Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Overvågning af effekten af osmotisk Stress på sekretoriske vesikler og exocytose

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

Osmotisk stress påvirker exocytose og mængden af neurotransmitteren udgivet under denne proces. Vi demonstrere, hvordan kombinerer elektrokemiske metoder samt transmissions Elektron Mikroskopi kan bruges til at studere effekten af ekstracellulære osmotisk Tryk på exocytose aktivitet, vesikel quantal størrelse og mængden af neurotransmitteren frigivet under exocytose.

Abstract

Amperometry optagelse af celler udsat for osmotisk chok viser, at sekretoriske celler reagerer på denne fysiske stress ved at reducere exocytose aktivitet og mængden af neurotransmitteren frigivet fra vesikler i enkelt exocytose begivenheder. Det er blevet foreslået, at reduktionen af neurotransmittere bortvist er ændringer i membranen biofysiske egenskaber når celler skrumpe i svar til osmotisk stress og med antagelser der sekretoriske vesikler i cellen cytoplasma påvirkes ikke af ekstracellulære osmotisk stress. Amperometry optagelse af exocytose overvåger, hvad er frigivet fra cellerne i øjeblikket en vesikel sikringer med plasma membran, men indeholder ikke oplysninger om vesikel indholdet, før vesikel fusion udløses. Derfor, ved at kombinere amperometry optagelse med andre supplerende analytiske metoder, der er i stand til at karakterisere de sekretoriske vesikler før exocytose på celler udløses tilbyder et bredere overblik for at undersøge hvordan sekretoriske vesikler og den exocytose proces påvirkes af osmotisk chok. Her beskriver vi, hvordan supplerer amperometry optagelse med intracellulære elektrokemiske flowcytometri og transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) billedbehandling kan bruges til at karakterisere ændringer i sekretoriske vesikler størrelse og neurotransmitter indhold på chromaffin celler i forbindelse med exocytose aktivitet før og efter udsættelse for osmotisk stress. Ved at sammenkæde de kvantitative oplysninger fra eksperimenter ved hjælp af alle tre analytiske metoder, blev konklusioner tidligere gjort at sekretoriske vesikler reagere ekstracellulære osmotisk stress ved skrumpende størrelse og reducere vesikel quantal størrelse til opretholde en konstant vesikel neurotransmitter koncentration. Derfor, dette giver en afklaring med hensyn til hvorfor blærer, som svar på osmotisk stress, reducere beløbet neurotransmittere frigives under exocytose frigivelse. Amperometric optagelser her angive dette er en reversibel proces og at vesikel efter osmotisk chok er genopfyldes med neurotransmittere, når indsatte celler er vendt i en isotonisk miljø.

Introduction

Chromaffin celler i binyrerne er neuroendokrine celler, der frigiver neurotransmitter molekyler i blodet. Dette sker gennem en cellulær proces, der involverer den docking og fusion af neurotransmitter-fyldt blærer, hvilket resulterer i indhold frigivelse fra vesikler til det ekstracellulære rum i en proces, der kaldes exocytose. Neurotransmittere (adrenalin og noradrenalin) i chromaffin celler er aktivt transporteres af membranproteiner i store tæt kerne vesikler (LDCVs) og opbevares ved høje koncentrationer (~0.5-1 M)1,2. Ophobning af neurotransmittere inde LDCVs opnås ved affinitet af katekolamin molekyler til matrixen intravesicular tæt kerne protein består af chromogranin proteiner (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, og en intravesicular cocktail løsning indeholdende nøglekomponenter for catecholamin lastning og lagring i vesikel som ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM i løsning og ~ 40 mM bundet til den protein matrix)8, Mg2 + (5 mM)9, Ascorbat (10-30 mM)10, og en pH på ~5.511,12. LDCVs opretholde en iso-osmotisk tilstand med cellen cytoplasma (310 mOsm/kg)13, selv om den teoretiske opløste koncentration inde vesikler sum op til mere end 750 mM. Sammensætningen af intravesicular bestanddele er ikke kun vigtig for lastning og lagring af katekolaminer, men også for sammenlægning af opløste stoffer til tæt kerne protein matrix. Dette reducerer vesikler osmolaritet reduceres betydeligt og kan påvirke det beløb katekolamin, der frigives under exocytose5,6.

Undersøgelser på effekten af ekstracellulære osmotisk Tryk på exocytose processen ved amperometric optagelse har rapporteret at høj ekstracellulære osmotisk tryk hæmmer exocytose aktivitet og reducerer antallet af neurotransmittere udskilles fra enkelt vesikel rum4,14,15,16,17,18,19. Forklaringer af disse bemærkninger har spekuleret på, om en eventuel forbedring af makromolekylære fortrængning i cellen cytoplasma hæmmende vesikel fusion begivenheder, og en ændring i membranen biofysiske egenskaber, der påvirker antallet af neurotransmittere frigives under exocytose. Disse tanker antages høj ekstracellulære osmotisk stress ikke påvirker vesikel quantal størrelse, som definerer antallet af neurotransmitter molekyler gemmes i en vesikel rum på forudgående fase udløses exocytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. amperometric målinger af exocytose udgivelse i enkelt celler, en carbon fiber disc mikroelektrode er placeret i tæt kontakt med cellens overflade, at skabe et eksperimenterende sæt op efterligne synapse konfiguration, hvor amperometric elektrode fungerer som en postsynaptiske detektor (figur 1)22,23. Ved at stimulere en celle til exocytose, kan man fremkalde neurotransmitter-fyldt blærer at smelte med plasma cellemembranen og frigive en del eller fuld vesikel indhold i det ekstracellulære rum. Disse neurotransmitter molekyler udgivet på overfladen af elektroden kan påvises elektrokemisk hvis neurotransmitterne er electroactive (fx, katekolaminer) ved at anvende en redox potentiale af +700 mV vs en Ag/AgCl-referenceelektrode . Derfor en række aktuelle pigge mark påvisning af individuelle exocytose begivenheder. Fra nuværende versus tid spor i et amperometric optagelse, området under hver enkelt amperometric spike udgør afgiften opdaget pr. exocytose begivenhed og kan konverteres til muldvarp af neurotransmittere frigivet, ved hjælp af Faraday ligning. Dermed, amperometric optagelser give kvantitative oplysninger om de mængde neurotransmittere bortvist fra enkelt exocytose begivenheder og rapportere om hyppigheden af exocytose begivenheder, men udgør ikke kvantitative oplysninger om de sekretoriske vesikler indhold før vesikel fusion og neurotransmitter frigivelse er blevet indledt.

Derfor, for at få en bedre forståelse af hvordan sekretoriske vesikler i cellen cytoplasma reagere på ekstracellulære osmotisk stress før cellen er udløst for at gennemgå exocytose, andre supplerende analytiske metoder kan bruges til at berige denne information. For eksempel, for at undersøge hvis osmotisk stress ændrer vesikel volumen, kan transmissions elektronmikroskopi (TEM) imaging analyse bruges til at måle vesikel størrelsen af celler efter kemisk fiksering. For at undersøge, om osmotisk stress påvirker vesikel quantal størrelse, en nyligt udviklede amperometric teknik kaldet intracellulære elektrokemiske flowcytometri, kan anvendes til kvantificering af vesikel neurotransmitter indhold på sekretoriske vesikler i deres hjemstat når stadig bor i cytoplasma af levende celler26. I den intracellulære elektrokemiske flowcytometri teknik, et nanotip cylindrisk kulfiber elektrode indsættes forsigtigt i cytoplasma af levende celler, og ved at anvende en +700 mV potentiale til denne elektrode (vs en Ag/AgCl reference elektrode), den katekolamin indhold i blærer kan kvantificeres ved påvisning af en redox nuværende spike fra enkelt vesikler kolliderede, adsorbing, og efterfølgende stochastically brud på elektrode overflade og dermed frigøre deres indholdet mod den elektrode overflade26. Derfor, i amperometric nuværende versus tid spor hver enkelt vesikel brud begivenhed kan resultere i en nuværende forbigående og, ved at integrere området i hvert nuværende spike, vesikel quantal størrelse kan beregnes ved hjælp af Faraday´s lov.

Derfor, ved at sammenkæde de kvantitative oplysninger fra vesikel størrelse målinger ved hjælp af TEM billedbehandling samt vesikel quantal størrelse analyse, som er registreret af intracellulære elektrokemiske flowcytometri, vesikel neurotransmitter koncentration kan også bestemmes. Dette tillader vesikel karakterisering, når cellerne er udsat for forskellige osmotisk betingelser og giver et bedre syn på hvordan blærer kan reagere på ekstracellulære osmotisk stress på stadiet før exocytose. Resultater fra kombinerer disse metoder har vist at i nærværelse af ekstracellulære højt osmotisk tryk, vesikler skrumpe og justere deres quantal størrelse og sammenligne de kvantitative oplysninger om de relative ændringer fra disse målinger viser, at mens krympning justere vesikler deres indhold og størrelse til at opretholde en konstant neurotransmitter koncentration24. Således, denne forståelse er værdifulde i tilslutning til bemærkninger på neurotransmitter frigivelse i celler udsat for osmotisk stress. I disse protokoller beskriver vi brugen af disse tre komplementære metoder, der giver mulighed for karakterisering af hvordan sekretoriske vesikler i deres oprindelige miljø reagere på ekstracellulære osmolalitet og virkningerne af dette svar på exocytose proces. Ud over vores tidligere bemærkninger vedrørende effekten af høje osmotisk Tryk på exocytose24præsenterer vi yderligere eksperimenter, der beskriver celle opsving efter osmotisk chok og effekten af flere barium stimulering i chromaffin celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur af kvæg Chromaffin celler isoleres ved Enzymatisk nedbrydning fra binyrerne

  1. For at isolere chromaffin celler indsamlet fra kvæg binyrerne, sterilisere celler med 70% ethanol opløsning. Trim væk fedt og bindevæv ved hjælp af en skalpel. For at fjerne blod, skyl de adrenal blodårer ved hjælp af Lockes løsning (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, hydroxyethylmethacrylat piperazineethanesulfonic syre (HEPES) 5,6 mM ved pH 7,4) der har været kan termostateres til 37 ° C.
  2. At fordøje væv, puste hver kirtel ved at indsprøjte ca. 2,5 mL varm steril-filtreret 0.2% collagenase P løsning gennem den adrenal vene ved hjælp af en sprøjte og inkuberes væv i 20 min. ved 37 ° C. Undersøge kirtler for at sikre fordøjelsesprocessen af medulla er afsluttet. Vævet skal føles blød og ikke anspændt.
  3. Indsamle fordøjet medulla af snipping off kirtler i længderetning. Hakkekød medulla væv ved hjælp af en skalpel. Filtrer væv affjedring over en stål sigte og fortyndes med Lockes løsning til ca 50 mL volumen at reducere aktiviteten af collagenase P.
  4. Sammenpresse cellerne på 300 x g i en centrifuge for 10 min. ved stuetemperatur og indsamle i 50 mL sterilt reagensglas. Genopslæmmes opnåede pellet i 20 mL Locke løsning og opløsningen filtreres over en steril 100 µm nylon mesh i rør.
  5. Bland chromaffin cellesuspension med steril Percoll (1:1) og centrifugeres celle løsning på 18.600 x g i 20 min. ved stuetemperatur. Indsamle de øverste lag af tæthed farveforløb og opløsningen filtreres over en 100 µm nylon mesh i rør.
  6. For at udelukke Percoll, fortyndet cellesuspension med Lockes løsning og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved stuetemperatur før re suspension pellet i Lockes løsning. Den anslåede celle tæthed af den isolerede cellesuspension er ca. 4 millioner celler/mL.
  7. For amperometric optagelse af exocytose og intracellulære flowcytometri målinger, plade chromaffin celler i kollagen IV belagt 60 mm plast retter med en tæthed på omkring 17,5 × 103 celler/cm2 og inkuberes celler ved 37 ° C i en 5% CO2 miljø. Udføre de elektrokemiske eksperimenter inden for 1-3 dage af cellekultur.
  8. For TEM imaging eksperimenter, plade chromaffin celler i 75 cm2 celle kultur kolber med en tæthed på 7-8 millioner celler pr. kolben og der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 omgivelser i 1 dag.

2. enkelt celle exocytose Amperometry eksperimenter24

  1. For at fremstille kulfiber microelectrodes for disse eksperimenter, tage et glas kapillær med en ydre diameter på egnet til elektrode indehaveren på stadiet hoved, der skal bruges i disse eksperimenter. Bruge en borsilikatglas kapillær med en ydre diameter på 1,2 mm og en indre diameter på 0,69 mm.
    1. Tilsluttes en af kapillar enderne en vand aspiration tube. Sted 5 µm diameter kulstof fibre på noget, som et stykke hvidt papir, til at forbedre visualisering.
    2. Identificere en enkelt kulfiber og holde fiber den ene ende med en finger til at holde kulfiber på plads mens positionering den åbne ende af kapillar i nærhed til den frie ende af carbon fiber. Forsigtigt Aspirér carbon fiber i glasset kapillær, således at kulfiber stikker ud gennem begge ender af kapillar. Flyt væk aspiration kraften.
  2. Placer kapillær med carbon fiber i en mikropipette aftrækker og trække glasset kapillær i to separate glas pipette tips. For at afbryde den kulfiber, der er forbindelse mellem to glas tips, skal du bruge et par saks til at klippe kulfiber og få to kulfiber microelectrodes.
  3. Under et mikroskop, placere kulfiber på toppen af en tykkere objektglas, der giver mulighed for manuel skæring af kulfiber på kanten af hvor fibrene strækker sig fra glasset kapillær belægning ved hjælp af en skalpel.
  4. Efter opskæring kulfiber, forlader et glas belagt kulfiber tip, skal du indsætte et par mm af elektrode tip i en Epoxy løsning i 10 min til at trække op epoxy og forsegle nogen muligt åbne rum mellem carbon fiber og den omgivende glas. Løft elektroder langsomt ud af epoxy-løsning for at forhindre pladskrævende lim dråber fra formning på spidsen af elektroden.
  5. Placer elektroderne på indehaveren (f.eks, en flad træpind) med to-side sticky varmebestandig tape som elektroder kan være tilknyttet. Bage epoxy behandlet elektroderne for overnatning i en ovn ved 100 ° C. Elektroden tips nemt bryde hvis de kommer i kontakt med en overflade, så sikre elektroderne altid er sikkert gemt ved hjælp af en indehaver, hvor elektroderne er fast på plads og tips ikke risikerer at blive rørt.
  6. For at opnå en flad skive elektrode overflade, placere en elektrode i indehaveren af en microgrinder og facet hver kulfiber elektrode på en engel af 45°. Efter beveling, markere kapillær på sine inderlår, ved hjælp af en permanent markør til senere vide, hvordan man Find elektrode diskoverflade i en 45° vinkel, når du placerer elektroden i nærheden af celler til exocytose måling.
    Bemærk: Dette trin er vigtigt i disse eksperimenter, oval disc elektrode skal lægges fladt på toppen af celler med dens overflade parallelt med overfladen af petriskålen. Også, er beveling elektroder færdig samme dag som eksperimenter for at sikre en frisk og ren elektrode overflade.
  7. Før brug, placere hver kulfiber mikroelektrode i et test-opløsningen (fx, 0.1 mM dopamin i PBS buffer (pH 7,4)) for at overvåge steady state aktuelle ved hjælp af cykliske voltammetry. For en cyklisk voltammetry scanning, anvende en trekant potentielle bølgeform fra-0.2 V til +0.8 V vs en Ag/AgCl referenceelektrode på 100 mV/s for at sikre god reaktion kinetik data er opnået, er enig med teoretisk beregnede værdier for en 5 µm diameter disken kulfiber mikroelektrode25.
  8. Amperometry optagelse af exocytose, placere petriskål med kulturperler chromaffin celler på en inverteret mikroskop. Det er vigtigt at beskytte mikroskopet sat op med et Faraday bur til at eliminere elektronisk støj under amperometry optagelse, på grund af de meget små strømme der måles. Bruge et mikroskop, varme scenen til at opretholde en temperatur på 37 ° C i løbet af celle eksperimenter.
  9. Bruge en støjsvag patch klemme instrument til at anvende en konstant potentiale af +700 mV på arbejde elektrode versus en Ag/AgCl referenceelektrode, der er også placeret i petriskålen fra arbejde elektrode. For optagelse exocytose chromaffin celler, digital signal på 10 kHz og anvende en intern lav pass Bessel-filter på 2 kHz til at filtrere de optagede signal.
  10. For at udføre amperometric optagelse på enkelt celler, montere frisk afskårne og testet kulfiber disc mikroelektrode i elektrode indehaveren af hoved fase, der bruges med potentiostat.
    1. Forsigtigt placere elektrode med den flad oval disk form elektrode overflade vender mod den apikale overflade af cellen og placere elektrode i kontakt med cellemembranen ved hjælp af en micromanipulator.
    2. Justere afstanden fra elektroden til cellen ved at overvåge celle deformation forårsaget af elektrode på placering på toppen af cellemembranen og derefter forsigtigt trække elektrode til en afstand, hvor cellen genvinder en figur tæt på sin oprindelige celle form . Ideel til kinetisk og kvantitative optagelse er at skabe en tyndt flydende folie af 100 nanometer til at adskille den elektrode og celle overflade, der er lignende betingelser for postsynaptiske påvisning af kemiske udgivelse i en synapse.
  11. For at stimulere cellerne til exocytose, placere en glas mikropipette med en spids størrelse på 2-3 µm diameter, fyldt med 5 mM BaCl2 løsning i en afstand af mindst 20 µm fra cellen, til at forhindre enhver løsning, der siver ud fra pipette tip til at påvirke den eksperimentere og anvende en 5 s injektion pulsen på 5 mM BaCl2 løsning på cellens overflade at stimulere celle til exocytose.
  12. For at studere osmotisk tryk reversibel påvirkning exocytose proces, forberede en isotonisk bufferopløsning (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 5 mM glukose, 10 mM HEPES, pH 7,4) 310 mOsm/kg iso-osmotisk tryk og en hypertonisk buffer lavet ved at justere den NaCl koncentration af isotonisk bufferopløsning med en osmolalitet svarende til 730 mOsm/kg.
  13. Placer cellerne i den isotoniske buffer og stimulere celle til exocytose ved at anvende en barium injektion pulsen mens du optager amperometric nuværende transienter under den indviede exocytose aktivitet for ca. 3 min..
    1. For at sammenligne exocytose svar i isotonisk betingelser til hypertonisk forhold, Ruger celler i 10 min i hypertonisk stødpudeopløsning og derefter anvende en barium injektion pulsen til at stimulere exocytose og udføre 3 min af amperometric optagelse.
    2. For celler reversibel reaktion Inkuber celler igen i 10 min i isotonisk stødpudeopløsning og stimulere cellerne ved at anvende en 5s barium injektion puls og udføre 3 min af optagelse exocytose svar fra cellen.
  14. Som kontrol forsøg at bestemme virkningen på exocytose aktivitet af flere barium stimulering, udføre en amperometric optagelse af exocytose frigivelse fra tre på hinanden følgende BaCl2 stimulering på den samme celle placeret i isotonisk buffer og ved hjælp af samme tid protokollen for fortløbende celle inkubation eksperimenter med forskellige osmolaritet.

3. intracellulære elektrokemiske flowcytometri24,26

  1. For at fremstille elektroder til vesikel quantal størrelse målinger, bruge de samme materialer og begynde at forberede en 5 µm i diameter kulfiber elektrode ifølge beskrivelserne i afsnit 2.1 og 2.2 mikroelektrode fabrikation for amperometric exocytose målinger.
  2. Under et mikroskop, skal du bruge en skalpel til at skære kulfiber udvidelse af glas-tip, således at en kulfiber med en længde, der spænder fra 30 til 100 µm er tilbage, stikker ud fra glas-tip.
  3. For at forberede en flamme ætset spidsen af kulfiber elektrode, bruge en butan flame. For at opnå en jævnt ætset, cylindrisk formet elektrode tip, holde cylindrisk formet Kulfiber elektrode samtidig dreje den og placere den kulfiber strækker sig fra glasset ind den blå kant af butan flame indtil spidsen af kulstof udvikler en rød farve. Det tager ofte mindre end 2 s. Hvis det lykkes, resulterer dette i en ætset elektrode tip størrelse af 50-100 nm i diameter (en SEM billede af sådanne tip er vist i figur 5B). Efter flamme ætsning, placere elektrode under et mikroskop for at evaluere den elektrode spids.
  4. Indsæt den cylindriske nanotip mikroelektrode i epoxy løsning i 3 min. efterfulgt af et 15 s dypning af elektrode tip i en acetone-løsning. Dette tillader epoxy til at forsegle den potentielle hul plads mellem carbon fiber og isolerende glas kapillar væggen, mens acetone rydder epoxy ætset kulfiber elektrode overflade. For at helbrede epoxyen, bage elektroder i ovn overnatning på 100 ° C.
  5. Før brug, teste steady state current af hver kulfiber mikroelektrode, som forklaret i afsnit 2.7 ved hjælp af cykliske voltammetry. For eksperimenter, kun bruge elektroder, der viser et plateau nuværende omkring 1,5-2,5 nA27.
  6. Intercellulære amperometry målinger, placere celler i mikroskop, som beskrevet i 2,8 og bruge de samme eksperimentelle indstillinger af potentiostat som beskrevet i 2.9.
  7. Til at udføre intracellulær amperometric måling, og for at forhindre betydelige fysiske skader til cellen, Indsæt nanotip cylindrisk mikroelektrode i cellen ved at tilføje en blid mekanisk kraft, lige nok til at skubbe elektrode gennem celle plasma membran og ind i cellen cytoplasma ved hjælp af en micromanipulator.
  8. Efter indsættelse, og med celle membranen forseglet omkring den cylindriske elektrode, starte amperometric optagelse in situ i den levende celle. Ved oxidation potentielle, der anvendes til elektroden, blærer vil adsorberes til elektrode overflade og stochastically briste.  Der er derfor ikke behov for nogen form for incitament til at indlede denne proces.
  9. For at bestemme den osmotiske effekt på vesikel quantal størrelse, skal du indsamle intracellulære flowcytometri målinger fra en gruppe af celler, der har været inkuberet i isotonisk og hypertonisk buffer ved hjælp af den eksperimentelle tilstand som beskrevet i punkt 2.13.

4. data analyse af Amperometry optagelser

  1. For at analysere de optagne amperometry data fra exocytose og intracellulære vesikel quantal størrelse analyse, bruge et softwareprogram, der tillader analyse af nuværende transienter i den registrerede nuværende versus tid spor så det kinetiske peak parametre og de integreret samlede afgift for enkelte aktuelle toppe kan bestemmes. Til dataanalyse, har vi brugt software udviklet i Sulzer lab, der var skrevet til data analysis program Igor28.
  2. Når analysere amperometric pigge, Vælg en tærskel grænse til toppene af tre gange root-mean square (RMS) standardafvigelsen af støj for hver optagelse.
  3. Indsamle amperometric piggene fra hver celle optagelse manuelt for at forhindre falske pigge, der ikke følger de Gaussian form, dobbelt pigge, som kan være resultatet af flettede exocytose begivenheder, og kun acceptere Gaussisk formet pigge med en tærskel på tre gange højere end RMS støj.
  4. Indsamle data for samlede pristillæg pr. enkelt amperometric peak og bruge Faradays lov (N = QnF) til at beregne den molære mængden af katekolamin neurotransmitter opdaget pr. exocytose eller intracellulære enkelt vesikel brud begivenhed, hvor N er modermærker af neurotransmittere går gennem en redox reaktion på elektrode overflade, Q = den samlede afgift opdaget under hver spike, n = antal elektroner overført i redox-reaktion (n = 2 for katekolaminer), og Faraday´s konstant F = 96485 C/mol.
  5. Udføre statistisk analyse af data indsamlet af første beregning af den gennemsnitlige afgift opdaget pr. begivenhed for hver celle. Derefter afvigelsen mellem celler, beregne den gennemsnitlige afgift mellem celler og bruge en Students t-test mellem celler antager forskellig varians. Denne undersøgelse brugte MATLAB program for statistisk analyse.

5. TEM tænkelig nemlig vesikel størrelse analyse

  1. For at udføre TEM billeddannelse af celler på de forskellige osmotiske forhold, Ruger først celler i isotonisk eller hypertonisk buffer i 10 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2 miljø før kemisk fiksering af celler.
  2. Udføre celle fiksering ved hjælp af Karnovsky Fikseringsvæske metode29. Ved hjælp af denne metode inkuberes cellerne med en oploesning indeholdende 0,01% natriumazid, 1% formaldehyd og 1,25% glutaraldehyd, hvor prøven kan opbevares ved 4 ° C.
  3. Efter fiksering, vask celler med 0,15 M natrium cacodylate buffer.
  4. Pletten cellen prøver post fiksering og forberedelse til TEM imaging, inkuberes celler med en 1% osmium dinitrogentetraoxid løsning i 2 timer ved 4 ° C, efterfulgt af 1 h inkubation i 0,5% uranyl acetat løsning ved stuetemperatur i mørke.
  5. I et afsluttende fiksering skridt, dehydrere cellerne først skylles celler i 100% ethanol og skyl derefter celler med acetone.
  6. Integrere celle prøver i epoxyresin og derefter udføre centrifugering på 4.000 x g for 30-40 min. og tillade den celle prøve at polymerisere ved 40 ° C i 15 h efterfulgt af 48 h inkubation ved 60 ° C.
  7. Forberedelse til billedbehandling, afsnit celle prøven indlejret i Agar 100 harpiks i skiver med tykkelse 60 nm ved hjælp af en ultramicrotome.
  8. Cellerne med forbehold af en 4% uranyl acetate/25% ethanol opløsning i 4 min. efterfulgt af 20 s af skylning med vand. Cellerne vaskes med Reynolds bly citrat i 3 min, efterfulgt af 20 s af skylning med vand.
  9. Udføre transmissions Elektron Mikroskopi billeddannelse af celle prøver. I vores forsøg, vi har brugt et transmissions-elektronmikroskop, der har været drevet på 120 kV.
  10. Fra hver optaget billede af en celle afsnit illustrerer den celle ultrastruktur, der viser en befolkning på vesikler i cellen cytoplasma, først kalibrere billede pixelstørrelse af vedrører den optagede skalalinjen i hvert TEM billede pixels. Bruge billedbehandling software til at bestemme vesikel størrelser på hvert billede af celler udsat for isotonisk eller hypertonisk betingelser. I vores forsøg og, brugte vi software ImageJ til billedanalyse. Det er værd at bemærke, at for billedanalyse af cellulære ultrastruktur fra TEM billeder af celler, størrelse justering af disse målinger baseret på tykkelsen af celle sektioner skal betragtes som og er tidligere beskrevet af Almers´s lab30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi i protokollen, for hvordan kombinerer TEM imaging sammen med to elektrokemiske metoder, kulfiber amperometry og intracellulære elektrokemiske flowcytometri, kan give oplysninger, der får et bredere syn hentyder til effekten af ekstracellulære osmotisk Tryk på sekretoriske vesikler og exocytose proces. Ved at sammenligne repræsentative amperometric optagelser af exocytose udgivelse på enkelt chromaffin celler ved hjælp af den eksperimentelle oprettet (vist i figur 1), var en betydelig reduktion i exocytotic aktivitet vises når celler blev udsat for osmotisk stress i forhold til cellerne i isotonisk betingelser (figur 2A)24. Fra disse optagelser og ved hjælp af Faraday´s lov, den samlede byrde opdaget af hver enkelte amperometric aktuelle spike blev brugt til at beregne antallet af molekyler bortvist fra enkelt vesikel exocytose begivenheder på celler udsat for de forskellige osmotisk betingelser. Til sammenligning, som det vises i figur 2B af det mindre areal af den gennemsnitlige amperometric nuværende opdaget spike af celler i hypertonisk løsning, færre neurotransmitter molekyler blev frigivet fra hver vesikel af celler sensing osmotisk stress24 .

For at afgøre, reversibilitet af denne nedgang i antallet af neurotransmitter molekyler frigivet, udførte vi amperometric optagelser af exocytose på celler udsat for en hypertonisk miljø og efterfølgende på celler efter placeret tilbage i en isotonisk miljø. I disse eksperimenter, chromaffin celler blev stimuleret tre gange i træk med BaCl2 løsning: først i en isotonisk buffer, efterfulgt af en anden stimulation efter celler blev udruget i 10 min i en hypertonisk løsning og endelig en tredje stimulation efter 10 min celle inkubation i isotonisk betingelser. Resultaterne præsentere vises i figur 3A at mængden af neurotransmittere udgivet blev reduceret ved ~ 50%, når celler blev udsat til den hypertonisk tilstand i forhold til den første Ba2 + stimulation i den isotoniske betingelse. Efterfølgende, når cellerne blev bragt tilbage til en isotonisk miljø og udsat for en tredje Ba2 + stimulation, mængde neurotransmitter frigivet pr. exocytose begivenhed var vendt tilbage til det oprindelige beløb registreres på den første stimulation, som bekræftede tidligere observationer14. Kontrol eksperimenter med tre successive Ba2 + stimulering af celler i den isotoniske betingelse viser (Se figur 3B), at flere sekventielle Ba2 + stimulering i isotonisk betingelser ikke ændrer den mængde neurotransmitter udgivet under exocytose. Dette tyder på, at vesikel quantal størrelse justeres hurtigt og kan dekrypteres med ekstracellulære osmolaritet.

Men når du analyserer amperometric spor fra disse eksperimenter i form af exocytose aktivitet, blev det klart, som vist i figur 4A, at exocytose aktivitet var væsentligt hæmmet når celler blev udsat for hypertonisk stress. Under osmotisk stress, blev exocytose begivenheder reduceret til 12% af aktiviteten på celler i isotonisk tilstand. Efterfølgende, efter den osmotiske chok og celler blev sat tilbage i et isosmotic miljø, genvandt celler 41% af deres oprindelige exocytose aktivitet. Interessant, kontrol eksperimenter udført i isotonisk betingelser viste, som vises i figur 4B, at efter at udføre tre på hinanden følgende BaCl2 stimulering, hyppigheden af exocytose begivenheder blev reduceret til 53% efter en anden stimulation og videre ned til 26% af det tredje stimulation i forhold til den første stimulering. Derfor er det klart, at fortløbende Ba2 + stimulering ikke synes at påvirke antallet af neurotransmittere frigivet fra hver vesikel exocytose udløses, men betydeligt påvirke effektiviteten af vesikel udgivelsesproces.

For at undersøge hvordan sekretoriske vesikler i deres oprindelige miljø påvirkes af ekstracellulære osmotisk stress vesikel volumen eller quantal nummer, vesikel størrelse analyse ved hjælp af TEM imaging blev kombineret med intracellulære elektrokemiske flowcytometri på celler udsat for isotonisk og hypertonisk betingelser. I de intracellulære elektrokemiske flowcytometri eksperimenter, blev en carbon fiber nanotip elektrode indsat i cytoplasma af levende chromaffin celler når de placeres i isotonisk og hypertonisk løsning (som vist i figur 5.) Den resulterende amperometric nuværende spike blev overvåget af hver vesikel i cellen cytoplasma kolliderede, adsorbing, og stochastically sprænges og frigive vesikel indholdet på overfladen af amperometric elektrode på sprængfyldt26. Den integrerede samlede byrde opdaget for hver top i nuværende versus tid spor blev brugt til at beregne den gennemsnitlige vesikel quantal størrelse i hver celle, optagelse af Faraday´s lov. Disse intracellulære elektrokemiske flowcytometri målinger, vist i figur 6 og figur 7B, viste, at vesikel quantal størrelse på celler udsat for osmotisk stress blev reduceret betydeligt i forhold til på celler i isotonisk betingelser. Sammenligne størrelsen af ændring i vesikel quantal størrelse målt ved intracellulære elektrokemiske flowcytometri, fraktioneret faldet i mængden af neurotransmitteren frigives under exocytose på celler oplever ekstracellulære osmotisk stress , viste en relative fald på 60% i både quantal størrelse og den mængde neurotransmitter udgivet i forhold til på celler i isotonisk betingelser (figur 7)24. For at vedrøre en potentielle variation i vesikel neurotransmitter koncentration af celler oplever osmotisk tryk justering i vesikel quantal størrelse, blev TEM billedanalyse udført for at bestemme vesikel størrelsen af celler udsat for isotonisk og hypertonisk betingelser. Desuden, den mørke farvning af tæt kerne protein matrix inde i LDCVs der er visualiseret i TEM billeder som et mørkt område i membranen bundet vesikler blev brugt til at måle mængden af tæt kerne matrix i disse vesikler. Som præsenteret i figur 8, blev vesikel størrelse reduceret til 60% på celler udsat for ekstracellulære osmotisk stress i forhold til på celler i isotonisk betingelser. Fra den beregnede mængde af målt diameteren af LDCV og den tæt kerne, omfanget af de omkringliggende halo løsning, der vises som en klar løsning inde LDCVs i TEM billeder beregnedes også. De opsummerede resultater fra TEM billedanalyse viste, som vist i figur 8, at ekstracellulære osmotisk chok det er primært mængden af halo løsning i LDCVs, der er reduceret24.

Figure 1
Figur 1 : Enkelt celle exocytose amperometry. En skematisk af den eksperimentelle nedsat til amperometric måling af exocytose på enkelt chromaffin celler24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Amperometric spor fra exocytose målinger.  (A) A repræsentative amperometric optagelse af exocytose på chromaffin celler i isotonisk (sort farve) og i hypertonisk (rød farve) ekstracellulære miljøer. (B) udvidelsen af en gennemsnitlig amperometric spike fra exocytose måling af chromaffin celler i isotonisk (sort) og hypertonisk (rød) ekstracellulære miljøer24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Reversibilitet af antallet af katekolaminer frigivet ved exocytose efter osmotisk chok. (A) antallet af molekyler frigives under exocytose fra chromaffin celler (n = 4) af tre på hinanden følgende Ba2 + stimulering, med den første stimulering i isotonisk, andet i hypertonisk, og tredje i isotonisk buffer. De statistiske resultater af uparret t-test er vist. P -værdien for sammenligning af den første Ba2 + stimulation (Ba2 + stim 1) i isotonisk buffer med den anden Ba2 + stimulation (Ba2 + stim 2) i hypertonisk buffer er p= 0.1088 og p-værdi for sammenligning af den anden Ba2 + stimulation i hypertonisk løsning med den tredje Ba2 + stimulation (Ba2 + stim 3) i isotonisk buffer er p = 0.059. (B) kontrol eksperiment viser mængden af neurotransmitteren molekyler udgivet på tre på hinanden følgende Ba2 + stimulering af chromaffin celler (n = 4) i isotonisk buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Effekten af osmotisk Tryk på exocytose aktivitet. (A) påvirkning af ekstracellulære osmolaritet exocytose aktivitet præsenteres som hyppigheden af exocytose arrangementer når chromaffin celler (n = 4) er stimuleret med barium løsning i isotonisk, så hypertonisk, og endelig i isotonisk betingelser. Værdierne er præsenteret som det gennemsnitlige antal pigge fra hver celle og gennemsnitlige fra alle celler stikprøven (standard fejl af middelværdien (SEM)). Den statistiske signifikans af ændringer er præsenteret ved hjælp af en t-test for uparret data ( p -værdi for isotonisk Ba2 + stimulation 1 og hypertonisk Ba2 + stimulation 2 er p= 0.0126 og p-værdien for sammenligning af hypertonisk Ba2 + stimulation 2 og isotonisk Ba2 + stimulation 3 er p= 0.037). (B) kontrol eksperiment præsenterer hyppigheden af exocytose begivenheder efter tre på hinanden følgende barium stimulering på chromaffin celler (n = 4) i isotonisk betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Intracellulære vesikel elektrokemiske flowcytometri at overvåge ændringer i vesikel quantal størrelse. (A) en skematisk af de eksperimentelle nedsat anvendte for intracellulære elektrokemiske flowcytometri. (B) en scanning Elektron Mikroskopi billede af en typisk nanotip konisk kulfiber elektrode24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Intracellulære elektrokemiske flowcytometri målinger viser (A) repræsentative spor af intracellulære amperometric flowcytometri optagelser på chromaffin celler i isotonisk (sort) og hypertonisk (rød) ekstracellulære miljøer. (B) udvidelsen af en gennemsnitlig amperometric spike fra intracellulære flowcytometri måling på chromaffin celler i isotonisk (sort) og hypertonisk (rød) ekstracellulære miljøer24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Kvantificering af antallet af katekolaminer ved exocytose og bestemmelse af vesikel quantal størrelse frigivet. (A) det gennemsnitlige antal molekyler frigives under exocytose optagelser på chromaffin celler i isotonisk (n = 22) og hypertonisk (n = 20) miljøer. Værdierne, der præsenteres som et gennemsnitligt antal molekyler pr. exocytose begivenhed fra hver celle og gennemsnit fra cellerne stikprøven (± SEM). Den statistiske signifikans af ændringer er præsenteret ved hjælp af t-testen for uparret data (p -værdi = 0,0003) (B) det gennemsnitlige antal molekyler per vesikel som opdaget af intracellulære elektrokemiske flowcytometri på chromaffin celler i isotonisk (n = 19) og hypertonisk (n = 16) betingelser. Værdierne er præsenteret som det gennemsnitlige antal molekyler per spike som fundet fra hver celle og gennemsnit fra alle celler stikprøven (± SEM). Den statistiske signifikans af ændringer er præsenteret ved hjælp af t-testen for uparret data (p - værdi = 0.0108)24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Effekt af osmotisk Tryk på store tæt kerne vesikel størrelse. Den beregnede volumen af LDCVs, tæt kerne protein og halo løsning omkring tæt kerne protein matrix blev beregnet i attolitres (aL) fra billedanalyse af TEM billeder af chromaffin celler i isotonisk (n = 12) og hypertonisk (n = 9) buffere. Resultaterne blev indsamlet fra et gennemsnit på 311 vesikler pr. celle og gennemsnit fra enkelt celler (± SEM). P-værdier er rapporteret fra uparret t-test sammenligning isotonisk og hypertonisk buffere. P-værdi er 0.0385 (*) for vesikel volumen, 0.3967 for tæt kerne volumen, 0.0047 (*) for halo bind24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer her en protokol og fordelene ved at kombinere tre supplerende analytiske metoder til at analysere sekretoriske vesikler og exocytose processen med at få en bedre forståelse af, hvordan en fysisk magt som osmotiske tryk kan påvirke sekretoriske vesikler og exocytose proces i sekretoriske celler. Disse metoder omfatter kulfiber mikroelektrode amperometry, som er en etableret metode til registrering af exocytose aktivitet, intracellulære elektrokemiske flowcytometri, der bruges til at bestemme quantal størrelse af vesikler i deres oprindelige miljø, og transmissions Elektron Mikroskopi billedanalyse til at overvåge sekretoriske vesikel volumen. I dette arbejde ved at indsamle kvantitative data fra amperometry optagelser af enkelt vesikel exocytose begivenheder på chromaffin celler udsat for en isotonisk og en hypertonisk ekstracellulære miljø, vi bekræftet, at osmotisk chok betydeligt reducerer de beløb neurotransmittere frigives under exocytose og at disse celler kan dekrypteres kan genoprette og frigive den oprindelige mængde, hvis placeret tilbage i en isotonisk miljø (figur 3).

Amperometric optagelser oplyst af hyppigheden af exocytose begivenheder versus tid og kan derfor også bruges til at overvåge ændringer i exocytose aktivitet på celler i forskellige osmotisk miljøer. Disse data kan fortolkes og anvendes til at skelne, om ændringer i aktivitet forekommer straks eller som funktion af tiden. Som vi viste i forrige arbejde, selv om osmotisk stress hæmmet exocytotic aktivitet, det ikke synes at hindre sammensmeltning af den let udgivelsesværdige pulje af vesikler24. Exocytose aktivitetsdata kan også bruges til at analysere de samlede exocytotic aktivitet i en periode af optagetid. Her præsenterer vi det akkumulerede antal exocytose begivenheder fra en 3-minutters optagelse af exocytose på chromaffin celler udsat for de to forskellige osmotiske betingelser. Disse data viser en hæmning i exocytose aktivitet af celler oplever osmotisk stress, og at en delvis genopretning af denne aktivitet kan opnås efter celler vende tilbage til en ekstracellulær isotonisk miljø. Men meget vigtigere kontrol eksperimenter viste, at flere Ba2 + stimulering inden for den tidsramme, der er brugt i disse eksperimenter forårsaget en betydelig reduktion i exocytose aktivitet af hver gang en celle blev stimuleret til sekretion. Ved den tredje træk Ba2 + stimulation, kun en tredjedel af exocytose aktivitet blev opretholdt, og klart barium, og måske også tidspunktet for stimulering i disse eksperimenter påvirker vesikel cyklus. Dette kan være relevante for at forklare hvorfor exocytotic aktivitet blev genfundet i celler placeret i isotonisk opløsning efter osmotisk chok og hvorfor disse celler, vises en tilsvarende relative reduktion i aktivitet sammenlignet med celler i isotonisk betingelser efter tre sekventiel Ba2 + stimulering. Derfor indeholder amperometry optagelse af exocytose oplysninger om sekretoriske vesikler fra det øjeblik vesikler er udløst for at smelte med plasma membran, frigivelse neurotransmittere gennem fusion pore. Dermed kvantitative data om enkelt vesikel neurotransmitter frigivelse og exocytose aktivitet kan indsamles.

Mængden af neurotransmitteren udgivet kan reguleres af tilstanden af exocytose, der udløses, hvor enten fuld vesikel indhold eller en del af indholdet er udgivet. Ved udelukkende at studere exocytose release ved hjælp af kulfiber amperometry, der registrerer kun, hvad er bortvist fra en vesikel, er det vanskeligt at skelne mellem om en ændring i den registrerede mængde neurotransmitter udgivet er relateret til en ændring i tilstanden udløst af exocytose, en ændring i de cellulære biofysiske egenskaber, der påvirker vesikel indhold udgivelse, eller ændringer i vesikel quantal størrelse. Derfor, ved at supplere amperometric optagelse af exocytose med målinger ved hjælp af de intracellulære elektrokemiske flowcytometri, i situ målinger af vesikel quantal størrelse på levende celler kan være karakteriseret og dermed bruges til at sammenligne den brøkdel af vesikel indhold udgivelse fra vesikler under exocytose26.

I dette arbejde, for at undersøge hvis vesikel quantal størrelse var påvirket af osmotisk stress, anvendte vi denne teknik til kvantificering og vurdering af vesikel quantal størrelse på celler udsat for isotonisk og hypertonisk betingelser. Da indsættelse af nanotip elektrode i cytoplasma af en levende celle betragtes snarere invasive, disse eksperimenter var kun udføres én gang pr. celle og var ikke gentages i den samme celle. Derfor, disse eksperimenter er fortrinsvis udført som individuelle målinger fra grupper af tilfældigt udvalgte celler udsat for en isotonisk og en hypertonisk ekstracellulære miljø. For at sammenligne ændringer i vesikel quantal størrelse målt ved intracellulære elektrokemiske flowcytometri til ændringer i den mængde neurotransmitter frigivet ved exocytose, bør man overveje matchende forsøgsbetingelser af intracellulære optagelse og også udføre amperometry optagelse af exocytose på separate tilfældige celler. Hvis undersøgelser er udført på den samme enkelt celle, er det vigtigt i disse eksperimentelle protokoller også overveje indflydelse af på hinanden følgende BaCl2 stimulering og sikre de eksperimentelle betingelser svarer til dem, der anvendes til intracellulære flowcytometri målinger. Det er også værd at bemærke, at det er vanskeligt at kontrollere den nøjagtige placering og dybde af elektrode når er indsat i en celle. Således giver hver celle en tilfældig stikprøve for vesikel quantal størrelse analyse. Derudover sondering vesikel quantal størrelse ved hjælp af denne metode skelnes ikke forskelle i, for eksempel, vesikel modenhed og derfor måske også tilføje variation til målinger. Intracellulære eksperimenter viste, at vesikel quantal størrelse var reduceret på celler udsat for ekstracellulære osmotisk tryk. Den relative reduktion i quantal størrelse påvises ved denne metode var i forhold til observationer af relative ændringer i neurotransmitter frigivelse under exocytose. Denne undersøgelse viste, at den relative nedgang i quantal størrelse var på samme rækkefølge som drop i neurotransmitter frigivelse på celler sensing osmotisk stress.

At kontrollere, hvis osmotisk stress var at ændre vesikel neurotransmitter koncentration, vesikel volumen blev evalueret ved hjælp af TEM imaging analyse for kemisk fast chromaffin celler, der havde været udsat for isotonisk og hypertonisk betingelser. TEM imaging analyse viste at vesikler skrumpe når cellerne er udsat for en osmotisk chok og at den relative reduktion i størrelse er justeret med vesikel quantal størrelse til at opretholde en konstant neurotransmitter koncentration24. TEM billedanalyse, hvorefter nanometer Billedopløsningen kan skelne de to faser, tæt kerne protein matrix og de omkringliggende halo løsning inde i LDCVs, og dermed gør det muligt at bestemme omfanget af tæt kerne protein matrix og beregne omfanget af halo løsning. Fra denne analyse, var nedgangen i vesikel volumen fast besluttet på at være primært relateret til en faldende volumen fra halo løsning omkring tæt kerne protein matrix24.

I Resumé, denne undersøgelse præsenterer en protokol demonstrerer hvordan tre analytiske metoder kombineres, og giver mulighed for karakterisering af sekretoriske vesikler før neurotransmitter frigivelse og hvad er frigivet fra disse vesikler når celler udløses til exocytose, at få en bedre forståelse af hvordan sekretoriske vesikler og celle funktioner som exocytose påvirkes af ekstracellulære stress. Denne protokol kan også bruges til at hjælpe med at besvare spørgsmål om hvordan neurotransmitter frigivelse ved exocytose og vesikel quantal størrelse påvirkes af andre ændringer i det fysiske miljø eller potentielle lægemidler, der kan påvirke sekretoriske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke det svenske Forskningsråd (349-2007-8680) for finansiering og Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Sverige) for donation af kvæg binyrerne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Tags

Neurovidenskab sag 132 Chromaffin celler osmotisk tryk tæt kerne vesikler neurotransmitter koncentration quantal størrelse exocytose amperometry intracellulære flowcytometri transmissions elektronmikroskopi
Overvågning af effekten af osmotisk Stress på sekretoriske vesikler og exocytose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi,… More

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. S. Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis. J. Vis. Exp. (132), e56537, doi:10.3791/56537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter