Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Yaklaşım Imaging Multimodal Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis farelerde boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı

doi: 10.3791/56443 Published: April 13, 2018

Summary

Biz bir non-invaziv multimodal bleomycin Çift Kişilik boğaza korumak tarafından indüklenen fare akciğer fibrozis modelinin boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı yaklaşım Imaging tanımlamak.

Abstract

İdiyopatik Pulmoner Fibrozis (IPF) akciğer fonksiyon ve solunum yetmezliği nedeniyle sonraki ölüm önemli bozulma nedenleri akciğer mimari, ilerici ve geri dönüşü olmayan imha ile karakterize bir ölümcül akciğer hastalığıdır.

Deneysel hayvan modelleri IPF patogenezinde bleomycin idare tarafından indüklenen. Bu çalışmada, bir çift boğaza bleomycin korumak tarafından indüklenen bir IPF benzer fare modeli araştırıyoruz. Standart histolojik Değerlendirmeler akciğer fibrozis çalışmak için kullanılan invaziv terminal işlemlerdir. Bu eser amacı akciğer fibrozis floresan moleküler tomografi (FMT) ve mikro-CT gibi noninvaziv görüntüleme teknikleri izlemektir Bu iki teknoloji Histoloji bulguları ile doğrulanmış gerçek zamanlı izleme non-invaziv IPF hastalık şiddeti ve ilerleme için devrimci bir fonksiyonel yaklaşım temsil edebilir. Farklı yaklaşımlar füzyonu nerede patolojik bir durumda oluşan moleküler olaylar ile FMT görülebilir ve sonraki anatomik değişiklikler mikro-CT tarafından izlenebilir IPF hastalığı anlamak için bir adım daha ileri temsil eder.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İdiyopatik Pulmoner Fibrozis (IPF) ne yazık ki sık sık tanı1dört yıl içinde ölümcül akciğer fonksiyonları progresif azalma ile kronik akciğer hastalığı var. Hücre dışı matriks ifade ve fibroblast proliferasyonu IPF en önemli özellikleri vardır, ama Patogenez henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Birden fazla döngüleri akciğer yaralanmalara yol açar değişiklik Mezenkimal hücre döngüsü yayılması, abartılı birikimi fibroblastlar ve myofibroblasts, alveoler epitel hücreleri imha neden en desteklenen hipotezdir ve artan matris üretim. Arabulucu gibi matriks metalloproteinazların (MMPs) dysregulated fibrozis gelişiminde insan IPF veya hayvan modellerinde bleomycin kaynaklı bulunmuştur Bu süreçlerle ilgili. Kontrolsüz MMP üretim anormal yara onarım1,2taklit eden bir dengesiz kollajen birikimi için akciğer interstitium ve alveoler alanı içinde açar.

İlaç bulma ve geliştirme için ana engellerden biri insan Patogenez ve hastalık fenotip taklit erişilebilir fare modelleri olduğunu. Farklı ajanlar akciğer fibrozis hayvan modellerinde ikna etmek için kullanılmıştır: ışınlama zararı, yönetim asbest ve silis, yönetim fibrinogenic sitokinler ve bleomycin3,4; Ancak bleomycin en kullanılan fare, rats, eskiden şiling şimdi pigs, hamster, adatavşanı5 veya büyük hayvanlar (insan dışı primatlar, atlar, köpekler ve ruminants)6,7. Bleomycin antibiyotik bakteri Streptomyces verticillus8 tarafından yapılan ve bir anti-kanser ajanı9olarak kullanılır. Pulmoner Fibrozis uyuşturucunun ve bu nedenle ortak bir yan etkisi, Pulmoner Fibrozis ikna etmek için deneysel hayvan modellerinde kullanılır.

Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis modellerinde, 14-21 gün sonra bleomycin yönetim fibrotik lezyonlar ortaya çikmaktadir. Sunulan çalışma, biz yeni farelerde akciğer fibrozis Çift Kişilik bleomycin boğaza korumak tarafından ikna etmek için kullanılan protokol. Bleomycin fare modeli yeni ilaçlar üzerinde kurulan fibrotik lezyonlar değerlendirilmesi gerektiğinden çok zaman alıcıdır ve anti-fibrotik etkileri anti-inflamatuar etkileri ayırt etmek için test edilmiştir.

Kollajen içeriği, morfometrik ve histolojik analiz biyokimyasal belirlenmesi, post mortem analizi, aynı hayvan hastalık patogenezinde takip imkanı sınırlayan dayalı. Her ne kadar bu parametreler fibrozis değerlendirilmesi için altın standart olarak kabul edildi, onlar değil fibrotik doku bozulması zamansal veya mekansal dağılımı sağlamak ve hastalık ilerleme süreci araştırmak için bir yol engel. 10

Son zamanlarda, non-invaziv görüntüleme teknolojileri hava yolu monitör yenileme, inflamasyon ve fare modelleri ilerlemesinde fibrozis uygulanmış olan: manyetik rezonans görüntüleme (MRG), mikro Bilgisayarlı Tomografi (mikro-CT), Floresans moleküler Tomografi (FMT) ve kollarındaki (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Boyuna farklı noktalarda zaman-bir bleomycin meydan sonra22FMT ve mikro-CT akciğer fibrozis ilerleme izlemek için bir non-invaziv görüntüleme yaklaşım öneriyorum.

Birçok yollar kuruluş ve fibrozis geliştirilmesi dahil olan ve pek bilinir. Bu işlemler sadece daha derin bir anlayış kliniğe transfer olabilir daha fazla uyuşturucu hedeflerine çevirmek olabilir. Boyuna Floresans moleküler tomografi akciğer parenkima değişiklikleri algılama için mikro-BT ile birleştiğinde tarafından MMP etkinleştirme izleme olanağı gelecekte tedavi klinik yanıt erişmek için kullanılan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri Chiesi Farmaceutici ve ERASMUS MC hayvan deney protokol numarası altında intramural hayvan refahı Komitesi tarafından kabul edildi: EMC Avrupa Yönergesi 2010/63 UE ile uymak 3349 (138 / 14 / 07) İtalyan D.Lgs 26/2014 ve yeniden düzenlenen "Kılavuzu için bakım ve kullanım of Laboratory Animals"23.

Not: kullanılmadan önce kadın doğuştan C57Bl/6 (7-8 haftalık) fareler en az 7 gün yerel vivaryum koşullarına acclimatized (Oda sıcaklığı: 20-24 ° C; bağıl nem: % 40-70; 12-saat koyu döngüsü), standart kemirgen chow ücretsiz erişimine ve yumuşatılmış su dokunun.

1. boğaza tedavi fare Bleomycin ile

  1. Cihazın içi trakeal korumak12,13,14için hazırlayın.
  2. Fareler %2.5 oksijen ile karışık ayarlamak bir isoflurane Buharlaştırıcı bağlı anestezik odası koymak. Anestezi derinliği için bir ayak parmağı-çimdik yanıt eksikliği tarafından kontrol. Anestezi etkisi 3-5 dk sonra oluştu.
  3. Entübasyon platformda imzalat fareyi getirin, onun ön dişler tarafından asılı tel üzerinde yerleştirilir.
  4. Laringoskop, künt uçlu forseps bir çift ve forseps veya laringoskop'ın uç ağız hafifçe açmak için kullanın.
  5. Dilini ve Forseps ile kenarda tutun. Trakea açılışı görüntülenir kadar laringoskop blade ağız arkasına doğru koyun ve laringoskop tutmak.
  6. Diğer elini de PE boru içine üç yollu vana dönen Trakea, sonu bağlı teslim tüp takın. Bleomycin (0,020 µg/fare) 50 µL teslim. Korumak sonra hızlı bir şekilde boğulma önlemek için Trakea tüpü çıkarması. Fareler dik birkaç saniye boyunca basılı tutun.
    1. Bleomycin intratracheally gün 0 saat yönetmek ve gün 4 (Resim 1) tekrarlayın.
  7. Entübasyon platformdan fareyi kaldırın ve 30 dk (tam anesteziden kurtarmak için gerekli zamanı) için fare izlemek.
  8. FMT ve mikro-CT tarafından fareler akciğerler vivo içinde görüntüleme Çift Kişilik bleomycin korumak, 7, 14 ve 21 gün sonra gerçekleştirin.

2. Floresans moleküler tomografi tarafından vivo içinde görüntüleme

Not: Önceden, ışık kullanmadan önce 4 ° C'de korunuyorsunuz MMP hassas floresan substrat 680 tuzlu çözüm (% 0,9 Sodyum Klorür) ve store 6 nmol/mL taze stok çözeltisi hazırlamak. 4 ° C'de 6 aya kadar kararlı MMP görüntüleme ajanı hayvana enjekte önce oda sıcaklığına kadar equilibrate sağlar.

  1. Sonda enjeksiyon
    1. MMP sonda çözüm intravenöz enjeksiyon için donatım hazırlayın. Sıcak su 50 ° c fare kuyruğu ısıtmak için önceden.
    2. Fare scruff sıkıca kavramak için kuyruk tarafından kabul ve Kafesin kapağını tutunma sağlar. Fareler hayvanın omuz üzerinde tutarak, kuyruk 4 önlemek için kuyruk cilt termal hasar için en fazla 8 s termal yaralanma için bir sıcak su kabı koymak.  Daha kolay görselleştirme ve iğne ekleme için şişme damarları kontrol edin.
    3. Enjeksiyon işlemi sırasında sabit tutun ve arkadaki özel bir delikten kuyruk çekmek için plastik bir restrainer fareler koyun. İki Kaudal damarlar üstünde ikisinden biri yan-kuyruk bulmak; arter alt kısmında kuyruk değil.
    4. İğne (26 G) 1 mL şırınga damar içine yerleştirin. İğne doğru şekilde yerleştirilmiş olması durumunda, enjeksiyon kolay olacak ve sonda çözüm gemi akacaktır.
    5. MMP sonda çözüm 10 mL/kg enjekte.
    6. İğne atmak.
      Not: çünkü sondası tarafından etkinleştirilmesi için gereken süreyi en uygun görüntüleme saat 24 h MMP sonda enjeksiyon sonra noktasıdır. Uzunlamasına çalışmalar gerçekleştirilmesi durumunda en iyi yeniden enjeksiyon 7 gün, hangi sağlar aracı tam giriş izni için fare zamanı.
  2. FMT görüntüleme
    Not: başlamadan önce her zaman kürk kaldırın ve hayvan alanların etrafında, bu durumda saçılma ve doku Absorbans önlemek için göğüs, yansıması için olan.
    1. Fare anestezi için anestezik odasına koy ve isoflurane kadranını indüksiyon için % 2.5 ve bakım için % 2.
    2. Veri toplama yazılımı başlatmak ve deneme için veritabanında yeni bir çalışma açın.
    3. Görüntüleme ile FMT başlamadan önce fare görüntüleme kaset aktarın. FMT görüş alanı en iyi şekilde kullanmak için kaset Imaging ortasında imzalat fareyi getirin. Fareler düz, güvenli ve yavaşça sıkıştırılmış görüntüleme kaset her iki windows karşı tutun. Kaset kolları tarafından yüksekliği ayarlamak ve sonra belgili tanımlık rıhtım istasyon kaydırın.
    4. Konu tarama penceresinde tıklatın ve canlı görüntüyü görmek için Önizleme ' yi tıklatın.
    5. Floresans beklenen alanı çevreleyen doku yakalanır tarama bölgesi yeterince büyük çizmek. Toplam 25 tarama noktaları garantiler de dahil olmak üzere akciğer bölge tamamen taranan olacak.
    6. Bir kez yatırım Getirisi çizilir, ilk imar Kuyruğa Ekle ' yi tıklatın ve fareyi görüntü tarama ' yı tıklatarak. Emin olun doğru lazer, 680 nm seçilidir.
    7. Resim alma tamamlandığında, fare onun kafes yerleştirin. Tam anesteziden kurtarır emin olun.
    8. Floresans analizi penceresinde yatırım Getirisi aracını kullanarak analiz yazılımı picomoles ölçmek ve yatırım Getirisi 700-800 mm3 akciğer yöresinin sinyal üzerinde etrafında azaltır. Karaciğer sinyal dışlamak için dikkatli olun. Onları boyutunda benzer ve her hayvan görüntü içindeki konumlarını ayarlamak için diğer konularda yatırım Getirisi kopyalayın.
    9. Görüntüleri jpg dosyaları olarak dışa aktarma.

3. mikro-CT tarafından Vivo içinde görüntüleme

Dikkat: başlamadan önce her zaman tüm metal takılar ve x-ışınları saçılma önlemek için görüntüleme alanını yakınındaki metal nesneleri kaldırın.

Not: Radyasyon kaynaklı akciğer fibrozis akciğer hasarı24radyasyon sırasında ortak bir bulgu indüklenmektedir. Ne mikro-CT endeksleri türetilmiş ne de Histolojik bulgular akciğer fibrozis ile ilişkili serum fizyolojik tedavi kontrol farelerde mevcut dört mikro-CT oturumları görüntüleme, x-ışını doz mikro-CT sırasında hayvanlara teslim gösteren tabi gün 21 muayene bulguları etkiler için yeterli değildi.

  1. Mikro-CT yeşil güç düğmesine basarak kapatmak ve x-ışını kaynağı ısıtmak için yazılımı başlatmak. Küçük delik ve hayvan yatak Imaging fareler için kullanın.
  2. Yeni veritabanı için yeni bir tıklatarak veritabanını oluşturmak ve yapı tarayıcı fare deneyinde sayısını temel alan veya önceden oluşturulmuş bir veri kaydetmek için Varolan bir veritabanına bağlanırken ' ı tıklatın.
  3. Tarama başlamadan önce satın alma parametrelerini yazılım denetimi penceresinde seçin: x-ışını tüpü gerilim, 90 kV; CT X-ray tüp akım, 160 µA; X-ışını tüpü geçerli, 80 µA canlı; FOV, 36 mm; Hiçbir gating tekniği; Teknik, yüksek çözünürlükte tarama 4 dak.
  4. Fareler % 3 isoflurane inhalasyon tarafından anestezi ve anestezi sürekli bir tedarik sağlayan bir burun konisi ile delik eklenen yatağın üstüne koyun. Belgili tanımlık paws maruz göğüs izin vermek için yatakta bantlı farelerin hareketsiz.
  5. Enstrüman kapı slayt ve Live Mode yakalama düğmesine basarak fare pozisyon gerçek zamanlı olarak görmek için açmak. Hayvan yatak doğrudan CT araç üzerinde yer alan düğmelerini kullanarak göğüs görüş alanı (FOV) ile hizalamak için taşıyın. Fare üzerinde tarama Merkez; Eğer değilse CT araç üzerinde bulunan sol ve sağ okları olan pozisyonunu ayarlayýn.
  6. En iyi yatak pozisyonu 90 ° ve ayarla' yı tıklatarak işaretleyerek gantry döndürerek onaylayın. Görüntü bölgesine tamamen FOV içinde olduğundan emin olun.
  7. Perdeleme herhangi bir tekniği uygulamak ve tarama CT Scan düğmesine tıklayarak başlatın. Evet bu x-ışını kaynağı açılır olduğunu bildiren iletisi için'i tıklatın.
    Not: röntgen yanar sonra araç üzerine portakal lamba vurgulanır ve kayar kapı operatör güvenliği için açmak imkansız olacaktır. Tarama işlemi bittiğinde, transaxial, koronal ve yeniden sagittal dilim gösteren 2D Viewer yazılımının yeni bir pencere görünür.
  8. Görüntü kalitesi kontrol ve hareketleri nedeniyle anestezi düşük düzeyde görüntüleri bulanık değil emin olun. Gerekirse, tarama tekrarlamak.
  9. Hayvanlar kafesin içine yerleştirin ve tam anesteziden kurtarmak emin olun.

4. Bronchoalveolar lavaj

  1. Kurban ve % 3 isoflurane hayvanlarla abdominal aorta kanama tarafından anestezi.
  2. Makas göğüs kafesi ve boyun ortaya çıkarmak için kullanın. Sonra Trakea ortaya çıkarmak ve 1 mL şırınga iğne olmadan bağlı 21'lik lavaj tüp ile gerçekleştirilecek BAL yordam izin vermek için küçük bir insizyon attım olun. Nefes borusu kesmemeye dikkat edin.
  3. BAL gerçekleştirmek için bir iğne olmadan 1 mL şırınga 0.6 mL steril çözeltisi ile doldurun [10 x Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS); 100 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA); 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic asit (HEPES); distile su].
  4. Nefes borusu içinde belgili tanımlık kesme lavaj tüp takın ve yavaş yavaş enjekte ve çözüm 3 kez, en iyi toplama BALF daha sonraki analiz için izin vermek için üçüncü para çekme üzerinde duraklatma çekmek.

5. Histoloji ve Histomorfometri

  1. Ortaya çıkarmak ve onları nefes borusu aracılığıyla bir kanül ile % 10 formalin tarafsız tamponlanmış 0.6 mL ile nazik infüzyon tarafından şişirme akciğerler, çıkarın ve örnekleri için 24 saat oda sıcaklığında saklayın.
  2. Alkol Çözümleri (1 h için % 60 etanol, 1 h, % 90 etanol için 1 h, 2 h için % 95 etanol etanol % 70 ve % 100 etanol için 2 h) konsantrasyonları artan farklı pasajlar ile örnekleri kurutmak bir otomatik doku işlemci kullanarak.
  3. Numuneler Ksilen onları yarı saydam yapmak 2 h için yerleştirin. Su kaybı sonunda parafin 3 h için 60 ° C'de örneklerinde sızmak ve otomatik işlemcide katıştırabilirsiniz.
  4. 5 µm kalınlığında seri bölümler döner microtome kullanarak elde edilir.
  5. Deparaffinize ve slaytlar etanol azalan sınıflarda rehydrate ve bir otomatik doku işlemci kullanarak Masson'ın Trichrome ile leke.
  6. El ile tarama bir slayt tarayıcı kullanarak 20 X büyütme oranında akciğer dilimleri odaklanmak ve 451 nm/piksel çözünürlük ile görüntüleme yazılımı kullanarak tüm akciğer bölümlerinin dijital çekim.
  7. Morfolojik fibrotik akciğer hasarı yarı nicel ve nicel parametreleri ile aşağıdaki gibi değerlendirmek:
    1. Ashcroft puanı belirlemek. Yarı kantitatif akciğer bölümleri Ashcroft10 Hübner vd tarafından değiştirilmiş tarafından tanımlanan ölçeğine göre sınıf morfolojik değişiklikler 25 kullanım sistem 0-8 puan akciğer bölümlerdeki tüm parankimi değerlendirmek için.
    2. Kollajen içeriği belirleyin. Mikroskop görüntü analiz yazılımı tarafından fibrozis10,25 derecesini ölçmek. Rastgele her slayt başına 10 X büyütme, üç ROIs seçin. Renk eşiği ayarlarını standardizasyon tarafından kollajen yeşil lekeli alan olarak algılar.
    3. Alveoler hava alanı belirleyin. Alveoler hava alanı fibrozis10,25dolaylı bir parametresi olarak ölçmek. Hava alanı içinde beyaz bir eşik kullanarak ROIs bulmak belgili tanımlık aynı yazılım ve fibrozis kesir için uygulanan ROIs aracılığıyla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akciğer fibrozis lezyonların spontan çözünürlük üç hafta sonra tek bleomycin yönetim ve ılımlı yapısal değişiklikler sınırları bu modelin vurgulamak görülmektedir. Sadece koruyucu tedavi klinik pratikte17temsil etmiyor dar terapötik pencere nedeniyle gerçekleştirilebilir.

Burada, Çift Kişilik bleomycin boğaza korumak bizim protokolünden uzun süreli akciğer fibrozis fareler18de geliştirmek mümkün olduğunu göstermektedir. Deneysel tasarım Resim 119,20,21' gösterilir. Bu çalışmanın amacı noninvaziv görüntüleme teknolojileri ile farelerde akciğer fibrozis ilerleme bakmaktır. Bleomycin intratracheally iki kez yönetilen yapıldı (gün 0 ve 4; 1 mg/kg bleomycin her vesileyle 50 µL içinde). Her grup için on iki fareler intratracheally bleomycin grup olarak aynı anda yalnızca bir denetim olarak kullanmak için araç aynı birimle meydan vardı. Fibrozis değerlendirilmesi için yarı nicel bir histolojik analiz Ashcroft göre puanlama sistemi yapıldı. 10

Mevcut çalışma, biz klasik Histoloji ile birlikte mikro-CT ve FMT teknolojiler kullanılarak akciğer fibrozis geliştirme bleomycin kaynaklı fare modeli değerlendirildi. Teknolojileri Imaging noninvaziv doğası preklinik akciğer fibrozis ilerleme değerlendirilmesi için gerçek değerini temsil eder ve anlaşma ile Histoloji bulundu mükemmel bir adımdır. Mikro-CT görüntüleme önemli bir rol yılında akciğer parenkima değişiklikler fibrotik lezyonlar nedeniyle miktar boyuna oynayabilir.

Bleomycin resimlerini Histoloji fibrozis 7, esas olarak tek fibrotik kitleler, tarihten itibaren belirgin bir desen gösterdi ve gün 14 substitutive kollajen nin Konfluent şirketler için ilerledi ve 21 ( güne kadar değişmeden kaldı grup tedavi Rakamlar 2A - 2 C). Bleomycin tedavisi akciğer iltihabı (şekil 3A), WBC sayısı önemli ölçüde daha yüksek BALF 7, 14 ve 21 gün Karşılaştır araç grubu için tedavi bleomycin farelerin içinde neredeydi indüklenen. İlginçtir, lenfosit ve monosit kesirler de (3B-3 C rakamlar) örnekleme her zaman artan; Buna ek olarak, önemli bir artış nötrofil fraksiyonunun gün 7 (şekil 3D) gözlenmiştir.

Bu çalışmada, mikro-CT boyuna akciğer parankimi değişiklikleri izlemek için kullanılır. Gözlem taban çizgisinden farklı zaman noktalarda akciğer mimarisinin ilerici anatomik değişiklikler mikro-CT projeksiyonlar (rakamlar 4A-4B) açıkça görülmektedir. Bronş ağacı (rakamlar 5A ve 5 C)19,20,21 ve toplam akciğer fibrozis yüzdesi (rakamlar 5B ve 5 D) distal kısmında solunum RADIUS fibrozis ilerleme ölçmek. Gün 7 (şekil 5D) bleomycin tedavi grubunda fibrozis yüzdesi miktar biraz Eğer Histoloji puanlama için karşılaştırmak fazla hesaplamış. Bu inflamasyon ve fibrozis başlangıçlı, yapım o sert iki belirtileri arasında ayırt etmek bir çift tepki açıklanabilir. Solunum RADIUS ve fibrozis yüzdesi mikro-CT projeksiyonlar akciğer parenkima değişiklikleri (Rakamlar 5 C-5 D)19,20,21 miktar için görüntü işleme dan seçildi . Bu mikro-CT çok iyi Histolojik bulgular ile anlaşma Rakamlar 2A/2 Ciçinde gösterildiği gibi parametreleridir.

Mikro-CT doğrudan görüntüleme akciğer parankimi patolojik ve tedavi edici değişiklikler yansıyan ve FMT teknoloji daha fazla protein ifade IPF için sevdim ile ilgili nicel bilgiler. Bu çalışma için önemini IPF için temel bir MMP sonda seçtik ve tedavi bleomycin fareler (şekil 6)18' belirli MMPs harekete geçirmek bulduk. MMPs rolü araç veya bleomycin enjekte edilerek soruşturma seçilen zaman noktalarda MMP activable floresan problar ile tedavi fareler. 24 saat sonra enjeksiyon, fareler fibrotik fareler belirli MMP floresan sonda vivo içinde (6A-6 D rakamlar)18 ve ex vivo (şekil 6E)18 etkinleştirebilirsiniz açığa FMT tarafından yansıma .

Figure 1
Resim 1 : Deneysel kurmak için fare bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis. C57BL/6 dişi fareler vardı ya serum veya bleomycin telkin intratracheally iki durumlarda, 0 ve 4 gün. Fareler tarafından bir mikro-CT tarayıcı temel (0 gün), 7, 14 ve 21 gün görüntüsü. 12 farelerin grupları 7, 14 ve 21 gün kurban edildi ve onların akciğer µCT tarafından elde edilen görüntüleri ile histolojik sonuçları ilişkilendirmek kollajen birikimi için değerlendirildi. Bu rakam yayımlanmış bir makaleye21değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: histolojik analiz zaman tabii ki bleomycin indüklenen farelerde akciğer fibrozis. 
(A) akciğer fibrozis Ashcroft tarafından miktar Puan edinildi ya da araç veya bleomycin tedavi fareler farklı zaman noktalarda. Deneme üç kez tekrarlandı ve her noktası 12 hayvanlar ortalama ± SEM temsil eder. İstatistiksel analizi ANOVA Tukey'nın test tarafından takip tarafından yapıldı. * p < 0,05; ** p < 0,01.
(B) Ashcroft puanı frekans dağılımı hafif, orta ve şiddetli alt kategorileri içinde ayrılmış.
(C) fare akciğer intratracheally çift için telkin bölümleri bleomycin veya 7, 14 ve 21 gün post tedavisi (10 X büyütme, ölçek çubuğu 200 µm) serum fizyolojik tedavi fareler Masson'ın Trichome temsilcisi Histoloji lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: hücresel infiltrasyon zaman ders bleomycin BALF içine indüklenen farelerde akciğer fibrozis. 
WBC, (B) monosit, lenfositler (C) ve (D) nötrofil (A) sayısı. BALF içinde bulunan hücreleri hücre sayısı ifade * 103/µL. Deneme üç kez tekrarlandı ve her noktası 9 hayvanlar ortalama ± SEM temsil eder. İstatistiksel analiz Dunnett'ın test tarafından takip ANOVA tarafından yapıldı. * p < 0,05; ** p < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis ve araç boyuna mikro-CT görüntüleme projeksiyonlar tedavi fareler. (A) mikro-CT, tedavi bleomycin fare ve (B) mikro-CT, serum fizyolojik tedavi fare Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Airways, fibrozis akciğer lobları miktar ve segmentasyon göre tekrarlanan mikro-CT görüntüleme.
(A) Merkez ve distal parçası haline Airways ayrıldı. (B) distal solunum yolları tanımlamak ve akciğer lobları içine bölmek için kullanılan intrapulmonary yolu bir parçasıdır: sağ beyin lobu (RCrL), sağ orta LOB (RMdL), sağ Kaudal LOB (RCdL), sağ aksesuar LOB (RAcL) ve sol akciğer (LL). (C) solunum RADIUS ve (D) akciğer fibrozis miktar Toplam araç veya bleomycin tedavi fareler farklı zaman noktalarda. Her noktası ortalama ± SEM 5 hayvanların toplam 30 farelerin temsil eder. İstatistiksel analiz Dunnett'ın test tarafından takip ANOVA tarafından yapıldı. * p < 0,05; ** p < 0,01. Bu rakam yayımlanmış bir makaleye21değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil. 6. zaman ders FMT inbleomycin tarafından ölçülen Floresans sinyalinin akciğer fibrozis fareler indüklenen. İn vivo (A ve B) ve ex vivo (C ve D) FMT temsilcisi görüntüleri MMP sonda ile enjekte farelerin araç ile veya bleomycin ile tedavi. (E) akciğer Floresans sinyalinin toplam tutarı FMT görüntü yazılımı tarafından otomatik olarak hesaplanır. Deneme üç kez tekrarlandı ve ortalama ± standart sapma 9 hayvanların her noktasını temsil eder. İstatistiksel analiz Dunnett'ın test tarafından takip ANOVA tarafından yapıldı. * p < 0,05; ** p < 0,01. Bu rakam yayımlanmış bir makaleye18değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IPF tedavi etmek için yeni ilaçların geliştirilmesi üzerinde odaklanan birçok araştırma grupları rağmen şu anda sadece iki hasta için kullanılabilir. Bir acil tıbbi gerek çünkü daha etkili tedaviler7 bulmak sadece akciğer transplantationis 4-5 yıl26yaşama uzatmak mümkün. Translasyonel tıp ve yeni ilaçların geliştirilmesi için gerekli ön koşul IPF ve Girişimsel hangi çalışmalar başarı klinikte akıllı özellikler taklit eden bir hayvan modeli durumu olduğunu. Ancak, varolan Pulmoner Fibrozis hayvan modellerin kullanışlılığı hala tartışmalı27yaşında. Biz yeni bir fare modeli şekil 118' açıklandığı gibi bleomycin bir çift korumak gerektirir akciğer fibrozis geliştirmek. Görüntüleme teknolojileri hastalık ilerleme ve farmakolojik tedaviye yanıt görselleştirmek için güçlü araçlardır. Bu hayvan modeli daha iyi IPF İnsani/Beşeri Özellikler recapitulated ve noninvaziv teknolojileriyle preklinik ayarları ve klinik pratikte27arasında bir köprü oluşturabilirsiniz.

Ancak, sağlam ve tekrarlanabilir verileri elde etmek için bazı çok önemli adımlardır. Fareler tam olarak, standart bir yordam kullanarak anestezi zaman boğaza korumak gerçekleştirilmelidir. CT projeksiyonlar tarafından solunum frekansı geçişli mikro-CT satın alma çok doğru anestezi, izleme gerektirir. Görüntüleme önce fareler aynı derinliği, anestezi olduğundan emin olun. FMT tarafından optik görüntüleme için çok önemli bir adım Depilasyon var. Başlamadan önce her zaman kürk ve saçılma ve doku Absorbans önlemek için göğüs çevresinde kaldırın. Sonda enjeksiyon hayvan vücut ağırlığı tarafından düzeltilmesi gerekiyor.

Olasılık araştırmak ve farklı zaman noktalarda aynı farelerde anatomik değişiklikler ile belirli bir moleküler eşleştirmeyi ölçmek için anlayış fibrozis geliştirme, bariz avans işlevsel yanı sıra farmakolojik için büyük bir adımdır çalışmalar.

Bu multimodal yaklaşım görüntüleme terminal değerlendirme, daha etkili bir ilaç bulma işleminde çeviri kıyasla çok daha fazla bilgi sağlayan ilaç etkinliğini değerlendirmek için akıllı bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Daniela Pompilio ve Roberta Ciccimarra teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208, (7), 1339-1350 (2011).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, (7), 1028-1040 (2012).
  3. Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, (2), 167-179 (2013).
  4. Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. (2017).
  5. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294, (2), 152-160 (2008).
  6. Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41, (3), 115-134 (2015).
  7. Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
  8. Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65, (3), 422-431 (2002).
  9. Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16, (6), 509-521 (2016).
  10. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41, (4), 467-470 (1988).
  11. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
  12. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14, (1), 226 (2016).
  13. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7, (6), 39716 (2012).
  14. Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
  15. Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11, (5), 396-404 (2016).
  16. Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21, (1), 15009 (2016).
  17. Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9, (1), 91-98 (2016).
  18. Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
  19. Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7, (1), 340 (2017).
  20. Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53, (1), 8-13 (2015).
  21. Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
  22. Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
  23. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. National Research Council. Washington DC. (2011).
  24. Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. (2016).
  25. Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44, (4), 507-514 (2008).
  26. King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378, (9807), 1949-1961 (2011).
  27. De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7, (8), 43123 (2012).
Yaklaşım Imaging Multimodal Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis farelerde boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).More

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter