Summary
ويصف هذه المخطوطة نسخة رقم تحليل تباين أداؤها في الحمض النووي المصل أو البلازما باستخدام نهج PCR الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب مناسبة للتنبؤ بمقاومة الأدوية في مرضى سرطان البروستاتا المقاوم الاخصاء، ولكن يمكن أن تكون مفيدة أيضا لأمراض أخرى.
Abstract
وقد تبين الحمض الحر خلية البلازما والمصل (كفدنا) كمصدر للمعلومات، وغير الغازية من المؤشرات الحيوية لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد والتنبؤ بمقاومة العلاج. بدءاً من فرضية أن الحصول على الاندروجين الجينات مستقبلات (ع) نسخة رقم (CN) حدث متكرر في الاخصاء المنتشر مقاومة سرطان البروستاتا (مكربك)، ونقترح لتحليل هذا الحدث في كفدنا كالعلامات البيولوجية تنبؤية محتملة.
نحن تقييم CN ع في كفدنا استخدام فحوصات PCR الوقت الحقيقي مختلفة 2 و 2 إشارة الجينات (رناسيب و آغو1). كمية الحمض النووي من 60 استخدمت نانوغرام لكل تركيبة الإنزيم. AR وأكد مكسب CN استخدام PCR الرقمية كوسيلة أكثر دقة. تحليل التباين CN وقد ثبت بالفعل أن تكون مفيدة للتنبؤ بمقاومة العلاج في وضع مكربك، ولكن قد يكون من المفيد أيضا لأغراض أخرى في مختلف البيئات المريض. تحليل CN في كفدنا مزايا عديدة: غير الغازية وسريعة وسهلة لتنفيذ، ويبدأ من كمية صغيرة من المواد المصل أو البلازما.
Introduction
تعميم الخلية الحرة الحمض النووي (كفدنا) في الدم قد ثبت أن مصدر أمثل للمؤشرات الحيوية لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد والتنبؤ بمعاملة المقاومة1،2. وقد أظهرت العديد من الدراسات توافق جيد بين التعديلات الحمض النووي (الطفرات، نسخ عدد الاختلافات، تعديلات جينية في الأنسجة) وتلك التي عثر عليها في المقابل البلازما عينات1، تؤكد أن تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) مفيدة للورم الابتدائي والمنتشر الأنسجة التعديلات3. وبالتالي يتيح إمكانية دراسة كتدنا لإعادة بناء الجينومي ترتيبات جديدة والاختلافات (كنفس) نسخة رقم المسرطنة محددة4، تحديد خلايا الاستنساخ وسوبكلونال يحتمل أن المنتشر. وقد ثبت كتدنا سريرياً مفيدة خاصة لرصد علاج السرطان كما أنها تؤوي طفرات محددة وكنفس، المتعلقة بالعلاجات المستهدفة المحددة5،6. كما يتغلب على الحاجة خزعات الأنسجة ويسمح للنتائج يمكن الحصول عليها في أوقات مختلفة أثناء علاج سرطان محددة بطريقة غير الغازية.
فيما يتعلق بسرطان البروستاتا، ارتباط كبير بين تعميم الاندروجين خالية من الخلايا مستقبلات (ع) كنفس والعلاج استجابة ل abiraterone وانزالوتاميدي وقد ثبت، قد تكون تشير إلى AR الجينات عدد النسخ (CN) في كفدنا العلامات البيولوجية واعدة قادرة على التنبؤ بمعاملة المقاومة7،،من89،10،11. يمكن تقييم كنفس جينات محددة في كتدنا باستخدام نهج مختلفة مع حساسية مختلفة، والتكلفة، وسرعة (على سبيل المثال. بكر في الوقت الحقيقي، والرقمية، وتسلسل الجيل القادم).
هنا يصف لنا نهجاً بسيطاً وسريعا، استناداً إلى فحوصات مزدوجة في تكنولوجيا PCR الوقت الحقيقي، لتقييم CN ع في كفدنا من المصل والبلازما عينات7،8. ونحن نظر اثنان فحوصات PCR مختلفة مصممة في منطقتين مختلفتين من الجينوم داخل إنترون 5 ع (Xq12) واثنين من الجينات الأخرى، كمرجعية معيارية داخلية الجينات يعرف أن لها وضعا رقم نسخة عادية في سرطان البروستاتا (رناسيب، يقع في 14q11؛ قبل1، الموجود على 1 ف 34). نحن تحديد الجينات مرجعيتين، بدلاً من واحدة، زيادة الدقة والحساسية للنتائج. كمية الحمض النووي من 60 تم تضخيمه نانوغرام لكل تركيبة الإنزيم (مقايسة مجتمعة AR-assay_1 + رناسيب ول ع-assay_2 + AGO1). تجميع ثلاث عينات الحمض النووي المصل أو البلازما من الذكور الأصحاء وتستخدم معايرة. أننا اعتبرنا قطع من > 1.5 لكسب ع و < 0.5 للحذف. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها مرنة وأن جينات أخرى يمكن أيضا تقييم، تغيير الجينات القياسية المرجعية الداخلية، استناداً إلى نوع الورم وخصائصها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتكون البروتوكول من عزل الحمض النووي من عينات المصل أو البلازما لإجراء PCR الوقت الحقيقي لتحليل عدد النسخ. وأجريت استخراج الحمض النووي ومراقبة كمية الحمض النووي (جهاز المطياف الضوئي) PCR الوقت الحقيقي لأهداف محددة. وترد في الشكل 1، موجزاً للإجراءات والجدول الزمني.
البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية IRST.
1-المصل جمع وتجهيز
- جمع حوالي 5 مل كل الدم في أنبوب مصل دون تخثر الدم للحصول على المصل. صيانة أنابيب الدم عند 4 درجة مئوية حتى التجهيز.
- أنابيب الطرد المركزي في 1,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل المصل بعناية في أنابيب 2 مل.
- تجاهل أنبوب جمع وفورا تجميد المادة طافية في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2-البلازما جمع وتجهيز
- جمع حوالي 10 مل كل الدم في أنبوب بلازما مع أدتا الحصول على البلازما. ملء الأنبوب تماما ومن ثم عكس ذلك 8 مرات. صيانة أنابيب الدم عند 4 درجة مئوية حتى التجهيز.
- الطرد المركزي الأنبوب في 1,800 س ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع لا وضع الفرامل على أجهزة الطرد المركزي.
- نقل الجزء العلوي من البلازما بعناية في أنابيب 2 مل. تكرار النقل، ترك 1 مل على الأقل من المادة طافية فوق طبقة الخلايا البيضاء.
ملاحظة: نقل الجزء العلوي من المادة طافية يقلل من خطر التلوث بالخلايا أو الخلايا الحطام. - تجاهل أنبوب جمع وفورا تجميد المادة طافية في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3-الحمض النووي في معزل عن المصل أو البلازما
ملاحظة: ينبغي إجراء عزل الحمض النووي من المصل أو البلازما باستخدام البروتوكول التجاري بتعديل في الخطوات التالية.
- ذوبان الجليد قاسمة واحدة (التي تتضمن من 0.5 إلى 2 مل) من المصل أو البلازما في درجة حرارة الغرفة.
- دوامة وخلط العينة ونقل 0.5 مل من المصل أو البلازما في أنبوب واضحة 1.5 مل. تجميد بقية المواد في-80 درجة مئوية.
- إضافة 50 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل) مباشرة إلى العينة.
- إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت لتحلل للعينة، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
- إغلاق الأنابيب واحتضان عينات من 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة الحرارة.
- إضافة المبلغ المشار إليه من الإيثانول 100% في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 و 2، كما هو مبين بإرشادات الشركة المصنعة.
- جلب العينات إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة 0.5 مل إيثانول المطلقة ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
- إضافة ميليلتر 650 من الخليط التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 7 إلى عمود الفصل والطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال تجاهل ومكان العمود على أنبوب جمع نظيفة جديدة. كرر الخطوتين 3.8 و 3.9 مرة أخرى.
- إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1، دون ترطيب حافة العمود وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- أنبوب يحتوي على التدفق من خلال تجاهل واستبداله بأنبوب جمع نظيفة جديدة.
- إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2، دون ترطيب حافة العمود وأجهزة الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 3 دقائق.
- أنبوب يحتوي على التدفق من خلال تجاهل واستبداله بأنبوب جمع نظيفة جديدة.
- الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 3 دقيقة لإزالة أي مخزن مؤقت الغسيل المتبقية.
- مكان العمود في أنبوب نظيف 1.5 مل. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف والانتظار 7 دقيقة التأكد من ذلك المخزن ويتس العمود.
- الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- "الماصة؛" الوت من الخطوة 3.16 مرة أخرى إلى نفس العمود وأجهزة الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 1 دقيقة لضمان استرداد الحد الأقصى من الحمض النووي.
4-الحمض النووي التقييم الكمي، وتمييع
- إجراء التحديد الكمي للحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. استخدم 2 ميليلتر من العينة مقاعد البدلاء-أعلى جهاز المطياف الضوئي لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: إذا كانت كمية الحمض النووي لا يكفي للمضي قدما مع بكر في الوقت الحقيقي (على الأقل 120 نانوغرام)، القيام بعملية جديدة لعزل الحمض النووي. - تمييع الحمض النووي من المصل أو البلازما إلى 2.5 نانوغرام/ميليلتر في وحدة تخزين نهائي كافية لبكر كلها في الوقت الحقيقي (حوالي 50 ميليلتر).
5-في الوقت الحقيقي بكر
- ذوبان الجليد نسخ عدد فحوصات والفحص الجيني مرجع وعينات الحمض النووي تضعف وآله لفرز المجمعة في الجليد. حجته في درجة حرارة الغرفة ميكس الرئيسية التي يتم تخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد مزيج ميليلتر 1 المقايسة المستهدفة و 1 ميليلتر من الفحص الجيني مرجع 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي ل replicates 3 من كل عينة وآله لفرز تجميع. إعداد مزيج بما في ذلك عنصر تحكم سلبي (المياه) وعينات إضافية 2.
- في لوحة 96 جيدا، الكوة ميليلتر 12 من المزيج في كل بئر. لا لا من أنابيب ماصة أو زيادة ونقصان.
- إضافة 8 ميليلتر (تركيز 2.5 نانوغرام/ميليلتر) لكل عينة من الحمض النووي وآله لفرز المجمعة في كل بئر. لا لا من أنابيب ماصة أو زيادة ونقصان. تغيير تلميح لكل بئر.
ملاحظة: يمكن معالجة 30 عينة من الحمض النووي لكل تجربة في الوقت الحقيقي باستخدام لوحة 96-جيدا: عينات 30 x 3 + التحكم المجمعة + السلبية آلة لفرز 1 × 3 = 94. - باختصار تدور أسفل اللوحة في 1,000 س ز.
- تشغيل لوحة استخدام بروتوكول التالية: عقد المرحلة على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، دورات 40 في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
6-بيانات التحليل والتفسير
- في قسم "الخيار" أدناه نتائج المؤامرة التضخيم، تعيين عتبة Ct في 0.2 للجينات الهدف الأول تحليل. كرر المجموعة لكل الجينات المستهدفة أو مرجع. لتصدير ملف PCR الوقت الحقيقي في الملحق.txt، اضغط "تصدير" في شريط الأدوات. العلم فقط "النتائج" في التحديد البيانات المراد تصديرها ← اختيار كنوع ملف الملحق.txt ← الصحافة "بدء التصدير" ← إغلاق أداة التصدير.
- فتح برنامج التحليل واستيراد ملف.txt (استيراد ← شريط الأدوات).
- حدد اسم الملف لتحليل وتحديد إعداد التحليل بشريط الأدوات (رمز للعب).
- تحديد نموذج معايرة وعدد نسخ الهدف (مثلاً، 1 نسخة للجينات AR ) المعروفة. اضغط على "تطبيق".
- لكل نموذج، قم بحذف بئر واحدة مع دلتا مختلفة Ct (ΔCt) بالمقارنة بابار أخرى.
- رياناليزي التجربة (رمز تلعب الصحافة).
- تقييم النتائج حسب عدد نسخ شريط الأرض أو الجدول.
ملاحظة: الجدول النتائج يحتوي على معلمات متعددة مثل الثقة والحرز Z replicates تحليل يمكن أن تكون مفيدة لتفسير النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان تركيز مجموع كفدنا القابلة للقياس التي كانت لجميع العينات التي تم تحليلها، عرض متوسط من 6.12 نانوغرام/ميليلتر (النطاق: 2.00 23.71 نانوغرام/ميليلتر) لعينات مصلية ومتوسط من 3.21 نانوغرام/ميليلتر (النطاق: 2.31-8.49 نانوغرام/ميليلتر) لعينات البلازما. قمنا بتحليل ما مجموعة 115 عينات من تجارب بكر في الوقت الحقيقي.
تم تقييم حساسية الاختبار باستخدام الحمض النووي مختلطة المصل من المرضى مع كسب عالية أو منخفضة ل AR، والحمض النووي من المانحين صحية، والتي تستخدم أيضا معايرة عينات لتحليل عدد نسخ. كما هو ممثل في الشكل 2، هو اكتشاف CN ع بما فيه الكفاية في 0.375% من الحمض النووي من المرضى مع اكتساب ع مختلطة مع المانحين صحي الحمض النووي للحصول على مكسب جينات القابلة للاكتشاف (الشكل 2). وهكذا، اكتشف هذا النهج كمية منخفضة جداً من كسب عدد النسخ. تم حساب الانحراف المعياري ل ΔCt في فحوصات CN لكل مريض (متوسط ± SD = 0.1، النطاق: 0.00-0.36). قمنا باستخدام متوسط قيم الانحراف المعياري لاختيار قطع كسب عدد النسخ.
قمنا بتحليل عدد نسخ ع في المرضى الذين عولجوا مع abiraterone (n = 53)، العثور على 16 مريضا (30.2 في المائة) عرضت ع كسب7. وبالمثل، قمنا بتحليل التباين رقم نسخة للجينات ع في المرضى الذين يعالجون انزالوتاميدي (ن = 59)، إيجاد مكسب ع في القرن 21 (36 ٪) من المرضى8.
وعلاوة على ذلك، نحن تقيم الرابطة بين ع CN والنتائج السريرية باستخدام طريقة كابلان-ماير ورتبة سجل اختبار والعثور على عصابة كبيرة. على وجه الخصوص، تعامل abiraterone سلسلة حالات المرضى مع اكتساب الجينات ع أظهر بقاء تطور متوسط حرة (PFS) 2.8 مقابل 9.5 أشهر الحالات غير المكتسبة (ف < 0.0001). كما أفيد بقاء عموما أقل (OS) في المرضى الذين يعانون من كسب CN ع (ف < 0.0001).
وبالمثل، لسلسلة حالات انزالوتاميدي، وجدنا متوسط PFS 2.4 مقابل أشهر 4.0 للمرضى مع اكتساب ع مقابل المرضى بأي مكسب (p = 0.0004). وعلاوة على ذلك، كان متوسط نظام التشغيل من المرضى مع اكتساب CN ع 6.1 مقابل 14.1 شهرا لأولئك دون مكسب (p = 0.0003). وتأكدت جميع أهي ع كسب النتائج المتحصل عليها من نهج PCR الوقت الحقيقي باستخدام أساليب أخرى، بما في ذلك الرقمية بكر (الشكل 3).
رقم 1. سير العمل والجدول الزمني- طريقة سير العمل ينقسم إلى خطوات مختلفة ومرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2- نهج حساسية للكشف عن CN ع اختبار باستخدام متميزة حمامي (نموذج 1 ونموذج 2) من الحمض النووي من المانحين صحية ومن المرضى قانون الإجراءات الجنائية، والمكتسبة للجينات AR ، مختلطة بتركيزات مختلفة. كانت مختلطة الحمض النووي المريض في النسب المئوية ل 0.375، 0.75، 1.5، 3، 6، 12، 25 و 50 و 100، فيما يتعلق بمجموع الحمض النووي. الخط الأحمر: استقطاع لكسب AR CN (1.5). وقد تم تعديل هذا الرقم من سالفي et al. 7
الشكل 3- AR أهي نتائج المقارنة بين PCR الوقت الحقيقي (qPCR) وبكر الرقمية (دبكر) للعديد من المرضى (س). الخط الأسود: استقطاع لكسب AR CN (1.5). وقد تم تعديل هذا الرقم من سالفي et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR تحليل CN في عينة مصل وبلازما يمثل نهجاً جديداً غير الغازية للتقسيم الطبقي لمرضى سرطان البروستاتا المقاوم الاخصاء (قانون الإجراءات الجنائية). وقد ثبت مؤخرا أن CN ع غير قادرة على التنبؤ بالنتائج في قانون الإجراءات الجنائية المرضى الذين عولجوا مع abiraterone وانزالوتاميدي، قبل وبعد العلاج الكيميائي7،8،،من910.
الميزة الرئيسية للنهج الذي نتبعه أن البروتوكول بسيط جداً لأداء، يتألف من فقط عملية عزل الحمض النووي وتحليل PCR الوقت الحقيقي وتفسير البيانات بسهولة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الاختبار بسرعة المؤداة في يوم عمل واحد، والإجراء غير مكلفة (20 دولاراً لكل عينة، تقريبا). لقد أظهرنا أن هذا الأسلوب استنساخه بدرجة عالية والنتائج المتحصل عليها وتتماشى تلك القادمة من أساليب أكثر تكلفة وأكثر دقة، بما في ذلك7،بكر رقمي8. وعلاوة على ذلك، وجدنا مماثلة ع كسب التردد الكشف مع النهج خ ع المستهدفة في عينات البلازما تعامل مع abiraterone9،10. ميزة هامة أخرى هي أن هذا النهج يتسم بالمرونة ويمكن تطبيقها على الأمراض الأخرى التي ع الجينات دوراً هاما. وعلاوة على ذلك، يمكن اختيار جينات أخرى مستهدفة ومرجع استناداً إلى هذا مرض الاهتمام.
أهي تحليل الجينات ع في مصل الدم لديه أيضا بعض القيود. أولاً، الأسلوب الكمي سبيكتروفوتوميتريك الحمض النووي غير دقيقة في كثير من الأحيان، ويمكن الاستعاضة عن النهج الأخرى، فلوروميتريك أكثر دقة. إجراء تقييم كمي أكثر دقة يمكن أن يعطي نتائج أكثر دقة CN. وثانيا، اقترحت بعض الدراسات أنه يمكن أن يكون من الأفضل لتحليل البلازما الحمض النووي بدلاً من المصل الحمض النووي. الكمية المتداولة الخلية الحرة الحمض النووي أعلى عموما في مصل الدم من البلازما12،13، بسبب تخثر خلايا الدم البيضاء في مصل الدم، مما يوحي بأن المصل يحتمل أن تكون مصدر أسوأ لتحليل الحمض النووي الخاصة بورم بسبب احتمال وجود البرية من نوع الحمض النووي.
وقد تم إجراء تحليل أهي الجينات ع في مصل الدم باستخدام النهج PCR الوقت الحقيقي على 112 قانون الإجراءات الجنائية المرضى قبل أن تبدأ العلاج مع انزالوتاميدي أو abiraterone. لدينا بيانات أظهرت أن أهي ع في كفدنا هو العلامات البيولوجية وراثية قوية للنتائج السريرية ومقاومة abiraterone وانزالوتاميدي، ويمكن استخدامها لتحديد هوية الرجال الذين يمكن أن تستفيد مبدئياً منع العلاجات المضادة أو فحص PCR سريعة ومنخفضة التكلفة باستخدام العلاج الكيميائي. وتبرز هذه النتائج فائدة دراسة الدم كطريقة كسبها لاستجواب آليات المقاومة العلاجية في قانون الإجراءات الجنائية المبكرة والمتقدمة على حد سواء. في المستقبل، وينبغي التجهيزة دراسات مستقبلية وأكبر المرضى بتعميم حالة ع نظراً للاختلافات في النتائج السريرية والاستجابة للمعالجة اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر كيارا موليناري وفيليبو مارتيجنانو لتقديم الدعم في مجال تحليل البيانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
