Summary
Vi beskriver en ikke-invasiv intermodal imaging tilnærming basert på mikro-CT og fluorescens molekylær tomografi langsgående vurdering av musen lunge fibrosis modellen av dobbel intratracheal instillasjon av bleomycin.
Abstract
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er en dødelig lungesykdom preget av progressive og irreversibel ødeleggelsen av lunge arkitektur, som forårsaker betydelig forringelse i lungefunksjonen og påfølgende død fra respirasjonssvikt.
Patogenesen av IPF i eksperimentelle dyr modeller har blitt indusert av bleomycin. I denne studien undersøker vi en IPF-lignende musemodell av en dobbel intratracheal bleomycin instillasjon. Standard histologiske vurderinger brukes for å studere lunge fibrosis er invasiv terminal prosedyrer. Målet med dette arbeidet er å overvåke lunge fibrosis gjennom noninvasive Bildeteknikker som fluorescerende molekylær tomografi (FMT) og Micro-CT. Disse to teknologiene validert histology funn kan representere en revolusjonerende funksjonell tilnærming for sanntid ikke-invasiv overvåking av IPF sykdommens alvorlighetsgrad og progresjon. Blanding av ulike tilnærminger representerer et skritt videre forstå IPF sykdommen, der de molekylære hendelsene som forekommer i en patologisk tilstand kan observeres med FMT og påfølgende anatomiske endringene kan overvåkes av mikro-CT.
Introduction
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er kronisk lungesykdom med progressiv nedgang lunge funksjoner som dessverre ofte fatal innen fire år diagnose1. Hovedfunksjonene til IPF er ekstracellulær matrix avsettelse og fibroblast spredning, men patogenesen er ennå ikke fullt ut forstått. Mest støttede hypotesen er at flere sykluser av lunge skader forårsake ødeleggelse av alveolar epitelceller som fører til endring av mesenchymal celle syklus spredning, overdreven akkumulering av fibroblaster og myofibroblasts, og økt matrix produksjon. Meglere involvert i disse prosessene matrise metalloproteinases (MMPs) har blitt funnet dysregulated fibrose utvikling i menneskelig IPF eller bleomycin-indusert dyremodeller. Ukontrollert MMP produksjon fører til en ubalansert avleiring av kollagen i lunge interstitium og alveolar plass, etterligne unormal såret reparasjon1,2.
En av de viktigste hindringene for medisiner og utvikling er tilgjengeligheten av tilgjengelig musen modeller som etterligner menneskelige patogenese og sykdom fenotypen. Forskjellige agenter har blitt brukt til å indusere lunge fibrosis dyremodeller: bestråling skade, administrasjon av asbest og silika, administrasjon av fibrinogenic cytokiner og bleomycin3,4; men bleomycin er mest brukte i mus, rotter, guinea pigs, hamsters, kanin5 eller i store dyr (ikke-menneskelige primater, hester, hunder og drøvtyggere)6,7. Bleomycin er en antibiotikaresistens laget av bakterien Streptomyces verticillus8 og brukes som en anti-kreft agent9. Lungefibrose er en vanlig side bevirke av stoffet og av denne grunn, det er brukt i eksperimentell dyremodeller for å indusere lungefibrose.
I bleomycin-indusert lunge fibrosis modeller forekommer fibrotiske lesjoner 14-21 dager etter bleomycin administrasjon. I presentert arbeidet brukte vi en ny protokoll for å indusere lunge fibrosis mus av dobbel bleomycin intratracheal instillasjon. Bleomycin musemodell er tidkrevende fordi nye stoffer må vurderes på etablerte fibrotiske lesjoner, og testet for å skille sin anti-fibrotiske effekter fra anti-inflammatoriske effekter.
Biokjemiske fastsettelse av kollagen innhold, morphometrical og histologiske analyse var basert på post mortem analyse, begrense muligheten til å følge patogenesen av sykdommen i samme dyret. Selv om disse parameterne ble betraktet som en gull-standard for fibrose evaluering, de ikke gir alle timelige eller romlige fordelingen av fibrotiske lesjonen og utelukke en måte å undersøke prosessen av sykdomsprogresjon. 10
Nylig, ikke-invasiv bildeteknologi er brukt på skjermen airway remodeling, betennelser og fibrose progresjon i murine modeller: magnetisk resonans Imaging (MRI), Micro konstatere (mikro-CT), fluorescens molekylær Tomografi (FMT) og Bioluminescent (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Vi foreslår en ikke-invasiv tenkelig tilnærming for å overvåke langs lunge fibrosis progresjon av FMT og mikro-CT på ulike tidspunkt etter en bleomycin utfordrer22.
Mange baner er involvert i etablering og utvikling av fibrosis, og ikke mye er kjent. Bare en dypere forståelse av disse prosessene kan oversette til mer narkotika mål som kan overføre til klinikken. Evnen å dataskjerm langs MMP aktivisering av fluorescens molekylær tomografi kombinert til deteksjon av lungekreft parenchymal endringer av mikro-CT kan brukes i fremtiden til klinisk respons på behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet her ble godkjent av intramural dyr-velferd for dyr eksperimentering Chiesi Farmaceutici og ERASMUS MC under Protokollnummer: EMC 3349 (138-14-07) i samsvar med det europeiske direktivet 2010/63 UE, Italiensk D.Lgs 26/2014 og av reviderte "Guide for det vare og bruk av forsøksdyr"23.
Merk: Før bruk, kvinnelige innavlet C57Bl/6 (7-8 uker gamle) mus var akklimatisert for minst 7 dager lokale vivarium vilkårene (romtemperatur: 20-24 ° C, relativ fuktighet: 40-70%, 12-h lys og mørke syklus), har gratis tilgang til standard gnager chow og myknet vann fra springen.
1. Intratracheal behandling av mus med Bleomycin
- Forberede utstyret for intra-tracheal instillasjon12,13,14.
- Plassere musene i bedøvende kammeret koblet til en isoflurane vaporizer satt til 2,5% blandes med oksygen. Se etter dybdeskarphet anestesi ved mangel på tå-klype svar. Effekten av av bedøvelsen skjedde etter 3-5 minutter.
- Plasser bedøvet musen på intubasjon plattformen, henger den i sine fortenner plassert på ledningen.
- Slå på laryngoskop, ta et par sløv endte tang og bruk tang eller laryngoskops tips å forsiktig åpne munnen.
- Trekk ut tungen og holde den til side med tang. Plasserer laryngoskop bladet mot baksiden av munnen til åpningen av luftrøret er visualisert og holde laryngoskop på plass.
- Med den andre hånden, setter du inn levering røret koblet til slutten av PE slangen inn i luftrøret, roterende treveis ventilen. Levere 50 µL av bleomycin (0.020 µg/mus). Etter instillasjon, raskt fjerne røret fra luftrøret å hindre kvelning. Hold musene oppreist i noen sekunder.
- Administrere bleomycin intratracheally på dag 0 gjenta på dag 4 (figur 1).
- Fjern musen fra intubasjon plattformen og overvåke musen i 30 minutter (tiden det tar å komme helt bedøvelsen).
- Utføre i vivo avbildning av mus lungene FMT og mikro-CT etter dobbel bleomycin instillasjon på dag 7 og 14 21.
2. i vivo Imaging av fluorescens molekylær tomografi
Merk: Forberede på forhånd, en frisk lagerløsning 6 nmol/ml av MMP følsom fluorescerende substrat 680 i saltvann (0,9% natriumklorid), og store beskyttet mot lyset på 4 ° C før bruk. Det er stabil for inntil 6 måneder på 4 ° C. Tillate MMP imaging agent å equilibrate til romtemperatur før injisere til dyr.
-
Sonden injeksjon
- Forberede utstyret for intravenøs injeksjon av MMP sonde løsningen. Pre varmt vann ved 50 ° C å varme musen halen.
- For å ta godt tak musen scruff, ta det med halen og la den grep bur lokket. Holde mus over dyrets skuldre, sette halen i et beaker med varmt vann, for 4 til maksimalt 8 s termisk skade å hindre termisk skade på halen huden. Sjekk venene hevelse for enklere visualisering og nåleinnføring.
- Under innsetting prosedyren, mus inn en plast restrainer å holde den stødig og trekke halen gjennom spesielle hull i ryggen. Finne to caudal årer på hver side av halen; ikke arterien på undersiden av halen.
- Sett inn nålen (26G) av 1 mL i venen. Hvis nålen er riktig plassert, injeksjon vil være enkelt og sonde løsningen vil strømme inn fartøyet.
- Injisere MMP sonde løsningen på 10 mL/kg.
- Kaste nålen.
Merk: Optimal tenkelig tidspunktet er 24 timer etter MMP sonde injeksjon fordi det er tiden sonden skal aktiveres. Hvis longitudinelle studier er utført, er optimal re injeksjon tiden 7 dager, som lar den fullstendig klarering av agent fra musen.
-
FMT bildebehandling
Merk: Før du starter, alltid fjerne pelsen på og rundt områdene av dyret som skal avbildes, i dette tilfellet brystet, unngå spredning og absorbansen i vev.- Å bedøve musen, innlegge det anesthetic kammer og slå isoflurane ring til 2,5% for induksjon og 2% for vedlikehold.
- Initialisere den oppkjøp programvaren og åpne en ny studie i databasen for eksperimentet.
- Før du starter avbilding med FMT, overfører du musen til tenkelig kassetten. Plass bedøvet musen midt imaging kassett for å bruke optimalt synsfelt av FMT. Holde musene flatt, sikker og forsiktig komprimert mot både windows av tenkelig kassetten. Juster høyden ved knotter på kassetten, og skyv den til forankringsenheten.
- Klikk på emnet i vinduet skanning og klikk Forhåndsvisning for å se live bildet.
- Tegne regionen skanning store nok slik at vevet rundt det forventede området fluorescens er tatt. Inkludert totalt 25 skanning poeng garantier blir regionen lunge helt skannet.
- Når Avkastningen er trukket, klikker du først legge til gjenoppbygging køen og deretter søke å image musen. Kontroller at riktig laser på 680 nm er valgt.
- Når bilde oppkjøpet er fullført, kan du plassere musen tilbake i buret sitt. Sørg for fullt gjenoppretter bedøvelsen.
- Kvantifisere picomoles av fluorescens i vinduet analyse av analyseprogramvare ROI-verktøyet og redusere Avkastningen rundt 700-800 mm3 på signalet fra regionen lunge. Være forsiktig å utelukke leveren signalet. Kopier Avkastningen på de andre fag å ha dem omtrent samme dimensjon og justere sin posisjon i hvert dyr bilde.
- Eksportere bilder som jpg-filer.
3. i Vivo Imaging av mikro-CT
Advarsel: Før du starter, fjerne alltid metall smykker eller metallgjenstander nær tenkelig, unngå spredning av røntgenstråler.
Merk: Stråling-indusert lunge fibrosis er en vanlig funn under stråling indusert lungen skade24. Mikro-CT avledet indekser verken histologiske funnene knyttet lunge fibrosis var tilstede i saltvann behandlet kontroll mus på dag 21 utsatt for fire mikro-CT imaging økter, noe som indikerer at X-ray dosen leveres til dyrene under mikro-CT eksamen var ikke tilstrekkelig til å påvirke resultatene.
- Slå på mikro-CT ved å trykke knappen grønn strøm og starter programvaren å varme opp x-ray kilden. Bruk liten bar og dyr sengen for mus imaging.
- Opprett databasen ved å klikke på ny database for en ny og bygge nettleseren basert på antall mus i eksperimentet, eller klikk Koble til eksisterende database for å lagre dataene på en tidligere opprettet.
- Før du starter skanning, Velg oppkjøpet parameterne i vinduet programvare: X-ray tube spenning, 90 kV; CT X-ray tube gjeldende, 160 µA; Live X-ray tube gjeldende, 80 µA; FOV, 36 mm; Ingen gating teknikk; Skanne teknikk, høy oppløsning 4 min.
- Bedøve mus ved inhalasjon av 3% isoflurane og plassere dem på sengen inn bar med en forpart gir en konstant tilførsel av bedøvelse. Nakkens paws av mus med tape på sengen slik at brystet utsettes.
- Skyv apparatet døren og slår på Live Mode å se musen plasseringen i sanntid ved å trykke på opptaksknappen. Flytte dyr sengen justere brystet med synsfelt (FOV) bruke knappene ligger på CT instrumentet. Center skanningen på musa; Hvis ikke Juster posisjon med venstre og høyre piltast på CT instrumentet.
- Bekreft optimal seng posisjon ved å rotere Portal ved å velge 90 ° og Angi. Kontroller at regionen bildet er helt innenfor FOV.
- Ikke bruk noen gating teknikk og starte skanningen ved å klikke CT-skanning . Klikk Ja i meldingen som informerer at x-ray kilde slås på.
Merk: Når x-stråler er slått på, den oransje lampen på instrumentet vil bli opplyst og skyvedøren blir umulig å åpne for sikkerheten til operatøren. Når skanningen er fullført, vises et nytt vindu av 2D seer programvare viser den transaxial, Koronal og sagittal stykke gjenoppbygging. - Sjekk bildekvaliteten og sørg for ikke å ha uskarpe bilder fra bevegelser på grunn av lavt nivå av anestesi. Om nødvendig gjenta skanningen.
- Plasserer dyrene tilbake i buret, og husk de fullt igjen bedøvelsen.
4. Bronchoalveolar Lavage
- Bedøve dyr med 3% isoflurane og offer av blødning fra abdominal aorta.
- Bruk saks for å avsløre thorax buret og halsen. Så utsette luftrøret og lag et lite innsnitt tillate BAL prosedyren utføres med en 21-gauge lavage rør festet til en 1 mL sprøyte uten nålen. Oppmerksomme ikke å skjære gjennom luftrøret.
- For å utføre BAL, fyll 1 mL sprøyte uten en nål med 0,6 mL steril [10 x Hanks balansert salt løsning (HBSS), 100 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA); 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic syre (HEPES), destillert vann.
- Lavage røret inn snitt i luftrøret og sakte injisere og trekke løsningen 3 ganger, pause på tredje tilbaketrekning som tillater optimal samling av BALF for senere analyse.
5. histologi og Histomorphometry
- Vise og fjerne lunger, blåse dem med en kanyle gjennom luftrøret av mild infusjon med 0,6 mL av 10% nøytrale fullbufrede formalin og lagre prøvene ved romtemperatur for 24 timer.
- Tørke prøver gjennom ulike passasjer i økende konsentrasjoner av alkohol løsninger (60% etanol 1t 70% etanol for 1t, 90% etanol 1t, 95% etanol for 2t og 100% etanol for 2t) bruker en automatisk basert vevsprosessor.
- Sett prøvene i xylen for 2t å gjøre dem gjennomsiktige. På slutten av dehydrering, infiltrere prøver parafin ved 60 ° C i 3t og bygge dem inn i automatiserte prosessoren.
- Få 5 µm tykk føljetong inndelinger ved hjelp av en roterende mikrotom.
- Deparaffinize og rehydrate lysbilder i synkende graderinger av etanol og flekker med Masson's Trichrome bruker en automatisk basert vevsprosessor.
- Manuelt fokus på lunge skiver, skanning med 20 X forstørrelse bruker en slide skanner og ta digitale bilder av hele lunge inndelinger ved hjelp av visning-programvare med en oppløsning på 451 nm/bildepunkt.
- Morphologically vurdere fibrotiske lunge skade ved semi kvantitative og kvantitative parametere som følger:
- Bestemme Ashcroft score. Semi kvantitativt klasse morfologiske endringer i lunge inndelinger i henhold til skalaen definert av Ashcroft10 endret av Hübner et al. 25 bruk systemet av 0-8 score for å vurdere alle parenchyma i delene lunge.
- Bestemme kollagen innholdet. Kvantifisere graden av fibrose10,25 av mikroskopet bildet analyseprogramvare. Tilfeldig velge tre ROIs på 10 X forstørrelse, per hvert lysbilde. Ved standardisering av terskelen fargeinnstillinger, oppdage kollagen som green-farget område.
- Bestemme området Alveolar luft. Kvantifisere alveolar luft området som en indirekte parameter fibrose10,25. Ved hjelp av den samme programvare og ROIs søkt fibrose brøkdel, oppdage luft området innenfor ROIs bruker en hvit terskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan oppløsning av lunge fibrosis lesjonene observert tre uker etter ett bleomycin administrasjon og moderat strukturendringer markere grensene for denne modellen. Bare forebyggende behandling kan utføres på grunn av smale terapeutiske vinduet som ikke representerer klinisk praksis17.
Her viser vi at våre protokollen av dobbel bleomycin intratracheal instillasjon er stand til å utvikle langvarig lunge fibrosis mus18. Eksperimentell design er vist i figur 119,20,21. Målet med denne studien er å se på lunge fibrosis progresjon i mus med noninvasive bildeteknologi. Bleomycin var intratracheally administrert to ganger (på dag 0 og 4; 1 mg/kg av bleomycin i 50 µL hver gang). Tolv mus for hver gruppe var intratracheally utfordret med samme volum kjøretøy bare samtidig som gruppen bleomycin å bruke som en kontroll. For vurdering av fibrosis, var en semi kvantitative histologiske analyse gjort basert på Ashcroft poengsystem. 10
I den nåværende arbeidet vurdert vi lunge fibrosis utvikling i bleomycin-indusert musemodell ved hjelp av mikro-CT og FMT teknologi i kombinasjon med klassisk histology. Noninvasiv natur imaging teknologi representerer reell verdi for prekliniske evaluering av lunge fibrosis progresjon og avtalen med histology er en utmerket steg. Mikro-CT bildebehandling kan spille en viktig rolle i kvantifisering av lunge parenchymal endringer på grunn av fibrotiske lesjoner langs.
Histology bilder av bleomycin behandlet gruppen viste et markant mønster av fibrose fra dag 7, som enkelt fibrotiske massene, kommet på dag 14 til confluent konglomerater av substitutive kollagen og forble uendret til dag 21 ( Tall 2A - 2 C). Bleomycin behandling indusert lungebetennelse (Figur 3A), der antall WBC var betydelig høyere i BALF bleomycin behandlet mus på 7 og 14 21 dager sammenlignet kjøretøy gruppe. Interessant, økt lymfocytter og monocytt fraksjoner også ved hver prøvetaking (tall 3B-3 C); derimot har en betydelig økning av nøytrofile brøken blitt observert på dag 7 (Figur 3D).
I denne studien ble mikro-CT brukt til å overvåke lunge parenchyma endringene langs. Progressiv anatomiske endringer av lunge arkitekturen på ulike tidspunkt observasjon fra grunnlinjen er tydelig i mikro-CT anslag (tall 4A-4B). Airway radius i den nedre del av bronkial treet (tall 5A og 5 C)19,20,21 og totale lunge fibrosis prosent (tall 5B og 5 D) kunne kvantifisere fibrose progresjon. Fibrose prosent kvantifisering i bleomycin behandlingsgruppe på dag 7 (figur 5D) var litt overvurdert hvis sammenlignet med histology scoring. Dette kan forklares med en dobbel reaksjon av betennelser og fibrose utbruddet, gjør det vanskelig å skille mellom de to symptomene. Airway radius og andelen fibrose ble valgt bilde behandling av mikro-CT anslagene for kvantifisering av lunge parenchymal endringer (Tall 5 C-5 D)19,20,21 . Disse mikro-CT-parametrene er godt med histologiske funn som vist i Tall 2A/2 C.
Mikro-CT imaging direkte reflektert patologisk og terapeutiske endringer av lunge parenchyma og FMT teknologi gitt kvantitativ informasjon mer relatert til protein uttrykk gjerne IPF. For denne studien, valgte vi en MMP sonde basert på relevansen til IPF og fant vi bestemt MMPs aktivisering bleomycin behandlet mus (figur 6)18. Rollen MMPs har blitt undersøkt ved å injisere kjøretøy eller bleomycin behandlet mus med MMP activable fluorescerende sonder på valgt tidspunkt. Tjuefire timer etter injeksjonen, ble musene fotografert av FMT avsløre at fibrotiske mus kan aktivere bestemte MMP fluorescerende sonde i vivo (tall 6A 6 D)18 og ex vivo (figur 6E)18 .
Figur 1 : Eksperimentell satt opp for bleomycin-indusert musen lunge fibrosis. C57BL/6 kvinnelige musene hadde enten saltvann eller bleomycin innpodet intratracheally på to anledninger, dag 0 og 4. Mus ble fotografert av en mikro-CT skanner ved baseline (dag 0), 7, 14 og 21 dager. Grupper av 12 mus ble ofret ved 7, 14 og 21 dager og lungene ble vurdert for avleiring av kollagen å korrelere histologiske resultater med bilder ved µCT. Dette tallet er endret fra den publiserte artikkel21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: histologiske analyse tid selvfølgelig bleomycin indusert lunge fibrosis mus.
(A) kvantifisering av lunge fibrosis av Ashcroft score enten kjøretøy eller bleomycin behandlet mus på ulike tidspunkt. Forsøket ble gjentatt tre ganger og hvert punkt representerer den gjennomsnittlig ± SEM 12 dyr. Statistisk analyse er utført av ANOVA etterfulgt av Tukey's test. * p < 0,05; ** p < 0,01.
(B) Ashcroft score frekvens distribusjon i mild, moderat og alvorlig underkategorier.
(C) representant histology av Masson's Trichome farget musen lunge deler for intratracheally dobbel innpodet bleomycin eller saltvann behandlet mus på 7 og 14 21 dager innlegg behandling (10 X forstørrelse, skala bar 200 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Cellular infiltrasjon tid kurs i BALF av bleomycin indusert lunge fibrosis mus.
(A) antall WBC, (B) monocytter, (C) lymfocytter og (D) nøytrofile. Cellene i BALF ble uttrykt som antall celler * 103/µL. Forsøket ble gjentatt tre ganger og hvert punkt representerer den gjennomsnittlig ± SEM 9 dyr. Statistisk analyse er utført av ANOVA etterfulgt av Dunnett's test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Langsgående mikro-CT tenkelig projeksjoner av bleomycin-indusert lunge fibrosis og kjøretøy behandlet mus. (A) mikro-CT, bleomycin behandlet mus og (B) mikro-CT, saltvann behandlet mus Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Airways, fibrose lunge lobes kvantifisering og segmentering basert på gjentatte mikro-CT bildebehandling.
(A) Airways ble delt inn i en sentral og distale del. (B) den distale del av luftveiene er den intrapulmonary skrift brukes til å identifisere og delt i lunge fliker som: høyre Cranial Lobe (RCrL), høyre midtre Lobe (RMdL), høyre Caudal Lobe (RCdL), høyre tilbehør Lobe (RAcL) og venstre lunge (LL). (C) Airway radius og (D) total lunge fibrosis kvantifisering kjøretøy eller bleomycin behandlet mus på ulike tidspunkt. Hvert punkt representerer den gjennomsnittlig ± SEM 5 dyr, totalt 30 mus. Statistisk analyse er utført av ANOVA etterfulgt av Dunnett's test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Dette tallet er endret fra den publiserte artikkel21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur. 6. tid selvfølgelig fluorescens signal målt ved FMT inbleomycin indusert lunge fibrosis mus. i vivo (A og B) og ex vivo (C og D) FMT representant bilder av mus injisert med MMP sonde behandlet med kjøretøy eller bleomycin. (E) den totale mengden lunge fluorescens signal automatisk beregnet av FMT programvare. Forsøket ble gjentatt tre ganger og hvert punkt representerer gjennomsnittlig ± standardavviket for 9 dyr. Statistisk analyse er utført av ANOVA etterfulgt av Dunnett's test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Dette tallet er endret fra den publiserte artikkel18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for mange forskningsmiljø fokuserer på å utvikle nye medisiner til å behandle IPF, i øyeblikket er bare to tilgjengelig for pasienter. Det er en medisinsk haster å finne mer effektive behandlinger7 fordi bare lunge transplantationis kunne forlenge overlevelsen av 4-5 år26. En viktig forutsetning for translasjonsforskning medisin og utvikling av nye stoffer er tilgjengeligheten av en dyremodell som etterligner funksjonene IPF og hvor intervensjonsradiologi studiene er intelligent suksess i klinikken. Nytten av eksisterende lungefibrose dyr modeller er imidlertid fortsatt kontroversielt27. Vi utvikler en ny musemodell av lunge fibrosis som krever en dobbel instillasjon av bleomycin som beskrevet i figur 118. Bildebehandling teknologier er kraftige verktøy for å visualisere sykdomsprogresjon, og farmakologiske respons på behandling. Denne dyremodell bedre recapitulated menneskelige funksjonene i IPF og noninvasive teknologier kan opprette en bro mellom innstillingene for preklinisk og klinisk praksis27.
Men for å få robust og reproduserbar, er noen trinn avgjørende. Intratracheal instillasjon må utføres når mus er fullt anesthetized, bruker en standardisert prosedyre. Mikro-CT oppkjøpet krever svært nøyaktig overvåking av anestesi, fordi CT anslagene er gated av respiratoriske hyppigheten. Før bildebehandling, sjekk at mus har samme dybde av anestesi. Et svært viktig skritt for optisk tenkelig av FMT er cellulite. Før du starter, Fjern alltid pelsen på og rundt brystet, unngå spredning og absorbansen i vev. Sonden injeksjon trenger å bli korrigert av kroppsvekten av dyret.
Muligheten til å undersøke og kvantifisere en bestemt molekylær skrivebeskyttet ut med anatomiske endringer i samme mus på ulike tidspunkt representerer et stort skritt i forståelse fibrose utvikling, en tydelig forhånd for funksjonell samt farmakologiske studier.
Denne multimodal imaging tilnærming er en smart verktøyet å evaluere narkotika effekt, gir mye mer informasjon i forhold til terminal vurdering, oversette i en mer effektiv stoffet funnet prosess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Daniela Pompilio og Roberta Ciccimarra for teknisk hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , National Research Council. Washington DC. (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
