Summary
Questo manoscritto descrive l'analisi di variazione numero copia eseguita nel siero o plasma del DNA usando metodo PCR in tempo reale. Questo metodo è adatto per la stima della resistenza ai farmaci nei pazienti con cancro della prostata resistente alla castrazione, ma potrebbe essere istruttivo anche per altre malattie.
Abstract
DNA libero delle cellule di plasma e del siero (cfDNA) è stato indicato come fonte informativa, non-invasivo di biomarcatori per la diagnosi di cancro, la prognosi, il monitoraggio e la previsione della resistenza al trattamento. Partendo dall'ipotesi che ottenere il numero di copia del gene androgeno recettore (AR) (CN) è un evento frequente nel carcinoma della prostata resistenza di castrazione metastatico (mCRPC), ci proponiamo di analizzare questo evento in cfDNA come potenziali biomarker predittivo.
Abbiamo valutato CN AR in cfDNA utilizzando diversi 2 Real-Time PCR e 2 geni di riferimento (RNaseP e fa1). Quantità di DNA di 60 ng è stato utilizzato per ciascuna combinazione di test. AR Guadagno CN è stata confermata usando PCR digitale come un metodo più accurato. Analisi della variazione di CN sono già stato dimostrato di essere ben informato per la stima della resistenza al trattamento nella cornice di mCRPC, ma potrebbe essere utile anche per altri scopi in contesti diversi pazienti. Analisi CN il cfDNA ha diversi vantaggi: è non invasivo, rapido e facile da eseguire, e si inizia da un piccolo volume di materiale siero o plasma.
Introduction
Del DNA cellulare gratis (cfDNA) nel sangue di circolazione ha dimostrato di essere un'ottima fonte di biomarcatori per la diagnosi di cancro, la prognosi, il monitoraggio e la previsione del trattamento resistenza1,2. Molti studi hanno dimostrato una buona concordanza tra alterazioni del DNA (mutazioni, variazioni del numeri di copie, modificazioni epigenetiche nei tessuti) e quelli che si trovano nel corrispondente al plasma campioni1, confermando che circolanti del DNA del tumore (ctDNA) è informativo per tumore primario e metastatico del tessuto alterazioni3. La possibilità di studiare ctDNA consente così la ricostruzione di riarrangiamenti genomici e variazioni del numero di copia (CNV) presso specifici oncogeni4, identificando potenzialmente metastatiche cellule clonali e subclonal. CtDNA ha dimostrato di essere clinicamente utile soprattutto per il monitoraggio del trattamento del cancro come ospita specifiche mutazioni e CNVs, legate a specifiche terapie mirate5,6. Inoltre supera la necessità per le biopsie del tessuto e permette i risultati ottenuti in tempi diversi durante il trattamento di cancro specifico in modo non invasivo.
Per quanto riguarda il carcinoma della prostata, una correlazione significativa tra circolazione dell'androgeno senza cellula recettore (AR) CNVs e trattamento risposta ad abiraterone ed enzalutamide è stato indicato, indicando numero di AR gene di copia (CN) in cfDNA può essere un promettente biomarcatore in grado di prevedere il trattamento resistenza7,8,9,10,11. CNV di specifici geni in ctDNA possono essere valutati utilizzando diversi approcci con diversa sensibilità, costo e rapidità (ad es. la PCR in tempo reale, digitale e Next Generation Sequencing).
Qui descriviamo un approccio semplice e veloce, basato su analisi duplex in tecnologia PCR in tempo reale, per la valutazione CN AR in cfDNA da campioni di siero e plasma7,8. Abbiamo considerato due differenti saggi PCR progettati su due differenti regioni genomiche all'interno dell'introne 5 di AR (Xq12) e altri due geni, come geni di standard interno di riferimento noti per avere uno status di numero di copia normale nel carcinoma della prostata (RNaseP, Situato su 14q11; Fa1, si trova sul 1 p 34). Abbiamo selezionato i geni di riferimento due, piuttosto che uno, per aumentare la precisione e la sensibilità dei risultati. Una quantità di DNA di 60 ng è stato amplificato per ciascuna combinazione di test (test combinato per AR-assay_1 + RNaseP e per AR-assay_2 + AGO1). Tre campioni di DNA di siero o plasma da maschi in buona salute sono stati riuniti ed usati come calibratore. Abbiamo considerato i tagli di > 1,5 per AR guadagno e < 0,5 per l'eliminazione. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che è flessibile e che altri geni possono essere anche valutati, cambiando i geni di standard di riferimento interno, sulla base di caratteristiche e tipo del tumore.
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Protocol
Il protocollo comprende l'isolamento di DNA da campioni di siero o plasma per eseguire Real-Time PCR per l'analisi di numero di copia. Estrazione del DNA, controllo della quantità del DNA (spettrofotometro) e Real-Time PCR per obiettivi specifici sono stati effettuati. In Figura 1, sono riportate una sintesi delle procedure e linea del tempo.
Il protocollo segue le linee guida del Comitato di etica umana ricerca IRST.
1. il siero raccolta ed elaborazione
- Raccogliere circa 5 mL di sangue intero in una provetta siero senza anticoagulante per ottenere siero. Mantenere le provette di sangue a 4 ° C fino al trattamento.
- Provette per centrifuga a 1.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire con cautela del siero in provette da 2 mL.
- Gettare la provetta di raccolta e congelare immediatamente il supernatante a-80 ° C fino all'utilizzo.
2. plasma raccolta ed elaborazione
- Raccogliere circa 10 mL di sangue intero in una provetta di plasma con EDTA per ottenere plasma. Riempire il tubo completamente e poi invertire e 8 volte. Mantenere le provette di sangue a 4 ° C fino al trattamento.
- Centrifugare la provetta a 1.800 x g per 15 min a temperatura ambiente con nessuna impostazione di freno sulla centrifuga.
- Trasferire con cautela la parte superiore del plasma in provette da 2 mL. Ripetere il trasferimento, lasciando almeno 1 mL del surnatante sopra lo strato delle cellule bianche.
Nota: La parte superiore del surnatante di trasferimento riduce il rischio di contaminazione da cellule o detriti cellulari. - Gettare la provetta di raccolta e congelare immediatamente il supernatante a-80 ° C fino all'utilizzo.
3. DNA isolamento da siero o Plasma
Nota: Isolamento di DNA da siero o plasma deve essere eseguita utilizzando il protocollo commerciale modificato nella procedura seguente.
- Scongelare un'aliquota (contenenti da 0,5 a 2 mL) di siero o plasma a temperatura ambiente.
- Vortice e mescolare il campione e trasferire 0,5 mL di siero o plasma in una provetta da 1,5 mL chiaro. Congelare il resto del materiale a-80 ° C.
- Aggiungere 50 µ l di proteinasi k (20 mg/mL) direttamente al campione.
- Aggiungere 0,5 mL di tampone di lisi per il campione e miscelare bene pipettando.
- Chiudere le provette e incubare i campioni a 56 ° C per 15 min del blocco di calore.
- Aggiungere la quantità indicata di etanolo al 100% in tampone di lavaggio 1 e 2, come indicato dalle istruzioni del produttore.
- Portare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 0,5 mL di etanolo assoluto e mescolare bene di pipettaggio.
- Aggiungere 650 µ l della miscela ottenuta al passaggio 3,7 per la colonna di separazione e centrifugare a 6.000 x g per 1 min.
- Gettare la provetta contenente il flusso attraverso e posizionare la colonna su un nuovo tubo di pulire raccolta. Ripetere i passaggi da 3.8 e 3.9 ancora una volta.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 1, senza bagnare il bordo della colonna e centrifugare a 6.000 x g per 1 min.
- Gettare la provetta contenente il flusso attraverso e sostituirlo con un nuovo tubo di pulire raccolta.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 2, senza bagnare il bordo della colonna e centrifugare a piena velocità (20.000 x g) per 3 min.
- Gettare la provetta contenente il flusso attraverso e sostituirlo con un nuovo tubo di pulire raccolta.
- Centrifugare a piena velocità (20.000 x g) per 3 minuti rimuovere qualsiasi residuo lavaggio buffer.
- Posizionare la colonna in una provetta pulita 1,5 mL. Aggiungere 150 µ l di tampone di eluizione e aspettare 7 min per garantire che tale buffer bagna la colonna.
- Centrifugare a 8.000 x g per 1 min.
- Dispensare il elute dal punto 3.16 nuovamente nella stessa colonna e centrifugare a piena velocità (20.000 x g) per 1 min garantire il massimo recupero del DNA.
4. diluizione e quantificazione di DNA
- Eseguire la quantificazione di DNA usando uno spettrofotometro. USA 2 µ l di campione a un spettrofotometro da banco per le istruzioni del produttore.
Nota: Se la quantità di DNA non è sufficiente per procedere con la PCR Real-Time (almeno 120 ng), eseguire un nuovo processo di isolamento del DNA. - Diluire il DNA da siero o plasma a 2,5 ng / µ l in un volume finale sufficiente per tutte le Real-Time PCR (circa 50 µ l).
5. Real-Time PCR
- Disgelo copia numeri saggi, analisi del gene di riferimento, campioni di DNA diluito e calibratori in pool in ghiaccio. Equilibrare a temperatura ambiente il mix master che viene conservato a 4 ° C.
- Preparare una miscela di 1 µ l di analisi di target, 1 µ l di analisi del gene di riferimento e 10 µ l di master mix per 3 repliche di ciascun campione e calibratori in pool. Preparare la miscela tra cui un controllo negativo (acqua) e 2 campioni supplementari.
- In un piatto ben 96, aliquotare 12 µ l della miscela in ogni pozzetto. Fare tubi non pipetta o spin.
- Aggiungere 8 µ l (concentrazione di 2,5 ng / µ l) di ciascun campione di DNA e calibratori raggruppati in ciascun pozzetto. Fare tubi non pipetta o spin. Cambiare la punta per ciascun pozzetto.
Nota: 30 campioni di DNA possono essere elaborati per ogni esperimento in tempo reale utilizzando la piastra a 96 pozzetti: 30 x 3 campioni + 1 x 3 calibratori pool + negativo controllo = 94. - Brevemente rotazione verso il basso la piastra a 1.000 x g.
- Eseguire la piastra utilizzando il seguente protocollo: tenere il palco a 95 ° C per 10 min, 40 cicli a 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 min.
6. dati analisi e interpretazione
- Nella sezione "opzione", sotto i risultati di trama di amplificazione, imposta la soglia di Ct a 0,2 per il primo gene di destinazione analizzato. Ripetere il set per ogni geni target o riferimento. Per esportare il file in tempo reale di PCR in estensione. txt, premere "Esporta" nella barra degli strumenti. Bandiera solo "risultati" nel selezionare dati da esportare → scegliere come tipo di file l'estensione. txt → premere "Avvia esportazione" → Chiudi lo strumento di esportazione.
- Aprire il software di analisi e importare il file. txt (importazione → barra degli strumenti).
- Selezionare il nome del file da analizzare e selezionare l'impostazione di analisi da toolbar (simbolo play).
- Specificare il campione calibratore e il noto numero di copie del database di destinazione (ad es., 1 copia per gene AR ). Premere "applica".
- Per ogni campione, omettere un pozzetto con diverso delta Ct (ΔCt) in confronto con altri pozzi.
- Rianalizzare l'esperimento (simbolo play press).
- Valutare i risultati per il numero di copia bar trama o la tabella.
Nota: La tabella di risultati contiene numerosi parametri come fiducia, Z-score e replicati analizzati che potrebbero essere utili per l'interpretazione dei risultati.
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Representative Results
CfDNA totale concentrazione era quantificabile mediante spettrofotometria per tutti i campioni analizzati, mostrando una mediana di 6.12 ng / µ l (gamma: 2.00-23,71 ng / µ l) per i campioni di siero e una mediana di 3,21 ng / µ l (gamma: 2.31-8,49 ng / µ l) per campioni di plasma. Abbiamo analizzato un totale di 115 campioni mediante esperimenti di PCR in tempo reale.
Sensibilità del test è stata valutata utilizzando il DNA nel siero misto di pazienti con alto o basso guadagno per ARe DNA da donatori sani, che sono inoltre utilizzati come campioni di calibratore per l'analisi di numero di copia. Come rappresentato nella Figura 2, AR CN è sufficientemente rilevato in 0.375% del DNA dai pazienti con AR guadagno mescolato con donatore sano del DNA per ottenere un guadagno di gene rilevabile (Figura 2). Quindi, questo approccio rilevato una quantità molto bassa di aumento di numero di copia. La deviazione standard di ΔCt nelle analisi CN per ogni paziente sono stati calcolati (media ± DS = 0.1, gamma: 0.00 - 0,36). Abbiamo usato una mediana dei valori di deviazione standard per la scelta del taglio di guadagno numero di copia.
Abbiamo analizzato il numero di copie di AR in pazienti trattati con abiraterone (n = 53), trovando 16 (30,2%) pazienti hanno esibito AR guadagno7. Allo stesso modo, abbiamo analizzato la variazione del numero di copia per gene AR in pazienti trattati con enzalutamide (n = 59), trovando AR guadagno in 21 (36%) di pazienti8.
Inoltre, abbiamo valutato l'associazione tra AR CN e gli esiti clinici utilizzando il metodo di Kaplan-Meier e log-rank test e trovato un'associazione significativa. In particolare, abiraterone serie di caso pazienti trattati con guadagno di gene AR ha mostrato una sopravvivenza libera da progressione mediana (PFS) di 2.8 vs 9,5 mesi di casi non guadagnato (p < 0,0001). Una bassa sopravvivenza globale (OS) è stata riportata anche in pazienti con guadagno CN AR (p < 0,0001).
Allo stesso modo, per serie di caso di enzalutamide, abbiamo trovato una PFS mediana di 2.4 vs 4,0 mesi per i pazienti con AR guadagno vs pazienti con nessun guadagno (p = 0,0004). Inoltre, OS mediana dei pazienti con guadagno CN AR era 6,1 contro 14,1 mesi per quelli senza guadagno (p = 0,0003). Tutti i risultati di guadagno AR CN ottenuti dall'approccio in tempo reale di PCR sono stati confermati utilizzando altri metodi, tra cui digital PCR (Figura 3).
Figura 1. Flusso di lavoro e timeline. Il flusso di lavoro di metodo è diviso in tempi e passaggi diversi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sensibilità di approccio per il rilevamento di AR CN testato con 2 distinte piscine (esempio 1 ed esempio 2) di DNA da donatori sani e da pazienti CRPC, acquisiti per gene AR , misto a differenti concentrazioni. DNA del paziente sono stati miscelati a percentuali di 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50 e 100, rispetto al totale del DNA. Linea rossa: taglio per guadagno CN AR (1.5). Questa figura è stata modificata da Salvi et al. 7
Figura 3. AR Confronto di risultati CN tra PCR in tempo reale (qPCR) e PCR digitale (dPCR) per i diversi pazienti (asse x). Linea nera: taglio per guadagno CN AR (1.5). Questa figura è stata modificata da Salvi et al. 7
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Discussion
AR Analisi CN nel campione di siero e plasma rappresenta un nuovo approccio non invasivo per la stratificazione dei pazienti di carcinoma della prostata resistente alla castrazione (CRPC). Recentemente è stato dimostrato che il CN di AR è in grado di prevedere i risultati nei pazienti CRPC trattati con abiraterone ed enzalutamide, prima e dopo la chemioterapia7,8,9,10.
Il vantaggio principale del nostro approccio è che il protocollo è molto semplice da eseguire, che consiste di soltanto un processo di isolamento del DNA, una analisi PCR in tempo reale e interpretazioni dei dati facile. Inoltre, il test potrebbe essere rapidamente eseguita in 1 giorno lavorativo, e la procedura è poco costoso ($20 USD per ogni campione, circa). Abbiamo dimostrato che questo metodo è altamente riproducibile e i risultati ottenuti sono in linea con quelli provenienti da metodi più costosi e precisi, tra cui digitale PCR7,8. Inoltre, abbiamo trovato un simile AR guadagno frequenza rilevata con approcci mirati di NGS su campioni di plasma trattati con abiraterone9,10. Un altro importante vantaggio è che questo approccio è flessibile e potrebbe essere applicabile ad altre malattie in cui il gene AR ha un ruolo importante. Inoltre, altri geni di riferimento e di destinazione potrebbero essere scelto in base sulla malattia di interesse.
Analisi di CN del gene AR in siero ha anche alcune limitazioni. In primo luogo, il metodo di quantificazione spettrofotometrica del DNA è spesso impreciso e potrebbe essere sostituito con altri, approcci fluorometriche più accurate. Una quantificazione più precisa potrebbe dare risultati più precisi di CN. In secondo luogo, alcuni studi hanno suggerito che potrebbe essere migliore analizzare DNA plasmatico invece di siero del DNA. La quantità di DNA libero delle cellule di circolazione è generalmente più elevata nel siero rispetto al plasma12,13, a causa la coagulazione dei globuli bianchi nel siero, suggerente che il siero è potenzialmente una fonte peggio per l'analisi del DNA di tumore-specifici a causa della possibile presenza di DNA wild-type.
Analisi di CN del gene AR in siero utilizzando approcci in tempo reale di PCR è stata eseguita su 112 pazienti CRPC prima hanno iniziato il trattamento con enzalutamide o abiraterone. I nostri dati hanno mostrato che AR CN il cfDNA è un potente biomarcatore genetico del risultato clinico e resistenza ad abiraterone ed enzalutamide e può essere utilizzato per identificare gli uomini che potrebbero trarre giovamento aprioristicamente da anti -AR terapie o chemioterapia usando un'analisi PCR rapida e a basso costo. Questi risultati evidenziano l'utilità di studiare il sangue come un metodo come minimo dilagante per interrogare i meccanismi di resistenza terapeutica in CRPC sia precoce e avanzata. In futuro, studi prospettici e più grandi devono stratificare i pazienti facendo circolare AR status in considerazione delle differenze successive in esiti clinici e risposta al trattamento.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Chiara Molinari e Filippo Martignano per supporto nell'analisi dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
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