Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Мультимодального Imaging подход на основе микро CT и флуоресценции молекулярные томографии для продольной оценки фиброза блеомицин индуцированного легких у мышей

doi: 10.3791/56443 Published: April 13, 2018

Summary

Мы описываем неинвазивные смешанных изображений подход, основанный на микро-CT и флуоресценции молекулярные томографии для продольной оценки модели фиброз легких мыши, вызванных двойной трахею инстилляции блеомицин.

Abstract

Идиопатического легочного фиброза (МГЛ) является фатальной легких заболевание, характеризующееся постепенного и необратимого уничтожения легкого архитектуры, которая вызывает значительное ухудшение в легочной функции и последующей смерти от дыхательной недостаточности.

Патогенез МГЛ в экспериментальных моделях на животных были индуцированных блеомицин администрации. В этом исследовании мы исследуем модель МГЛ как мышь, вызванных инстилляции блеомицин двойной трахею. Стандартный гистологические оценки, используются для изучения фиброз легких являются инвазивные процедуры терминала. Целью этой работы является для мониторинга фиброз легких через неинвазивные методы визуализации как флуоресцентные молекулярной томография (ДРМ) и микро-CT. Эти две технологии, проверяются с выводами Гистологическая картина может представлять революционный функциональный подход для Неинвазивный мониторинг в реальном времени тяжести заболевания МГЛ и прогрессии. Сочетание различных подходов представляет собой шаг вперед для понимания болезни МГЛ, где молекулярные события, происходящие в патологические состояния могут наблюдаться с ДРМ и последующие анатомические изменения можно контролировать с помощью микро-CT.

Introduction

Идиопатического легочного фиброза (МГЛ) — хроническое заболевание легких с постепенное уменьшение функции легких, к сожалению, часто со смертельным исходом в течение четырех лет диагноз1. Основные функции МГЛ внеклеточной матрицы осаждения и пролиферации фибробластов, но патогенез еще не полностью понял. Наиболее поддерживаемых гипотеза является, что несколько циклов легких травм вызывает разрушение альвеолярных клеток эпителия, что приводит к изменения мезенхимальных клеточного цикла распространения, преувеличенные накопление фибробластов и миофибробласты, и увеличение матрица производства. Посредников, участвующих в этих процессах, такие, как матрицы металлопротеиназ (MMPs) были обнаружены dysregulated в развитие фиброза в человека МГЛ или блеомицин индуцированного животных моделях. Неконтролируемого производства ММЗ приводит к несбалансированным коллаген осаждения в интерстиции легких и альвеолярного пространства, подражая аномальные рану ремонт1,2.

Одним из основных препятствий для обнаружения наркотиков и развития является наличие доступных мыши моделей, которые имитируют человека патогенеза и фенотип болезни. Различные агенты были использованы, чтобы побудить фиброз легких в животных моделях: облучение повреждения, администрация асбеста и кремнезема, администрация fibrinogenic цитокинов и блеомицин3,4; Однако блеомицин является наиболее используемым в мышей, крыс, морские свинки, хомячки, кролики5 или в крупных животных (нечеловеческих приматов, лошадей, собак и жвачных животных)6,7. Блеомицин является антибиотиком, сделанные бактерией Streptomyces verticillus8 и используется в качестве агента противораковых9. Легочный фиброз общий побочный эффект препарата и по этой причине, он используется в экспериментальных моделях на животных побудить легочного фиброза.

В легких, блеомицин индуцированного фиброза модели фиброзных поражениях происходят 14-21 дней после блеомицин администрации. В представленной работе мы использовали новый протокол побудить фиброз легких у мышей с двойной блеомицин трахею инстилляции. Блеомицин модель мыши очень много времени, потому что новые препараты должны оцениваться по установленным фиброзных поражениях и испытания, чтобы отличить их анти фиброзный эффект от противовоспалительным действием.

Биохимические определение содержания коллагена, морфометрических и гистологический анализ основывались на анализе mortem пост, ограничивая возможность следовать патогенез заболевания в то же самое животное. Хотя эти параметры были считается золотым стандартом для оценки фиброза, они не обеспечивают любой временной или пространственной распределение фиброзных поражения и исключает возможность исследовать процесс прогрессирования заболевания. 10

Недавно, неинвазивной визуализации технологии были применены к монитор сократимость Ремоделирование, воспаления и прогрессии фиброза в мышиных моделях: магнитно-резонансной томографии (МРТ), компьютерная томография микро (Micro-CT), флуоресценции молекулярной Томография (ДРМ) и биолюминесцентных (BLI)11,12,13,14,,1516,,1718,19 ,,2021. Мы предлагаем неинвазивная изображений подход для мониторинга продольно прогрессии фиброза легких ДРМ и микро-CT в разные время очки после блеомицин вызов22.

В создании и развитии фиброза участвуют многие пути, и не так много известно. Только глубокое понимание этих процессов может перевести на более лекарственных препаратов, которые могут передавать в клинику. Возможность продольно контролировать MMP активации по молекулярной томография флуоресценции сочетании для обнаружения изменений легких Паренхиматозный микро-CT может использоваться в будущем для доступа к клинической реакции на лечение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описываемые опыты на животных были утверждены Комитетом интрамуральных-животных для экспериментов на животных Chiesi Farmaceutici и ERASMUS MC под номером протокола: EMC 3349 (138-14-07) соблюдения Европейской директивы 2010/63 УП, Итальянские D.Lgs 26/2014 и пересмотренный «Руководство для ухода и использования лабораторных животных»23.

Примечание: Перед использованием, женский инбредных мышей C57Bl/6 (7-8 недель) были акклиматизированы для по крайней мере 7 дней к условиям местной виварий (комнатной температуре: 20-24 ° C, относительная влажность: 40-70%; 12-h свето тени цикла), имея свободный доступ к стандартным грызунов Чоу и размягченного водопроводной воды.

1. трахею лечение мышей с блеомицин

  1. Подготовка оборудования для intra трахеи инстилляции12,,1314.
  2. Положите мышей в зале цистит, подключенных к изофлюрановая испаритель установлен на 2,5%, смешанной с кислородом. Проверка глубины анестезии, отсутствие реакции мыс пинча. Влияние анестезии произошло после 3-5 мин.
  3. Позиции наркотизированных мыши на платформе интубации, висит на его резцов размещены на проволоку.
  4. Включите ларингоскопа, взять пару тупых закончился щипцов и использовать щипцы или ларингоскопа кончик аккуратно открыть рот.
  5. Вытащить язык и держать его в сторону с щипцами. Ларингоскоп лезвие в задней части рта до открытия трахеи визуализируется и удержание Ларингоскоп на месте.
  6. С другой стороны вставьте доставки трубки подключены к концу трубы PE в трахею, вращающихся трехходовой клапан. Доставить 50 мкл Блеомицин (0,020 мкг/мышь). После инстилляции быстро снять трубку от трахеи для предотвращения удушья. Держите мышей в вертикальном положении на несколько секунд.
    1. Администрировать блеомицин intratracheally в день 0 и повторить на день 4 (рис. 1).
  7. Удалите мышь от платформы интубации и контролировать мышь для 30 мин (время, необходимое для полного восстановления от анестезии).
  8. Выполните в vivo томографии легких мышей ДРМ и микро-CT после инстилляции двойной блеомицин на 7, 14 и 21 день.

2. в естественных условиях изображений по флуоресценции молекулярной томография

Примечание: Заранее, готовить свежий раствор 6 нмоль/мл ММП чувствительных флуоресцентные субстрата 680 в физиологический раствор (0,9% хлорида натрия) и хранить защищенный от света на 4 ° C перед использованием. Он стабилизирован на срок до 6 месяцев при 4 ° C. Разрешить MMP изображений агента, чтобы сбалансировать до комнатной температуры перед инъекцией в животных.

  1. Зонд инъекций
    1. Подготовка оборудования для внутривенного введения раствора зонд ММП. Предварительно теплой водой при 50 ° C тепла хвост мыши.
    2. Возьмите мышь загривок, взять его за хвост и позволяют ему сцепление крышку отсека. Проведение мышей через плечи животного, положите хвост в стакан теплой воды, для 4 до максимум 8 s термической травмы для предотвращения тепловой травмы кожи хвост.  Проверьте вен, отеки легче визуализации и иглы.
    3. Во время процедуры инъекции, положите мышей в пластиковый фиксатор, чтобы держать неподвижно и тянуть хвост через специальное отверстие в задней части. Найти два хвостового вен по бокам хвоста; не артерии на нижней части хвоста.
    4. Вставьте иглу (26G) 1 мл шприца в Вену. Если правильно размещен иглы, инъекции будет легко и зонд решение будет поступать в судна.
    5. Внедрять решение MMP зонд на 10 мл/кг.
    6. Выбросите иглу.
      Примечание: Оптимальный изображений время суть 24 ч после введения зонда MMP потому что это время зонд активируется. Если выполняются продольного исследования, время оптимальный повторные инъекции составляет 7 дней, который позволяет для полного разминирования агента от мыши.
  2. ДРМ изображений
    Примечание: Перед началом, всегда удалить мех на и вокруг области животного, которые должны быть imaged, в данном случае груди, чтобы избежать рассеяния и поглощения в ткани.
    1. Анестезировать мыши, положить его в камере обезболивающий и повернуть ручку изофлюрановая, 2,5% для индукции и 2% на техническое обслуживание.
    2. Инициализация программы для сбора данных и открыть новое исследование в базе для эксперимента.
    3. Перед началом съемки с ДРМ, передача мышь в изображений кассету. Поместите наркотизированных мыши в середине изображений кассету оптимально использовать поле зрения ДРМ. Держите мышей плоский, безопасный и аккуратно сжатых против обоих windows изображений кассету. Отрегулируйте высоту, ручки на кассету, а затем вставьте его в док-станции.
    4. Нажмите на предмет в окне сканирования и нажмите кнопку Просмотр , чтобы увидеть живой.
    5. Нарисуйте область сканирования достаточно большой так что захватили ткани вокруг предполагаемой области флуоресценции. Включая в общей сложности 25 сканирования точек гарантии легких регион будет полностью проверенных.
    6. После того, как рисуется ROI, сначала нажмите Добавить в очередь реконструкции и нажмите Сканировать изображения мышью. Убедитесь, что правильной лазера на 680 нм выбран.
    7. После завершения загрузки изображений, поместите курсор мыши обратно в своей клетке. Убедитесь, что он полностью восстанавливается от анестезии.
    8. Количественно пикомоль флуоресценции в окне анализа с использованием ROI инструмент программного обеспечения для анализа и снизить рентабельность около3 700-800 мм на сигнал из региона легких. Будьте осторожны, чтобы исключить печени сигнала. Скопируйте ROI по другим предметам у них аналогичные в измерении и скорректировать свои позиции в каждом изображении животных.
    9. Экспорт изображений в jpg файлы.

3. в естественных условиях изображений по микро CT

Предупреждение: Перед началом, всегда удалите любые ювелирных изделий металла или металлических объектов вблизи области изображения, чтобы избежать рассеяния рентгеновских лучей.

Примечание: Фиброз легких, радиационно индуцированных является общий вывод во время излучения индуцированных повреждений легких24. Микро-CT производные индексы ни гистологические результаты, связанные с фиброзом легких присутствовали в солевой обработки управления мышей на 21 день подвергали четыре микро-КТ изображений сессий, указав, что дозы рентгеновского доставлены к животным во время микро-CT экзамены не был достаточно, чтобы повлиять на результаты.

  1. Включите микро-CT, нажав на кнопку зеленый питания и запуск программного обеспечения для разогрева источник рентгеновского излучения. Использование малого диаметра и животного кровать для мышей изображений.
  2. Создайте базу данных, нажав на новой базы данных для нового и построить браузер основанный на количество мышей в эксперименте, или нажмите кнопку Подключение к существующей базе данных для сохранения данных в один ранее созданный.
  3. Перед началом сканирования, выберите приобретение параметры в окне программного обеспечения управления: Рентгеновская трубка напряжения, 90 кв; КТ рентгеновские трубки тока, 160 МКА; Live ток, рентгеновская трубка 80 МКА; ПЗ, 36 мм; Не стробирования технику; Высокое разрешение сканирования технику, 4 мин.
  4. Анестезировать мышей при вдыхании 3% изофлюрановая и разместить их на кровати, вставляется в отверстие с носовой конус, обеспечивая постоянную поставку анестетика. Иммобилизации лапы мышей с лентой на кровать, чтобы дать грудь, чтобы подвергаться.
  5. Сдвиньте дверцу инструмента и включите Режим Live , чтобы увидеть положение мыши в режиме реального времени, нажав на кнопку захвата. Перемещение животных кровати для выравнивания груди с поля зрения (FOV) с помощью кнопок, расположенных непосредственно на инструменте CT. Центр сканирования мыши; Если не настроить положение с стрелками влево и вправо, расположенный на инструменте CT.
  6. Подтвердите положение оптимального кровати, вращающейся портальный, выбрав 90 ° и нажав кнопку задать. Убедитесь, что регион изображение полностью внутри ПЗ.
  7. Не применять любые шлюзовые технику и запустите сканирование, нажав на кнопку компьютерной томографии . Нажмите кнопку Да в сообщение, которое сообщает, что будет включен источник рентгеновского излучения.
    Примечание: После рентгена включены, оранжевая лампа на вершине инструмента будет освещаться и раздвижные двери будет невозможно открыть для безопасности оператора. После завершения сканирования, откроется новое окно просмотра программное обеспечение 2D показаны transaxial, корональных и сагиттальной ломтик реконструкции.
  8. Проверьте качество изображения и будьте уверены, чтобы не размыть изображения от движений из-за низкого уровня анестезии. При необходимости повторите сканирование.
  9. Поместите животных обратно в отсек и убедитесь, что они полностью оправиться от анестезии.

4. Бронхоальвеолярный лаваж

  1. Анестезировать животных с 3% изофлюрановая и жертву, кровотечение из брюшной аорты.
  2. Используйте ножницы, чтобы разоблачить грудной клетки и шеи. Затем подвергать трахеи и сделать небольшой надрез, чтобы позволить бал процедуры должны быть выполнены с 21-го калибра промывание труб, прилагается к 1 мл шприц без иглы. Обратите внимание, чтобы не прорезать трахеи.
  3. Чтобы выполнить BAL, заполните 1 мл шприц без иглы с 0,6 мл стерильного раствора [10 x Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS); 100 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); 1 мм 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic кислоты (HEPES); дистиллированной вода].
  4. Вставьте трубу промывание в разрез в трахею и медленно вдохнуть и отозвать решение 3 раза, останавливаясь на третьем вывода позволяет оптимальную коллекцию BALF для последующего анализа.

5. гистология и Histomorphometry

  1. Разоблачить и удаление легких, надувать их с катетер через трахею нежный инфузии с 0,6 мл 10% буферизацией нейтрального формалина и хранить образцы при комнатной температуре в течение 24 ч.
  2. Обезвоживает образцы через различные ходы в повышении концентрации спиртовых растворов (60% этанола за 1 ч, этанол 70% для 1 h, 90% этанола за 1 ч, этанол 95% для 2 h и 100% этанола для 2 h) с использованием автоматического ткани процессора.
  3. Поместите образцы в ксилоле 2 h сделать их полупрозрачными. В конце обезвоживания проникнуть образцов в парафин при 60 ° C 3 h и вставлять их в автоматизированных процессор.
  4. Получите 5 мкм толщиной серийный разделы, используя микротом роторный.
  5. Deparaffinize и увлажняет слайды в убывающем сортов этанола и пятна с Массон в Trichrome с использованием автоматического ткани процессора.
  6. Сосредоточиться на кусочки легких, сканирование при 20-кратном с помощью слайд-сканер и захвата цифровых изображений всей легких разделов, используя программное обеспечение для просмотра с разрешением 451 Нм/пиксель вручную.
  7. Морфологически оценить повреждения фиброзных легких, полу количественных и качественных параметров следующим образом:
    1. Определите показатель Ashcroft. Полу-количественно класс морфологические изменения в легких секций по шкале определяется Эшкрофт10 изменена Hübner et al. 25 использование системы 0-8 Оценка оценить все паренхимы легких секций.
    2. Определите содержание коллагена. Количественно оценить степень фиброза10,25 , программное обеспечение для анализа изображения микроскопа. Случайным образом выберите три ROIs при 10-кратном, показа каждого слайда. По стандартизации параметров порог цвета обнаружить коллагена как Грин окрашенные области.
    3. Определите области альвеолярного воздуха. Количественную оценку участка альвеолярного воздуха как параметр косвенные фиброз10,25. С помощью же программное обеспечение и трансформирования, применяется для фракция фиброз обнаружить области воздуха в пределах ROI, с использованием белого порог.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Спонтанное резолюции поражений фиброз легких наблюдается через три недели после одного блеомицин администрации и умеренные структурные изменения выделения пределы этой модели. Только профилактическое лечение может быть выполнена из-за узких терапевтических окно, которое не представляет клинической практике17.

Здесь мы демонстрируем, что наш протокол двойной блеомицин трахею инстилляции способна развивать долгосрочные фиброз легких в мышей18. Экспериментальный дизайн показано на рисунке 119,,2021. Цель этого исследования заключается в взглянуть на прогрессии фиброза легких у мышей с неинвазивной визуализации технологии. Блеомицин был intratracheally ведении дважды (в день 0 и 4; 1 мг/кг блеомицин в 50 мкл каждый раз). Двенадцать мышей для каждой группы были оспорены с такой же объем транспортного средства только в то же время блеомицин группы для использования в качестве элемента управления intratracheally. Для оценки фиброза, полу количественного гистологический анализ было сделано на основании Эшкрофт балльной системы. 10

В настоящей работе мы оценили развитие фиброза легких в блеомицин индуцированного мышиной модели с помощью микро-CT и ДРМ технологий в сочетании с классической гистологии. Неинвазивный характер imaging технологии представляет реальную ценность для доклинической оценке прогрессирования фиброза легких и соглашение с Гистологическая картина является прекрасным шагом. Микро-КТ может играть важную роль в количественной оценке Паренхиматозный изменения легких вследствие фиброзных поражениях продольно.

Гистология фотографии блеомицин относились группы показан шаблон выраженный фиброз, начиная с дня 7, главным образом в качестве единого фиброзных масс и продвинулись на 14 день вырожденная конгломератов заместительной коллагена и оставался неизменным до дня 21 ( Мультфильмов 2A - 2 C). Блеомицин лечения индуцированных воспаление легких (рисA), где количество Лейкоцитов был значительно выше в BALF блеомицин лечение мышей на 7, 14 и 21 день сравнить группу транспортного средства. Интересно, что лимфоцитов и моноцитов фракции также были увеличены на каждом выборки (цифры 3B-3 C); в отличие от этого было отмечено значительное увеличение доли нейтрофилов в день 7 (рис. 3D).

В этом исследовании микро-CT был использован для мониторинга изменения паренхимы легких продольно. Прогрессивные анатомические изменения легких архитектуры в разное время точках наблюдения от базовой отчетливо видны в микро-CT прогнозы (цифры 4A-4B). Сократимость миокарда радиус в дистальной части и бронхиального дерева (цифры 5А и 5 C)19,,2021 процент всего легкого фиброз (цифры 5B и 5 D) могут количественно прогрессии фиброза. Количественная оценка процент фиброза в группе лечения блеомицин на день 7 (рис. 5D) слегка был завышен, если по сравнению с скоринга гистологии. Это можно объяснить двойной реакцией воспаления и фиброз начала, что делает его трудно проводить различие между двумя симптомы. Радиус сократимость и процент фиброза были отобраны из обработки изображений микро-CT прогнозов для количественной оценки легких Паренхиматозный изменения (Цифры 5 C-5 D)19,20,21 . Эти параметры микро-CT, очень хорошо с согласия гистологические результаты, как показано в Цифры 2A/2 C.

Микро-КТ изображений непосредственно отражает патологической и терапевтического изменения паренхимы легких и ДРМ технология обеспечивает количественную информацию, более связанные с выражения протеина, любил МГЛ. Для этого исследования мы выбрали MMP зонд, основанный на ее актуальности для МГЛ, и мы нашли конкретных активации равенству в блеомицин лечение мышей (рис. 6)18. Исследована роль равенству путем инъекций транспортного средства или блеомицин лечить мышей с activable флуоресцентных зондов ММП в точках выбранного времени. Двадцать четыре часа после инъекции, мышей были образы по ДРМ, показывая, что фиброзных мышей может активировать конкретных MMP флуоресцентного зонда в vivo (цифры 6A-6 D)18 и ex vivo (Рисунок 6E)18 .

Figure 1
Рисунок 1 : Экспериментальная установка для мыши блеомицин индуцированного фиброза легких. Самок мышей C57Bl/6 был либо физиологического раствора или блеомицин привили intratracheally на двух случаях, день 0 и 4. Мышей были образы микро-CT сканер на базовых (день 0), 7, 14 и 21 день. Группы 12 мышей были принесены в жертву на 7, 14 и 21 дней и их легкие были оценены для осаждения коллаген соотнести гистологические результаты с изображениями, полученными µCT. Этот рисунок был изменен из опубликованной статьи21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: курс гистологический анализ блеомицин индуцированного фиброза легких у мышей. 
(A) количественная оценка фиброз легких, Эшкрофт Оценка либо транспортное средство или блеомицин лечение мышей в разное время точек. Эксперимент был повторен в три раза, и каждая точка представляет среднее ± SEM 12 животных. Статистический анализ была выполнена путем следуют Тьюки теста ANOVA. * p < 0,05; ** p < 0.01.
(B) Оценка Эшкрофт частотного распределения выделенных в легкой, умеренной и тяжелой подкатегории.
(C) представитель гистология Masson трихома витражи мыши легких разделы для intratracheally двойной привили блеомицин или физиологический обработанных мышей на 7, 14 и 21 день после лечения (увеличение 10 X, шкалы бар 200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: курс клеточной инфильтрации в BALF блеомицин индуцированного фиброза легких у мышей. 
(A) количество Лейкоцитов, моноцитов (B) , (C) лимфоцитов и нейтрофилов (D) . Клетки обнаружены в BALF были высказаны как количество клеток * 103µл. Эксперимент был повторен в три раза, и каждая точка представляет среднее ± SEM 9 животных. Статистический анализ была выполнена путем следуют Дуннетт теста ANOVA. * p < 0,05; ** p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Продольные микро-КТ изображений прогнозы легких блеомицин индуцированного фиброза и транспортного средства лечить мышей. (A) микро-CT, блеомицин лечение мыши и (B) микро-CT, физиологический обработанной мыши пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Airways, фиброз легких лопастями квантификации и сегментации, основанный на неоднократные микро-КТ.
(A) Airways были разделены в Центральной и дистальной части. (B) , дистальной частью airways является внутрилегочного тракта, используемый для идентификации и разделить на долях легких как: право черепной лепестка (RCrL), право средней доле (RMdL), право хвостовой лепесток (RCdL), право аксессуар лепестка (RAcL) и левого легкого (LL). (C) радиус сократимость и (D) общая количественная оценка фиброза легких в разное время точки транспортного средства или блеомицин лечение мышей. Каждая точка представляет среднее ± SEM 5 животных, для в общей сложности 30 мышей. Статистический анализ была выполнена путем следуют Дуннетт теста ANOVA. * p < 0,05; ** p < 0.01. Этот рисунок был изменен из опубликованной статьи21Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок. 6. время курс флуоресценции сигнала измеряется ДРМ inbleomycin индуцированных мышей фиброза легких. В vivo (A и B) и ex vivo (C и D) ДРМ представитель изображения мышей, вводится с ММП зонд относились с транспортного средства или с блеомицин. (E) общее количество легких флуоресценции сигнала был автоматически рассчитывается по ДРМ изображений программное обеспечение. Эксперимент был повторен в три раза, и каждая точка представляет среднее ± стандартное отклонение 9 животных. Статистический анализ была выполнена путем следуют Дуннетт теста ANOVA. * p < 0,05; ** p < 0.01. Этот рисунок был изменен из опубликованной статьи18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на многие исследовательские группы упором на разработке новых препаратов для лечения МГЛ на данный момент только два доступны для пациентов. Есть медицинские срочно найти более эффективные методы лечения7 , потому что только легких микротрансплантатов возможность продлить выживание 4-5 лет26. Необходимым условием для трансляционной медицины и разработки новых препаратов является наличие животной модели, которая имитирует черты МГЛ и в котором интервенционные исследования прогнозирования успеха в клинике. Однако полезность существующих моделей легочного фиброза животное является по-прежнему спорным27. Мы разрабатываем новую модель мыши фиброз легких, который требует двойной инстилляции блеомицин, как описано в 1 на рисунке18. Технологии обработки изображений являются мощными инструментами для визуализации прогрессирования заболевания и фармакологические реакции на лечение. Эта модель животных лучше резюмировалась человеческие особенности МГЛ и неинвазивной технологий может создать мост между доклинической и клинической практике27.

Однако для получения надежных и воспроизводимых данных, некоторые шаги имеют решающее значение. При инстилляции трахею должны быть выполнены при мышей полностью наркоз, используя стандартизированные процедуры. Микро-CT приобретение требует очень точного мониторинга анестезии, потому что CT прогнозы являются воротами, частота дыхания. До обработки изображений, убедитесь, что мышей у той же глубины анестезии. Очень важный шаг для оптических изображений, FMT-депиляции. Перед началом, всегда вынимайте мех на и вокруг груди, чтобы избежать рассеяния и поглощения в ткани. Зонд инъекции необходимо исправить путем массы тела животного.

Возможность исследовать и определить конкретные молекулярные считывания с анатомическими изменениями в же мышей в разное время точках представляет собой огромный шаг в развитии понимания фиброз, очевидным заранее для как функциональных, так и фармакологических исследования.

Этот мультимодального imaging подход это идеальный инструмент для оценки эффективности наркотиков, обеспечивая гораздо больше информации по сравнению с терминала оценки, перевод в более эффективный процесс обнаружения наркотиков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Daniela Pompilio и Роберта Ciccimarra за технической помощью.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208, (7), 1339-1350 (2011).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, (7), 1028-1040 (2012).
  3. Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, (2), 167-179 (2013).
  4. Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. (2017).
  5. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294, (2), 152-160 (2008).
  6. Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41, (3), 115-134 (2015).
  7. Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
  8. Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65, (3), 422-431 (2002).
  9. Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16, (6), 509-521 (2016).
  10. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41, (4), 467-470 (1988).
  11. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
  12. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14, (1), 226 (2016).
  13. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7, (6), 39716 (2012).
  14. Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
  15. Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11, (5), 396-404 (2016).
  16. Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21, (1), 15009 (2016).
  17. Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9, (1), 91-98 (2016).
  18. Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
  19. Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7, (1), 340 (2017).
  20. Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53, (1), 8-13 (2015).
  21. Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
  22. Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
  23. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. National Research Council. Washington DC. (2011).
  24. Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. (2016).
  25. Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44, (4), 507-514 (2008).
  26. King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378, (9807), 1949-1961 (2011).
  27. De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7, (8), 43123 (2012).
Мультимодального Imaging подход на основе микро CT и флуоресценции молекулярные томографии для продольной оценки фиброза блеомицин индуцированного легких у мышей
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).More

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter