प्रतिक्रिया द्वारा समझाया जा सकता है, यह मुश्किल दो लक्षणों के बीच अंतर करने के लिए बना । airway त्रिज्या और फाइब्रोसिस का प्रतिशत फेफड़ों के ठहराव के लिए माइक्रो-सीटी अनुमानों के छवि प्रसंस्करण से चयनित किया गया parenchymal परिवर्तन (आंकड़े 5C-5d)19,20,21 . इन माइक्रो-सीटी पैरामीटर ऊतकवैज्ञानिक निष्कर्षों के साथ समझौते में बहुत अच्छी तरह से कर रहे हैं के रूप में आंकड़े 2a/

माइक्रो-सीटी इमेजिंग सीधे रोग और फेफड़ों पैरेन्काइमा और FMT प्रौद्योगिकी के उपचारात्मक परिवर्तन परिलक्षित मात्रात्मक जानकारी प्रोटीन अभिव्यक्ति से संबंधित अधिक आईपीएफ को पसंद किया । इस अध्ययन के लिए, हम आईपीएफ के लिए अपनी प्रासंगिकता के आधार पर एक एमएमपी जांच चुना है और हम ब्लीयामीसिन इलाज चूहों में विशिष्ट MMPs सक्रियण पाया (चित्रा 6)18. MMPs की भूमिका या तो वाहन या ब्लीयामीसिन चयनित समय बिंदुओं पर एमएमपी activable फ्लोरोसेंट जांच के साथ चूहों का इलाज इंजेक्शन द्वारा जांच की गई है । चौबीस घंटे इंजेक्शन के बाद, चूहों FMT खुलासा है कि fibrotic चूहों vivo में विशिष्ट एमएमपी फ्लोरोसेंट जांच सक्रिय कर सकते हैं द्वारा imaged थे (आंकड़े 6A-6D)18 और पूर्व विवो (चित्रा 6ई)18 .

Figure 1
चित्र 1 : ब्लीयामीसिन-प्रेरित माउस फेफड़ों की फाइब्रोसिस के लिए प्रयोगात्मक सेट अप । C57BL/6 मादा चूहों दो अवसरों, दिन 0 और 4 पर या तो खारा या ब्लीयामीसिन जगाकर intratracheally था । चूहों आधारभूत (0 दिन), 7, 14, और 21 दिनों में एक माइक्रो सीटी स्कैनर द्वारा imaged थे । 12 चूहों के समूह 7, 14, और 21 दिनों में बलिदान और उनके फेफड़ों कोलेजन जमाव के लिए मूल्यांकन के लिए µ सीटी द्वारा प्राप्त छवियों के साथ ऊतकवैज्ञानिक परिणाम सहसंबंधी थे । यह आंकड़ा प्रकाशित लेख21से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: चूहों में ब्लीयामीसिन प्रेरित फेफड़े फाइब्रोसिस का ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण समय पाठ्यक्रम । 
(क) Ashcroft द्वारा फेफड़े फाइब्रोसिस का ठहराव स्कोर या तो वाहन या ब्लीयामीसिन अलग समय बिंदुओं पर चूहों का इलाज किया. प्रयोग तीन बार दोहराया गया था और प्रत्येक बिंदु 12 पशुओं का मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA द्वारा किया गया है Tukey परीक्षण के बाद । * p < ०.०५; * * p < ०.०१ ।
(ख) Ashcroft स्कोर आवृत्ति वितरण हल्के, उदारवादी, और गंभीर उपश्रेणियों में आवंटित.
(ग) Masson के Trichome सना हुआ माउस के प्रतिनिधि प्रोटोकॉल intratracheally डबल जगाकर ब्लीयामीसिन या खारा इलाज चूहों पर 7, 14, और 21 दिनों के बाद उपचार (आवर्धन 10x, स्केल बार २०० µm) के लिए फेफड़ों वर्गों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेलुलर घुसपैठ समय पाठ्यक्रम चूहों में ब्लीयामीसिन प्रेरित फेफड़ों की फाइब्रोसिस की BALF में । 
(क) WBC की संख्या, (ख) Monocytes, (ग) लिम्फोसाइटों, और (घ) न्यूट्रोफिल. BALF में पाया कोशिकाओं कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त किया गया * 103/µ l प्रयोग तीन बार दोहराया गया था और प्रत्येक बिंदु 9 पशुओं का मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA द्वारा किया गया है Dunnett परीक्षण के बाद । * p < ०.०५; * * p < ०.०१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : ब्लीयामीसिन-प्रेरित फेफड़े फाइब्रोसिस और वाहन इलाज चूहों के अनुदैर्ध्य माइक्रो-सीटी इमेजिंग अनुमानों । (क) माइक्रो सीटी, ब्लीयामीसिन माउस का इलाज किया और (ख) माइक्रो सीटी, खारा इलाज माउस कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : एयरवेज, फाइब्रोसिस फेफड़ों पालियों ठहराव और दोहराया माइक्रो सीटी इमेजिंग के आधार पर फॉल्ट ।
(क) वायुमार्ग एक केंद्रीय और बाहर के भाग में विभाजित किया गया । (ख) वायुमार्ग के बाहर का भाग intrapulmonary के रूप में फेफड़ों के पालियों में पहचानने और विभक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है: दायां कपाल पालि (RCrL), दायां मध्य पालि (RMdL), दायां Caudal पालि (RCdL), दायां गौण पालि (RAcL), और बायां फेफड़े (LL) । (ग) Airway त्रिज्या और (घ) कुल फेफड़ों की फाइब्रोसिस ठहराव या तो वाहन या ब्लीयामीसिन अलग समय बिंदुओं पर चूहों का इलाज किया. प्रत्येक बिंदु 5 पशुओं का मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है, कुल 30 चूहों के लिए । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA द्वारा किया गया है Dunnett परीक्षण के बाद । * p < ०.०५; * * p < ०.०१ । यह आंकड़ा प्रकाशित लेख21से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा । 6. प्रतिदीप्ति संकेत के समय पाठ्यक्रम FMT inbleomycin प्रेरित फेफड़े फाइब्रोसिस चूहों द्वारा मापा । vivo में (A और B) और पूर्व विवो (सी और डी) FMT के प्रतिनिधि छवियों के साथ इंजेक्शन चूहों एमएमपी जांच वाहन के साथ या ब्लीयामीसिन के साथ इलाज किया. (E) फेफड़ों प्रतिदीप्ति संकेत की कुल राशि स्वचालित रूप से FMT छवि सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की गई थी । प्रयोग तीन बार दोहराया गया था और प्रत्येक बिंदु 9 जानवरों का मतलब ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है । सांख्यिकीय विश्लेषण ANOVA द्वारा किया गया है Dunnett परीक्षण के बाद । * p < ०.०५; * * p < ०.०१ । यह आंकड़ा प्रकाशित लेख18से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

कई अनुसंधान के बावजूद नई दवाओं के विकास पर ध्यान केंद्रित समूहों आईपीएफ इलाज के लिए, इस समय केवल दो रोगियों के लिए उपलब्ध हैं । वहां एक तत्काल चिकित्सा के लिए और अधिक प्रभावी उपचार7 क्योंकि केवल फेफड़ों के लिए 4-5 साल26के अस्तित्व को लंबा कर transplantationis मिल की जरूरत है । शोधों चिकित्सा और नई दवाओं के विकास के लिए आवश्यक शर्त एक पशु मॉडल है कि आईपीएफ की सुविधाओं की नकल और जिसमें हस्तक्षेप अध्ययन क्लिनिक में सफलता की भविष्यवाणी कर रहे है की उपलब्धता है । हालांकि, मौजूदा फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस पशु मॉडलों की उपयोगिता अभी भी27विवादास्पद है । हम फेफड़ों फाइब्रोसिस का एक नया माउस मॉडल है कि ब्लीयामीसिन के एक डबल जगाकर की आवश्यकता के रूप में चित्रा 118में वर्णित विकसित करना । इमेजिंग प्रौद्योगिकियों शक्तिशाली उपकरण के लिए रोग प्रगति कल्पना कर रहे हैं, और उपचार के लिए औषधीय प्रतिक्रिया । इस पशु मॉडल बेहतर आईपीएफ और इनवेसिव प्रौद्योगिकियों के मानव सुविधाओं recapitulated नैदानिक सेटिंग्स और नैदानिक अभ्यास27के बीच एक पुल बना सकता है ।

हालांकि, मजबूत और reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए, कुछ कदम महत्वपूर्ण हैं । जब चूहों पूरी तरह anesthetized, एक मानकीकृत प्रक्रिया का उपयोग कर रहे हैं intratracheal जगाकर किया जाना चाहिए. माइक्रो-सीटी अधिग्रहण संज्ञाहरण के बहुत सटीक निगरानी की आवश्यकता है, क्योंकि सीटी अनुमानों श्वसन आवृत्ति से gated हैं । इमेजिंग से पहले, जांच करें कि चूहों संज्ञाहरण की एक ही गहराई है । FMT द्वारा ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम depilation है । शुरू करने से पहले, हमेशा पर और छाती के आसपास फर को दूर, तितर बितर और ऊतक में अवशोषित से बचने के लिए । जांच इंजेक्शन से पशुओं के शरीर के वजन को ठीक किए जाने की जरूरत है ।

जांच करने की संभावना है और एक विशिष्ट आणविक पढ़ने के लिए अलग समय बिंदुओं पर एक ही चूहों में संरचनात्मक परिवर्तन के साथ बाहर मात्रा फाइब्रोसिस विकास को समझने में एक बड़ा कदम का प्रतिनिधित्व करता है, कार्यात्मक के लिए एक स्पष्ट अग्रिम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औषधीय अध्ययन.

इस multimodal इमेजिंग दृष्टिकोण एक स्मार्ट उपकरण दवा प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, टर्मिनल मूल्यांकन की तुलना में बहुत अधिक जानकारी प्रदान करने, एक अधिक कुशल दवा डिस्कवरी प्रक्रिया में अनुवाद है ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक तकनीकी मदद के लिए डॉ डैनिएला Pompilio और रोबर्टा Ciccimarra का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३४ अज्ञातहेतुक फेफड़े फाइब्रोसिस (आईपीएफ) vivo में इमेजिंग FMT माइक्रो-सीटी फेफड़ों के रोग पशु मॉडल मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs) ब्लीयामीसिन
चूहों में ब्लीयामीसिन-प्रेरित फेफड़ों की फाइब्रोसिस के अनुदैर्ध्य आकलन के लिए माइक्रो-सीटी और प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी पर आधारित एक Multimodal इमेजिंग दृष्टिकोण
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Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

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