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Neuroscience

स्रावी बुलबुले और Exocytosis पर आसमाटिक तनाव के प्रभाव की निगरानी

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

आसमाटिक तनाव exocytosis और न्यूरोट्रांसमीटर इस प्रक्रिया के दौरान जारी की मात्रा को प्रभावित करता है. हम प्रदर्शन कैसे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ विद्युत तरीकों के संयोजन के लिए exocytosis गतिविधि पर extracellular आसमाटिक दबाव के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है, पुटिका quantal आकार, और न्यूरोट्रांसमीटर की राशि जारी दौरान exocytosis.

Abstract

आसमाटिक शॉक के अधीन कोशिकाओं की Amperometry रिकॉर्डिंग स्रावी कोशिकाओं exocytosis गतिविधि और न्यूरोट्रांसमीटर एकल exocytosis घटनाओं में बुलबुले से जारी की मात्रा को कम करने के द्वारा इस शारीरिक तनाव का जवाब है कि दिखा. यह सुझाव दिया गया है कि न्यूरोट्रांसमीटर निष्कासित में कमी झिल्ली में परिवर्तन के कारण है भौतिक गुण जब कोशिकाओं आसमाटिक तनाव के जवाब में हटना और मांयताओं के साथ बनाया है कि सेल कोशिका द्रव्य में स्रावी बुलबुले प्रभावित नहीं कर रहे हैं तक extracellular आसमाटिक तनाव । exocytosis पर नज़र रखता है की Amperometry रिकॉर्डिंग क्या कोशिकाओं से जारी है पल एक पुटिका प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, लेकिन पुटिका सामग्री पर जानकारी प्रदान नहीं करता है इससे पहले कि पुटिका फ्यूजन ट्रिगर है । इसलिए, अंय पूरक विश्लेषणात्मक तरीके है कि कोशिकाओं पर exocytosis से पहले स्रावी बुलबुले निस्र्पक में सक्षम है के साथ amperometry रिकॉर्डिंग के संयोजन से ट्रिगर है कैसे स्रावी बुलबुले की जांच के लिए एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है और exocytosis प्रक्रिया आसमाटिक सदमे से प्रभावित हैं । हम यहाँ intracellular विद्युत cytometry और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग के साथ amperometry रिकॉर्डिंग पूरक का वर्णन कैसे स्रावी बुलबुले आकार और न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री में परिवर्तन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आसमाटिक तनाव से पहले और बाद में जोखिम exocytosis गतिविधि के संबंध में chromaffin कोशिकाओं । मात्रात्मक जानकारी सभी तीन विश्लेषणात्मक तरीकों का उपयोग कर प्रयोगों से प्राप्त जोड़ने के द्वारा, निष्कर्ष पहले किया गया है कि स्रावी बुलबुले के आकार में सिकुड़ते और पुटिका quantal आकार को कम करने से आसमाटिक तनाव extracellular का जवाब एक निरंतर पुटिका न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता बनाए रखें. इसलिए, इस के बारे में कुछ स्पष्टीकरण देता है क्यों बुलबुले, आसमाटिक तनाव के जवाब में, मात्रा exocytosis रिहाई के दौरान जारी न्यूरोट्रांसमीटर कम । amperometric रिकॉर्डिंग यहां संकेत यह एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है और कि पुटिका के बाद आसमाटिक सदमे न्यूरोट्रांसमीटर के साथ फिर से भर रहे हैं जब रखा कोशिकाओं को एक isotonic वातावरण में वापस आ रहे हैं.

Introduction

अधिवृक्क ग्रंथि में Chromaffin कोशिकाओं neuroendocrine कोशिकाओं है कि रक्त प्रवाह में न्यूरोट्रांसमीटर अणुओं जारी कर रहे हैं. यह एक सेलुलर प्रक्रिया है कि डॉकिंग और न्यूरोट्रांसमीटर भरा बुलबुले के फ्यूजन शामिल है के माध्यम से होता है, exocytosis नामक एक प्रक्रिया में extracellular अंतरिक्ष के लिए बुलबुले से सामग्री रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप. chromaffin कोशिकाओं में न्यूरोट्रांसमीटर (एड्रेनालाईन और noradrenaline) सक्रिय रूप से बड़े घने कोर बुलबुले (LDCVs) में झिल्ली प्रोटीन द्वारा ले जाया जाता है और उच्च सांद्रता (~ 0.5-1 मीटर)1,2पर संग्रहीत । LDCVs अंदर न्यूरोट्रांसमीटर के संचय intravesicular घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स chromogranin प्रोटीन के शामिल करने के लिए catecholamine अणुओं के संबध द्वारा पूरा किया जाता है (~ १६९ मिलीग्राम/एमएल)3,4,5 ,6, और catecholamine लोड हो रहा है और इस तरह के एटीपी के रूप में पुटिका में भंडारण के लिए प्रमुख घटकों से युक्त एक intravesicular कॉकटेल समाधान (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 समाधान में µ मीटर और ~ ४० mm करने के लिए बाध्य प्रोटीन मैट्रिक्स)8, मिलीग्राम2 + (5 मिमी)9, ascorbate (10-30 मिमी)10, और एक पीएच के ~ ५.५11,12. LDCVs कक्ष कोशिका द्रव्य (३१० mOsm/kg) 13 के साथ एक iso-आसमाटिक शर्त बनाए रखता है, भले ही बुलबुले के अंदर सैद्धांतिक घुला हुआ एकाग्रता ७५० mM से अधिक तक योग करता है । intravesicular घटकों की संरचना न केवल catecholamines के लदान और भंडारण के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी solutes के एकत्रीकरण के लिए घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स के लिए । यह काफी कम हो जाती है बुलबुले के osmolarity काफी कम हो जाता है और exocytosis के दौरान जारी किया गया है कि राशि catecholamine को प्रभावित कर सकते हैं,6.

amperometric रिकॉर्डिंग द्वारा exocytosis प्रक्रिया पर extracellular आसमाटिक दबाव के प्रभाव पर अध्ययन ने बताया है कि उच्च extracellular आसमाटिक दबाव exocytosis गतिविधि को रोकता है और न्यूरोट्रांसमीटर एकल से स्रावित की संख्या कम कर देता है पुटिका कंपार्टमेंट4,14,15,16,17,18,19। इन टिप्पणियों के स्पष्टीकरण सेल में भीड़ macromolecular की संभव वृद्धि पर अटकलें लगाई है कोशिका द्रव्य बाधा पुटिका फ्यूजन की घटनाओं, और झिल्ली में परिवर्तन एक भौतिक की संख्या को प्रभावित संपत्तियों न्यूरोट्रांसमीटर exocytosis के दौरान जारी किया. इन विचारों का मानना है कि उच्च extracellular आसमाटिक तनाव पुटिका quantal आकार, जो न्यूरोट्रांसमीटर पुटिका के पूर्व चरण में एक exocytosis डिब्बे में संग्रहीत अणुओं की संख्या को परिभाषित करता है प्रभावित नहीं होता है14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. एकल कोशिकाओं में exocytosis रिहाई के amperometric माप में, एक कार्बन फाइबर डिस्क microelectrode सेल सतह के साथ निकट संपर्क में रखा गया है, एक प्रयोगात्मक सेट अप synapse विंयास, नकल उतारना बनाने जहां amperometric इलेक्ट्रोड एक postsynaptic डिटेक्टर के रूप में कार्य करता है (चित्रा 1)22,23. exocytosis के लिए एक सेल उत्तेजक द्वारा, एक न्यूरोट्रांसमीटर भरा बुलबुले के लिए सेल प्लाज्मा झिल्ली और रिहाई भाग या extracellular अंतरिक्ष में पूर्ण पुटिका सामग्री के साथ फ्यूज करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं. इन न्यूरोट्रांसमीटर इलेक्ट्रोड की सतह पर जारी अणुओं electrochemically का पता लगाया जा सकता है अगर न्यूरोट्रांसमीटर electroactive हैं (उदा, catecholamines) के एक redox क्षमता लागू करने से + ७०० एमवी बनाम एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड . नतीजतन, वर्तमान spikes की एक श्रृंखला अलग exocytosis घटनाओं का पता लगाने के निशान । एक amperometric रिकॉर्डिंग में वर्तमान बनाम समय का पता लगाने से, प्रत्येक एकल amperometric स्पाइक के तहत क्षेत्र exocytosis घटना के प्रति पाया आरोप का प्रतिनिधित्व करता है और फैराडे समीकरण का उपयोग कर, जारी न्यूरोट्रांसमीटर के तिल में परिवर्तित किया जा सकता है. इसलिए, amperometric रिकॉर्डिंग मात्रा न्यूरोट्रांसमीटर एकल exocytosis घटनाओं से निष्कासित कर दिया और exocytosis घटनाओं की आवृत्ति पर रिपोर्ट पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन स्रावी बुलबुले पर मात्रात्मक जानकारी मौजूद नहीं है पुटिका फ्यूजन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज से पहले सामग्री शुरू की गई है ।

इसलिए, कैसे सेल कोशिका द्रव्य में स्रावी बुलबुले के लिए एक बेहतर समझ पाने के लिए extracellular आसमाटिक तनाव का जवाब सेल से पहले exocytosis से गुजरना शुरू हो रहा है, अंय पूरक विश्लेषणात्मक तरीके इस जानकारी को समृद्ध किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि आसमाटिक तनाव पुटिका मात्रा में परिवर्तन की जांच करने के लिए, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग विश्लेषण रासायनिक निर्धारण के बाद कोशिकाओं के पुटिका आकार को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जांच करने के लिए अगर आसमाटिक तनाव पुटिका quantal आकार, हाल ही में विकसित amperometric intracellular विद्युत cytometry नामक तकनीक को प्रभावित करता है, ठहराव में पुटिका में न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री के स्रावी के लिए लागू किया जा सकता है में बुलबुले उनके देशी राज्य जब अभी भी जीवित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में 26 रहते हैं । intracellular विद्युत cytometry तकनीक में, एक nanotip बेलनाकार कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड धीरे रहते कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में डाला जाता है और, इस इलेक्ट्रोड के लिए एक + ७०० एमवी क्षमता लागू करने के द्वारा (बनाम एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड), बुलबुले में catecholamine सामग्री एकल बुलबुले टकराने से एक redox वर्तमान स्पाइक का पता लगाने के द्वारा quantified जा सकता है, adsorbing, और बाद में इलेक्ट्रोड सतह पर stochastically rupturing और इस तरह के खिलाफ अपनी सामग्री को रिहा इलेक्ट्रोड26सतह । इसलिए, amperometric वर्तमान बनाम समय ट्रेस में, प्रत्येक एकल पुटिका rupturing घटना एक वर्तमान क्षणिक में परिणाम कर सकते हैं और, प्रत्येक वर्तमान स्पाइक के क्षेत्र को एकीकृत करके, पुटिका quantal आकार फैराडे ´ एस कानून का उपयोग कर गणना की जा सकती है.

इसलिए, मात्रात्मक जानकारी से प्राप्त पुटिका आकार मापन पुटिका quantal आकार विश्लेषण के साथ एक साथ उनि इमेजिंग का उपयोग करके, के रूप में intracellular विद्युत cytometry द्वारा दर्ज की गई, पुटिका न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता भी कर सकते हैं निर्धारित किया जाए । यह पुटिका लक्षण वर्णन की अनुमति देता है जब कोशिकाओं को विभिंन आसमाटिक शर्तों को उजागर कर रहे है और कैसे बुलबुले के मंच पर extracellular आसमाटिक तनाव का जवाब हो सकता है पहले exocytosis पर एक बेहतर विचार प्रदान करता है । इन तरीकों के संयोजन से परिणाम से पता चला है कि extracellular उच्च आसमाटिक दबाव की उपस्थिति में, बुलबुले हटना और उनके quantal आकार को समायोजित करने और इन माप से संबंधित परिवर्तन पर मात्रात्मक जानकारी की तुलना से पता चलता है कि सिकुड़ते हुए, बुलबुले उनकी सामग्री और आकार को समायोजित करने के लिए एक निरंतर न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता बनाए रखने के लिए24. इस प्रकार, यह समझ आसमाटिक तनाव को उजागर कोशिकाओं में न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई पर किए गए टिप्पणियों से जोड़ने में मूल्यवान है. इन प्रोटोकॉल में, हम इन तीन पूरक तरीके के उपयोग का वर्णन है कि कैसे अपने पैतृक वातावरण में स्रावी बुलबुले के लक्षण वर्णन की अनुमति extracellular परासरणीयता और exocytosis पर इस प्रतिक्रिया के प्रभाव का जवाब प्रक्रिया. हमारे पिछले exocytosis पर उच्च आसमाटिक दबाव के प्रभाव के बारे में टिप्पणियों के अलावा24, हम आसमाटिक सदमे और chromaffin में कई बेरियम उत्तेजना के प्रभाव के बाद सेल वसूली का वर्णन है कि अतिरिक्त प्रयोग वर्तमान कोशिकाओं.

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Protocol

1. गोजातीय Chromaffin कोशिकाओं अधिवृक्क ग्रंथियों से एंजाइमी पाचन द्वारा पृथक की कोशिका संस्कृति

  1. गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों से एकत्र chromaffin कोशिकाओं को अलग करने के लिए, ७०% इथेनॉल समाधान के साथ कोशिकाओं को निष्फल । एक स्केलपेल का उपयोग कर वसा और संयोजी ऊतक दूर ट्रिम कर दीजिए । रक्त निकालने के लिए, अधिवृक्क समाधान (NaCl १५४ mm, KCl ५.६ mm, NaHCO3 ३.६ mm, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) ५.६ mm पर पीएच ७.४) है कि ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए थर्मोस्टेट किया गया है का उपयोग करते हुए
  2. ऊतक पचाने के लिए, लगभग २.५ मिलीलीटर गर्म बाँझ का इंजेक्शन द्वारा प्रत्येक ग्रंथि फुलाना-एक सिरिंज का उपयोग कर अधिवृक्क नस के माध्यम से फ़िल्टर ०.२% collagenase P समाधान और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऊतक मशीन. ग्रंथियों की जांच मज्जा की पाचन प्रक्रिया को सुनिश्चित करने के लिए पूरा हो गया है । ऊतक नरम और तनाव नहीं महसूस करना चाहिए ।
  3. अनुदैर्ध्य दिशा में ग्रंथियों के बंद snipping द्वारा पच मज्जा लीजिए. एक स्केलपेल का उपयोग कर मज्जा ऊतक कीमा । फिल्टर एक इस्पात छलनी पर ऊतक निलंबन और collagenase पी की गतिविधि को कम करने के लिए लगभग एक ५० मिलीलीटर की मात्रा के लिए है लोके समाधान के साथ पतला
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक केंद्रापसारक में ३०० एक्स जी में कोशिकाओं गोली और ५० मिलीलीटर बाँझ परीक्षण ट्यूबों में इकट्ठा । फिर से 20 मिलीलीटर है लोके समाधान में प्राप्त गोली निलंबित और एक बाँझ १००-ट्यूबों में µm नायलॉन जाल पर समाधान फिल्टर ।
  5. बाँझ Percoll (1:1) के साथ chromaffin सेल निलंबन मिश्रण है और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए १८,६०० x g पर सेल समाधान केंद्रापसारक । घनत्व ढाल के शीर्ष परत लीजिए और ट्यूबों में एक १००-µm नायलॉन जाल पर समाधान फिल्टर ।
  6. Percoll को बाहर करने के लिए, है लोके समाधान के साथ सेल निलंबन पतला और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर फिर से पहले-है लोके समाधान में गोली सस्पैंड । पृथक कोशिका निलंबन का अनुमानित कोशिका घनत्व लगभग ४,०००,००० कोशिकाओं/
  7. के बारे में १७.५ × 103 कोशिकाओं के घनत्व पर exocytosis और intracellular cytometry माप, प्लेट chromaffin कोशिकाओं में कोलेजन IV लेपित ६० mm प्लास्टिक व्यंजन की amperometric रिकॉर्डिंग के लिए और एक 5% CO 2 में ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन पर्यावरण. सेल संस्कृति के 1-3 दिनों के भीतर विद्युत प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं ।
  8. उनि इमेजिंग प्रयोगों के लिए, प्लेट chromaffin कोशिकाओं में ७५ सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी और 1 दिन के लिए एक 5% सह2 वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी में 7-8 लाख कोशिकाओं के घनत्व पर ।

2. सिंगल सेल Exocytosis Amperometry गडबड24

  1. इन प्रयोगों के लिए कार्बन फाइबर microelectrodes बनाना, इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा कि सिर मंच पर इलेक्ट्रोड धारक के लिए उपयुक्त एक बाहरी व्यास के साथ एक गिलास केशिका ले । १.२ मिमी के एक बाहरी व्यास और ०.६९ मिमी के एक भीतरी व्यास के साथ एक borosilicate ग्लास केशिका का प्रयोग करें ।
    1. एक पानी की आकांक्षा ट्यूब के लिए केशिका समाप्त होता है से कनेक्ट । कुछ पर 5 µm व्यास कार्बन फाइबर प्लेस, ऐसे सफेद कागज का एक टुकड़ा के रूप में, दृश्य को बढ़ाने के लिए ।
    2. एक कार्बन फाइबर की पहचान करें और फाइबर को एक छोर पर नीचे एक उंगली से कार्बन फाइबर रखने के लिए जगह में जबकि कार्बन फाइबर के मुक्त अंत करने के लिए निकटता में केशिका के खुले अंत स्थिति रखें । धीरे कार्बन फाइबर महाप्राण कि कार्बन फाइबर केशिका के दोनों सिरों के माध्यम से बाहर चिपक जाती है ताकि कांच केशिका में । आकांक्षा बल दूर हटो ।
  2. एक micropipette खींचने में कार्बन फाइबर के साथ केशिका प्लेस और दो अलग गिलास पिपेट सुझावों में कांच केशिका खींच । दो ग्लास सुझावों के बीच जुड़ा हुआ है कि कार्बन फाइबर डिस्कनेक्ट करने के लिए, कार्बन फाइबर में कटौती और दो कार्बन फाइबर microelectrodes हासिल करने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें ।
  3. एक खुर्दबीन के नीचे, एक मोटा माइक्रोस्कोप स्लाइड है कि जहां फाइबर कांच केशिका कोटिंग से एक स्केलपेल का उपयोग कर रहा है के किनारे पर कार्बन फाइबर की पुस्तिका काटने की अनुमति देता है की चोटी पर कार्बन फाइबर जगह है ।
  4. कार्बन फाइबर काटने के बाद, एक गिलास लेपित कार्बन फाइबर टिप छोड़ने, एक epoxy समाधान में इलेक्ट्रोड टिप के कुछ मिमी डालने के लिए 10 मिनट epoxy को खींचने के लिए और कार्बन फाइबर और आसपास के कांच के बीच किसी भी संभव खुले स्थान सील. इलेक्ट्रोड की नोक पर बनाने से भारी गोंद बूंदों को रोकने के लिए epoxy समाधान के धीरे से बाहर लिफ्ट ।
  5. एक धारक पर इलेक्ट्रोड प्लेस (उदा., एक लकड़ी के फ्लैट स्टिक) दो साइड चिपचिपा गर्मी प्रतिरोधी टेप के साथ जो इलेक्ट्रोड संलग्न किया जा सकता है । epoxy का इलाज इलेक्ट्रोड एक ओवन में रातोंरात १०० डिग्री सेल्सियस पर सेंकना । इलेक्ट्रोड युक्तियाँ आसानी से तोड़ने अगर वे एक सतह के साथ संपर्क में आते हैं, तो इलेक्ट्रोड हमेशा सुरक्षित रूप से एक धारक जहां इलेक्ट्रोड जगह में तय कर रहे हैं और सुझावों को छुआ जा रहा जोखिम नहीं है का उपयोग कर संग्रहीत कर रहे हैं सुनिश्चित करते हैं.
  6. एक फ्लैट डिस्क इलेक्ट्रोड सतह को प्राप्त करने के लिए, इलेक्ट्रोड एक microgrinder के धारक में रखें और प्रत्येक कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड ४५ ° के एक देवदूत पर बेवल. बेवलिंग के बाद, एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर बाद में केशिका exocytosis माप के लिए कक्षों के पास रखते समय एक ४५ ° कोण पर डिस्क इलेक्ट्रोड सतह को ढूँढने के लिए कैसे पता करने के लिए इसकी topside को चिह्नित करें ।
    नोट: इस कदम के रूप में इन प्रयोगों में महत्वपूर्ण है, ओवल डिस्क इलेक्ट्रोड पेट्री डिश की सतह के समानांतर इसकी सतह के साथ कोशिकाओं के शीर्ष पर फ्लैट रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, बेवलिंग इलेक्ट्रोड एक ताजा और साफ इलेक्ट्रोड सतह को सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगों के रूप में एक ही दिन किया जाता है ।
  7. उपयोग करने से पहले, एक परीक्षण समाधान में एक कार्बन फाइबर microelectrode जगह (उदा, ०.१ mM पंजाब में डोपामाइन बफर (पीएच ७.४)) स्थिर राज्य चक्रीय voltammetry का उपयोग कर वर्तमान पर नजर रखने के लिए । एक चक्रीय voltammetry स्कैन के लिए, एक त्रिकोण संभावित तरंग से लागू-०.२ v करने के लिए ०.८ v बनाम एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड पर अच्छी प्रतिक्रिया सुनिश्चित कैनेटीक्स डेटा प्राप्त कर रहे हैं कि एक 5 µm व्यास डिस्क के लिए सैद्धांतिक रूप से गणना मूल्यों के साथ समझौते में हैं कार्बन फाइबर microelectrode25.
  8. exocytosis की amperometry रिकॉर्डिंग के लिए, पेट्री डिश को एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कल्चर्ड chromaffin कोशिकाओं के साथ रखें । यह amperometry रिकॉर्डिंग के दौरान इलेक्ट्रॉनिक शोर को खत्म करने के लिए एक फैराडे पिंजरे के साथ सेट माइक्रोस्कोप ढाल करने के लिए महत्वपूर्ण है, बहुत छोटे धाराओं के कारण मापा जा रहा है. सेल प्रयोगों के दौरान ३७ डिग्री सेल्सियस का तापमान बनाए रखने के लिए एक माइक्रोस्कोप हीटिंग स्टेज का उपयोग करें ।
  9. एक कम शोर पैच दबाना साधन का उपयोग एक निरंतर क्षमता लागू करने के लिए + ७०० एमवी काम इलेक्ट्रोड बनाम एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड है कि भी पेट्री डिश में काम कर रहे इलेक्ट्रोड से दूर रखा गया है. chromaffin कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग exocytosis के लिए, 10 khz पर संकेत digitalize और रिकॉर्ड किए गए सिग्नल को फ़िल्टर करने के लिए 2 khz पर एक आंतरिक कम पास बिसेल फिल्टर लागू होते हैं.
  10. एकल कोशिकाओं पर amperometric रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए, potentiostat के साथ प्रयोग किया जाता है कि सिर मंच के इलेक्ट्रोड धारक में हौसले से बेवल और परीक्षण कार्बन फाइबर डिस्क microelectrode माउंट ।
    1. धीरे से इलेक्ट्रोड की जगह फ्लैट ओवल डिस्क आकार इलेक्ट्रोड सतह के शिखर सतह की ओर नीचे का सामना करना पड़ और जगह इलेक्ट्रोड कोशिका झिल्ली के साथ संपर्क में एक micromanipulator का उपयोग कर.
    2. कोशिका झिल्ली के शीर्ष पर नियुक्ति पर इलेक्ट्रोड द्वारा की वजह से सेल विरूपण की निगरानी के द्वारा इलेक्ट्रोड से सेल के लिए दूरी समायोजित करें और फिर ध्यान से एक दूरी के लिए इलेक्ट्रोड जहां सेल अपने मूल सेल आकार के करीब एक आकृति प्राप्त करने के लिए वापस लेना . काइनेटिक और मात्रात्मक रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श एक सौ nanometers की एक पतली तरल फिल्म बनाने के लिए इलेक्ट्रोड और सेल की सतह, जो एक synapse में रासायनिक रिहाई के postsynaptic का पता लगाने के लिए समान स्थिति है अलग करने के लिए है ।
  11. exocytosis करने के लिए कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, 2-3 µm व्यास के एक टिप आकार के साथ एक गिलास micropipette की स्थिति, 5 मिमी BaCl2 समाधान से कम 20 µm की दूरी पर कक्ष से दूर, को प्रभावित करने के लिए पिपेट टिप से लीक किसी भी समाधान को रोकने के लिए प्रयोग और सेल सतह पर 5 मिमी BaCl2 समाधान के 5 एस इंजेक्शन पल्स लागू करने के लिए सेल exocytosis को उत्तेजित ।
  12. exocytosis प्रक्रिया पर आसमाटिक दबाव के प्रतिवर्ती प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एक isotonic बफर समाधान तैयार (१५० मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, १.२ मिमी MgCl2, 5 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी HEPES, पीएच ७.४) के साथ ३१० mOsm/kg आईएसओ-आसमाटिक दबाव और एक hypertonic का समायोजन करके बनाया बफर एक परासरणीयता के साथ isotonic बफर समाधान के NaCl एकाग्रता इसी ७३० mOsm/
  13. isotonic बफर में कोशिकाओं प्लेस और लगभग 3 मिनट के लिए शुरू exocytosis गतिविधि के दौरान amperometric वर्तमान यात्रियों रिकॉर्डिंग जबकि एक बेरियम इंजेक्शन पल्स लागू करने से exocytosis करने के लिए सेल को उत्तेजित ।
    1. hypertonic स्थितियों के लिए isotonic शर्तों में exocytosis प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए, hypertonic बफर समाधान में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन और उसके बाद बेरियम को उत्तेजित करने के लिए एक exocytosis इंजेक्शन पल्स लागू करते हैं और amperometric रिकॉर्डिंग के 3 मिनट प्रदर्शन.
    2. कोशिकाओं की प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया के लिए, isotonic बफर समाधान में 10 मिनट के लिए फिर से गर्मी कोशिकाओं और एक 5 एस बेरियम इंजेक्शन पल्स लागू करने और सेल से exocytosis प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के 3 मिनट के प्रदर्शन से कोशिकाओं को उत्तेजित ।
  14. कई बेरियम उत्तेजनाओं द्वारा exocytosis गतिविधि पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए नियंत्रण प्रयोगों के रूप में, BaCl बफर में रखा एक ही सेल पर लगातार तीन isotonic2 उत्तेजना से exocytosis रिहाई की एक amperometric रिकॉर्डिंग प्रदर्शन और अलग osmolarity के साथ लगातार सेल मशीन प्रयोगों के लिए एक ही समय प्रोटोकॉल का उपयोग करना ।

3. Intracellular विद्युत Cytometry24,26

  1. पुटिका quantal आकार माप के लिए इलेक्ट्रोड बनाना, एक ही सामग्री का उपयोग करें और amperometric exocytosis के लिए microelectrode निर्माण के वर्गों २.१ और २.२ में विवरण के अनुसार व्यास कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड में एक 5 µm की तैयारी शुरू माप.
  2. एक खुर्दबीन के नीचे, एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए कार्बन फाइबर कांच की नोक से बाहर का विस्तार इतना है कि एक 30 से १०० µm को लेकर लंबाई के साथ एक कार्बन फाइबर कांच टिप से बाहर चिपके हुए छोड़ दिया है ।
  3. कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड की एक लौ धंसा टिप तैयार करने के लिए, एक ब्यूटेन लौ का उपयोग करें । एक समान रूप से धंसा हुआ प्राप्त करने के लिए, बेलनाकार आकार इलेक्ट्रोड टिप, बेलनाकार आकार कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड पकड़ जबकि यह घूर्णन और कार्बन फाइबर ब्यूटेन लौ के नीले किनारे में कांच से विस्तार करने के लिए जगह जब तक कार्बन की नोक एक लाल विकसित रंग. यह अक्सर 2 से कम एस लेता है । यदि सफल, व्यास में 50-100 एनएम के एक धंसा इलेक्ट्रोड टिप आकार में इस परिणाम (ऐसी टिप की एक SEM छवि में दिखाया गया है चित्रा 5B) । लौ नक़्क़ाशी के बाद, इलेक्ट्रोड टिप का मूल्यांकन करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे रखने के.
  4. एक एसीटोन समाधान में इलेक्ट्रोड टिप की सूई एक 15 एस द्वारा पीछा किया 3 मिनट के लिए epoxy समाधान में बेलनाकार nanotip microelectrode डालें । इस epoxy कार्बन फाइबर और अछूता ग्लास केशिका दीवार के बीच संभावित अंतर अंतरिक्ष सील करने के लिए अनुमति देता है, जबकि एसीटोन नक़्क़ाशी कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड सतह से epoxy साफ करता है । epoxy का इलाज करने के लिए, १०० डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक ओवन में इलेक्ट्रोड सेंकना ।
  5. उपयोग करने से पहले, प्रत्येक कार्बन फाइबर microelectrode के स्थिर राज्य वर्तमान परीक्षण, के रूप में खंड २.७ में बताया चक्रीय voltammetry का उपयोग कर । प्रयोगों के लिए, केवल 1.5-2.5 ना27के आसपास एक पठार वर्तमान प्रदर्शन इलेक्ट्रोड का उपयोग करें ।
  6. सेलुलर amperometry माप के लिए, २.८ में वर्णित के रूप में माइक्रोस्कोप पर कोशिकाओं जगह और २.९ में वर्णित के रूप में potentiostat की एक ही प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग करें ।
  7. intracellular amperometric माप करने के लिए, और कोशिका के लिए महत्वपूर्ण शारीरिक क्षति को रोकने के लिए, सेल में nanotip बेलनाकार microelectrode को एक सौंय यांत्रिक बल जोड़कर, बस सेल प्लाज्मा के माध्यम से इलेक्ट्रोड धक्का करने के लिए पर्याप्त डालें झिल्ली और कोशिका कोशिका द्रव्य में एक micromanipulator का उपयोग कर ।
  8. प्रविष्टि के बाद, और कोशिका झिल्ली के साथ बेलनाकार इलेक्ट्रोड के चारों ओर सील, लाइव सेल में सीटू में amperometric रिकॉर्डिंग शुरू. ऑक्सीकरण क्षमता है कि इलेक्ट्रोड के लिए लागू किया जाता है पर, बुलबुले इलेक्ट्रोड सतह और stochastically टूटना करने के लिए adsorb जाएगा.  इसलिए, इस प्रक्रिया को आरंभ करने के लिए किसी भी प्रकार की उत्तेजना की आवश्यकता नहीं है ।
  9. पुटिका quantal आकार पर आसमाटिक प्रभाव निर्धारित करने के लिए, उन कक्षों के समूह से intracellular cytometry माप एकत्रित करें जिन्हें isotonic में और hypertonic बफ़र में खंड २.१३ में वर्णित प्रयोगात्मक स्थिति का उपयोग करके किया गया है.

4. Amperometry रिकॉर्डिंग के डेटा विश्लेषण

  1. exocytosis और intracellular पुटिका quantal आकार विश्लेषण से दर्ज amperometry डेटा का विश्लेषण करने के लिए, एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम है कि दर्ज की मौजूदा बनाम समय ट्रेस में वर्तमान यात्रियों के विश्लेषण की अनुमति देता है का उपयोग करें ताकि काइनेटिक पीक मापदंडों और व्यक्तिगत वर्तमान चोटियों के लिए एकीकृत कुल शुल्क निर्धारित किया जा सकता है । डेटा विश्लेषण के लिए, हम िोने लैब में विकसित सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया है कि डेटा विश्लेषण कार्यक्रम इगोर28के लिए लिखा गया था ।
  2. amperometric spikes का विश्लेषण करते समय, प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए शोर के तीन गुना जड़-माध्य वर्ग (RMS) मानक विचलन की चोटियों के लिए एक थ्रेशोल्ड सीमा का चयन करें ।
  3. गाऊसी आकार का पालन नहीं करते कि गलत spikes को रोकने के लिए मैन्युअल रूप से प्रत्येक सेल रिकॉर्डिंग से amperometric spikes इकट्ठा, डबल spikes जो विलय exocytosis घटनाओं का परिणाम हो सकता है, और केवल तीन बार की दहलीज के साथ गाऊसी के आकार का spikes स्वीकार RMS शोर से अधिक है ।
  4. एक amperometric चोटी प्रति कुल शुल्क के लिए डेटा इकट्ठा करने और Faradays कानून का उपयोग करें (n = QnF) catecholamine न्यूरोट्रांसमीटर के दाढ़ मात्रा की गणना करने के लिए प्रति exocytosis या intracellular एकल पुटिका टूटना घटना है, जहां N के तिल है इलेक्ट्रोड सतह पर एक redox प्रतिक्रिया के माध्यम से जा न्यूरोट्रांसमीटर, क्यू = कुल चार्ज प्रत्येक स्पाइक के तहत पता चला, n = redox प्रतिक्रिया में स्थानांतरित इलेक्ट्रॉनों की संख्या (n = 2 catecholamines के लिए), और फैराडे ´ s स्थिरांक F = 96485 C/
  5. प्रत्येक कक्ष के लिए प्रति ईवेंट के औसत शुल्क का परिकलन करते हुए पहले एकत्र किए गए डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण निष्पादित करें. फिर कक्षों के बीच प्रसरण के लिए, कक्षों के बीच औसत शुल्क परिकलित करें और असमान प्रसरण संभालने वाले कक्षों के बीच विद्यार्थी के t-परीक्षण का उपयोग करे. इस अध्ययन सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए MATLAB कार्यक्रम का इस्तेमाल किया ।

5. पुटिका आकार विश्लेषण के लिए उनि इमेजिंग

  1. अलग आसमाटिक शर्तों पर कोशिकाओं के उनि इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, पहले कोशिकाओं के रासायनिक निर्धारण से पहले एक 5% सह2 वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए isotonic या hypertonic बफर में कोशिकाओं की मशीन ।
  2. Karnovsky निर्धारण पद्धति का उपयोग करते हुए कक्ष निर्धारण को29करें । इस विधि का प्रयोग, ०.०१% सोडियम azide, 1% formaldehyde, और १.२५% glutaraldehyde जिसमें नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है युक्त समाधान के साथ की मशीन ।
  3. निर्धारण के बाद, ०.१५ मीटर सोडियम cacodylate बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  4. सेल नमूने पोस्ट निर्धारण दाग, और उनि इमेजिंग के लिए तैयारी में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक 1% आज़मियम tetroxide समाधान के साथ कोशिकाओं को गर्मी, अंधेरे में कमरे के तापमान पर ०.५% uranyl एसीटेट समाधान में 1 ज मशीन के बाद ।
  5. एक अंतिम निर्धारण कदम में, १००% इथेनॉल में कोशिकाओं को धोने और फिर एसीटोन के साथ कोशिकाओं कुल्ला द्वारा पहली कोशिकाओं निर्जलीकरण ।
  6. epoxyresin में सेल नमूने एंबेड और उसके बाद 30-40 मिनट के लिए ४,००० x g पर केंद्रापसारक प्रदर्शन और ४० डिग्री सेल्सियस पर polymerize के लिए सेल के नमूने की अनुमति 15 एच के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर ४८ एच मशीन द्वारा पीछा किया ।
  7. इमेजिंग के लिए तैयार करने में, अनुभाग कक्ष नमूना ६० एक ultramicrotome का उपयोग कर एनएम की मोटाई के साथ स्लाइस में १०० राल में एंबेडेड ।
  8. एक 4% uranyl एसीटेट/25% इथेनॉल समाधान के लिए 4 मिनट के बाद पानी के साथ धोने के 20 एस के लिए कोशिकाओं के अधीन । 3 मिनट के लिए रेनॉल्ड्स लीड साइट्रेट के साथ कोशिकाओं को धोने, पानी के साथ धोने के 20 एस द्वारा पीछा किया ।
  9. सेल नमूनों के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रदर्शन । हमारे प्रयोगों में, हमने एक पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया है जो १२० केवी में संचालित किया गया है ।
  10. सेल कोशिका द्रव्य में बुलबुले की आबादी को प्रदर्शित करता है कि एक सेल अनुभाग के प्रत्येक दर्ज की छवि से, पहले प्रत्येक उनि छवि में दर्ज पैमाने पर बार के लिए पिक्सल से संबंधित द्वारा छवि पिक्सेल आकार जांचना । isotonic या hypertonic शर्तों को उजागर कक्षों की प्रत्येक छवि पर पुटिका आकारों का निर्धारण करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । हमारे प्रयोगों में, हम छवि विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर ImageJ का इस्तेमाल किया । यह ध्यान देने योग्य है कि कोशिकाओं के उनि छवियों से सेलुलर ultrastructure की छवि विश्लेषण के लिए, कोशिका वर्गों की मोटाई के आधार पर इन माप के आकार समायोजन की जरूरत पर विचार किया जा करने के लिए और पहले Almers ´ एस लैब द्वारा बताए गए हैं कि30।

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Representative Results

हम यहां कैसे दो विद्युत के तरीके, कार्बन फाइबर amperometry और intracellular विद्युत cytometry के साथ एक साथ मेल उनि इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, जानकारी है कि लाभ के प्रभाव के लिए एक व्यापक दृश्य alluding प्रदान कर सकते है स्रावी बुलबुले और exocytosis प्रक्रिया पर extracellular आसमाटिक दबाव । एक chromaffin प्रयोगात्मक सेट अप का उपयोग कर कोशिकाओं पर exocytosis रिहाई के प्रतिनिधि amperometric रिकॉर्डिंग की तुलना करके ( चित्रा 1में दिखाया गया है), exocytotic गतिविधि में एक महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित किया गया था जब कोशिकाओं आसमाटिक के संपर्क में थे तनाव isotonic स्थितियों में कोशिकाओं की तुलना में (चित्रा 2a)24. इन रिकॉर्डिंग से और फैराडे ´ एस कानून का उपयोग करके, कुल चार्ज प्रत्येक व्यक्ति amperometric वर्तमान स्पाइक से पता चला कि विभिंन exocytosis को उजागर कोशिकाओं पर एकल पुटिका आसमाटिक घटनाओं से निष्कासित अणुओं की संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था स्थितियों. तुलना करके, के रूप में औसत amperometric वर्तमान स्पाइक hypertonic समाधान में कोशिकाओं द्वारा पता लगाया के छोटे क्षेत्र से चित्र बी में प्रदर्शित, कम न्यूरोट्रांसमीटर अणुओं आसमाटिक तनाव संवेदन कोशिकाओं द्वारा प्रत्येक पुटिका से जारी किए गए24 .

जारी न्यूरोट्रांसमीटर अणुओं की संख्या में इस गिरावट का reversibility निर्धारित करने के लिए, हम एक hypertonic वातावरण को उजागर कोशिकाओं पर exocytosis की amperometric रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया और, बाद में, कोशिकाओं पर एक isotonic में वापस रखा के बाद पर्यावरण. इन प्रयोगों में, chromaffin कोशिकाओं BaCl2 समाधान के साथ लगातार तीन बार उत्तेजित किया गया: एक isotonic बफर में पहले, कोशिकाओं के बाद एक दूसरे उत्तेजना के बाद एक hypertonic समाधान में 10 मिनट के लिए मशीन थे और अंत में, एक तिहाई isotonic स्थितियों में 10 मिनट सेल मशीन के बाद उत्तेजना । परिणाम के रूप में चित्रा 3 ए है कि जारी न्यूरोट्रांसमीटर की मात्रा ~ ५०% से कम किया गया था जब कोशिकाओं hypertonic हालत के लिए पहले बा2 + isotonic हालत में उत्तेजना की तुलना में दिखाया गया था में प्रदर्शित । बाद में, जब कोशिकाओं को वापस एक isotonic वातावरण में लाया गया और एक तिहाई बीए के अधीन2 + उत्तेजना, मात्रा न्यूरोट्रांसमीटर exocytosis घटना के प्रति जारी वापस मूल पहली उत्तेजना में दर्ज की गई राशि के लिए उलट गया था, जो पिछले टिप्पणियों की पुष्टि की14। तीन सफलता बीए के साथ नियंत्रण प्रयोग2 + isotonic हालत में कोशिकाओं की उत्तेजना ( चित्र 3 बी) दिखाने के लिए कि एकाधिक अनुक्रमिक बीए2 + उत्तेजना isotonic स्थितियों में बदल नहीं किया मात्रा न्यूरोट्रांसमीटर exocytosis के दौरान जारी । यह पता चलता है कि पुटिका quantal आकार जल्दी और reversibly extracellular osmolarity के साथ समायोजित है ।

हालांकि, जब exocytosis गतिविधि के संदर्भ में इन प्रयोगों से amperometric निशान का विश्लेषण, यह स्पष्ट हो गया, जैसा कि चित्रा 4aमें प्रदर्शित, कि exocytosis गतिविधि काफी बाधा जब कोशिकाओं hypertonic तनाव को उजागर किया गया था । आसमाटिक तनाव के दौरान, exocytosis घटनाओं isotonic हालत में कोशिकाओं पर गतिविधि के 12% करने के लिए कम किया गया । बाद में, आसमाटिक सदमे और कोशिकाओं को वापस एक isosmotic वातावरण में रखा गया था के बाद, कोशिकाओं को अपने मूल exocytosis गतिविधि के ४१% पुनः प्राप्त । दिलचस्प है, नियंत्रण isotonic स्थितियों में प्रदर्शन प्रयोगों दिखाया, जैसा कि चित्रा 4Bमें प्रदर्शित, कि लगातार तीन BaCl2 उत्तेजना प्रदर्शन के बाद, exocytosis घटनाओं की आवृत्ति एक दूसरे उत्तेजना के बाद ५३% से कम हो गया था और आगे तीसरे उत्तेजना के पहले उत्तेजना की तुलना में 26% के लिए नीचे । इसलिए, यह स्पष्ट है कि लगातार बा2 + उत्तेजना प्रत्येक पुटिका से जारी न्यूरोट्रांसमीटर की संख्या को प्रभावित करने के लिए प्रतीत नहीं होता है जब exocytosis ट्रिगर किया गया है, लेकिन काफी पुटिका रिहाई की प्रक्रिया की क्षमता को प्रभावित.

जांच करने के लिए कैसे अपने पैतृक वातावरण में स्रावी बुलबुले पुटिका मात्रा या quantal आकार के मामले में extracellular आसमाटिक तनाव से प्रभावित कर रहे हैं, पुटिका आकार उनि इमेजिंग का उपयोग विश्लेषण कोशिकाओं में intracellular विद्युत cytometry के साथ संयुक्त था isotonic और hypertonic स्थितियों से अवगत कराया । intracellular विद्युत cytometry प्रयोगों में, एक कार्बन फाइबर nanotip इलेक्ट्रोड कोशिका द्रव्य और chromaffin समाधान में रखा जब लाइव isotonic कोशिकाओं के hypertonic में डाला गया था (जैसा कि चित्रा5 में दिखाया गया.) परिणामस्वरूप amperometric वर्तमान स्पाइक सेल कोशिका द्रव्य टकराने, adsorbing, और stochastically rupturing में प्रत्येक पुटिका की निगरानी की गई और 26 को फोड़ने पर पुटिका इलेक्ट्रोड की सतह पर amperometric सामग्री जारी कर रहा है । वर्तमान बनाम समय ट्रेस में प्रत्येक चोटी के लिए पाया एकीकृत कुल शुल्क फैराडे ´ एस कानून द्वारा प्रत्येक सेल रिकॉर्डिंग में औसत पुटिका quantal आकार की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था. ये intracellular विद्युत cytometry माप, चित्रा 6 और चित्रा 7Bमें दिखाया गया है कि पुटिका तनाव को उजागर कोशिकाओं में quantal आसमाटिक आकार isotonic स्थितियों में कोशिकाओं पर की तुलना में काफी कम थे कि प्रदर्शन किया । intracellular विद्युत cytometry द्वारा मापा के रूप में पुटिका quantal आकार में परिवर्तन की भयावहता की तुलना, न्यूरोट्रांसमीटर exocytosis extracellular तनाव का अनुभव कोशिकाओं पर आसमाटिक के दौरान जारी की मात्रा में आंशिक गिरावट के लिए , दोनों quantal आकार में ६०% की एक रिश्तेदार कमी दिखाई दी और मात्रा न्यूरोट्रांसमीटर isotonic स्थितियों में कोशिकाओं पर की तुलना में जारी (चित्रा 7)24. पुटिका quantal आकार में समायोजन आसमाटिक दबाव का अनुभव कोशिकाओं के पुटिका न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता में एक संभावित भिन्नता के लिए संबंधित करने के लिए, उनि छवि विश्लेषण पुटिका और isotonic को उजागर कोशिकाओं के hypertonic आकार का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन किया गया था स्थितियों. इसके अलावा, LDCVs के अंदर घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स का गहरा धुंधला है कि एक गहरी झिल्ली में एक अंधेरे क्षेत्र के रूप में उनि छवियों में कल्पना की है बुलबुले बंधे इन बुलबुले में घने कोर मैट्रिक्स की मात्रा को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 8में प्रस्तुत के रूप में, पुटिका आकार isotonic स्थितियों में कोशिकाओं की तुलना में extracellular आसमाटिक तनाव को उजागर कोशिकाओं पर ६०% से कम हो गया था. LDCV और घने कोर के मापा व्यास की गणना की मात्रा से, आसपास के हेलो समाधान है कि उनि छवियों में LDCVs के अंदर एक स्पष्ट समाधान के रूप में प्रकट होता है की मात्रा भी गणना की गई थी । उनि छवि विश्लेषण से संक्षेप परिणाम दिखाया, के रूप में चित्र 8में प्रदर्शित, कि extracellular आसमाटिक सदमे के दौरान यह मुख्य रूप से LDCVs है कि24कम है में हेलो समाधान की मात्रा है ।

Figure 1
चित्र 1 : सिंगल सेल exocytosis amperometry. प्रयोगात्मक की एक योजनाबद्ध एक chromaffin कोशिकाओं पर exocytosis के amperometric माप के लिए सेट अप24। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: exocytosis माप से Amperometric निशान ।  (क) isotonic (काले रंग) में और hypertonic (लाल रंग) extracellular वातावरण में chromaffin कोशिकाओं पर exocytosis की एक प्रतिनिधि amperometric रिकॉर्डिंग. (ख) isotonic (काला) और hypertonic (लाल) extracellular वातावरण24में chromaffin कोशिकाओं के exocytosis माप से एक औसत amperometric स्पाइक की वृद्धि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : आसमाटिक झटके के बाद exocytosis पर जारी catecholamines की संख्या का reversibility । (क) chromaffin कोशिकाओं से exocytosis के दौरान जारी अणुओं की संख्या (n = 4) द्वारा लगातार तीन बीए2 + उत्तेजना, isotonic में पहली उत्तेजना के साथ, hypertonic में दूसरा, और isotonic बफर में तीसरे । ख़राब टी-टेस्ट के सांख्यिकीय परिणाम दिखाए गए हैं. पहले बा2 + उत्तेजना (ba2 + stim 1) की तुलना के लिए पी-मान दूसरी बा के साथ isotonic बफर में2 + उत्तेजना (Ba2 + stim 2) hypertonic बफर में पी= ०.१०८८ है और पी-मूल्य के लिए दूसरी बा की तुलना2 + hypertonic समाधान में उत्तेजना तीसरी बा2 + उत्तेजना (ba2 + stim 3) के साथ isotonic बफर में पी = 0.059 है. (ख) नियंत्रण प्रयोग न्यूरोट्रांसमीटर के तीन लगातार बीए में जारी अणुओं की राशि का प्रदर्शन2 + chromaffin कोशिकाओं की उत्तेजना (n = 4) isotonic बफर में. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : exocytosis गतिविधि पर आसमाटिक दबाव का प्रभाव । (क) exocytosis गतिविधि पर extracellular osmolarity के प्रभाव exocytosis घटनाओं की आवृत्ति के रूप में प्रस्तुत किया जाता है जब chromaffin कोशिकाओं (n = 4) बेरियम में isotonic समाधान के साथ उत्तेजित कर रहे हैं, तो hypertonic, और अंत में isotonic स्थितियों में । मान प्रत्येक कक्ष से spikes की औसत संख्या के रूप में प्रस्तुत कर रहे है और सभी कोशिकाओं से औसत नमूना (मतलब (SEM) की मानक त्रुटि) । परिवर्तन के सांख्यिकीय महत्व एक टी ख़राब डेटा के लिए परीक्षण का उपयोग कर प्रस्तुत किया जाता है ( पी-isotonic बीए के लिए मूल्य2 + उत्तेजना 1 और hypertonic ba2 + उत्तेजना 2 पी= ०.०१२६ और पीकी तुलना के लिए मूल्य है hypertonic बा२ + उत्तेजना २ र isotonic बा२ + उत्तेजना ३ पृ= ०.०३७) । (ख) नियंत्रण प्रयोग isotonic स्थितियों में chromaffin कोशिकाओं (n = 4) पर लगातार तीन बेरियम उत्तेजना के बाद exocytosis घटनाओं की आवृत्ति पेश. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : Intracellular पुटिका विद्युत cytometry में परिवर्तन की निगरानी के लिए पुटिका quantal आकार. (क) प्रयोगात्मक स्थापित की एक योजनाबद्ध intracellular विद्युत cytometry के लिए इस्तेमाल किया । (ख) एक ठेठ nanotip शंकु कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड24की एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : Intracellular विद्युत cytometry माप दिखा (क) isotonic (काला) और hypertonic (लाल) extracellular वातावरण में chromaffin कोशिकाओं पर intracellular amperometric cytometry रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि अंश. (ख) isotonic में chromaffin कोशिकाओं पर intracellular cytometry माप से एक औसत amperometric स्पाइक की वृद्धि (काला) और hypertonic (लाल) extracellular वातावरण24. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : exocytosis और पुटिका quantal आकार के निर्धारण पर जारी catecholamines की संख्या का ठहराव. (A) isotonic (n = 22) और hypertonic (n = 20) वातावरण में chromaffin कक्षों पर exocytosis रिकॉर्डिंग के दौरान जारी किए गए अणुओं की औसत संख्या । मूल्यों प्रत्येक कोशिका से exocytosis घटना प्रति जारी अणुओं की एक औसत संख्या के रूप में प्रस्तुत कर रहे है और कोशिकाओं से औसत नमूना (± SEM) । परिवर्तन के सांख्यिकीय महत्व के लिए टी-परीक्षण का उपयोग कर प्रस्तुत कर रहे है ख़राब डेटा (p-value = 0.0003) (B) cytometry में chromaffin कोशिकाओं पर intracellular विद्युत isotonic द्वारा पता लगाया के रूप में पुटिका प्रति अणुओं की औसत संख्या (n = 19) और hypertonic (n = 16) शर्तें । मान प्रति स्पाइक अणुओं की औसत संख्या के रूप में प्रत्येक कोशिका से पता लगाया और सभी कोशिकाओं से औसत नमूना (± SEM) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । परिवर्तन का सांख्यिकीय महत्व (पी- मान = 0.0108)24ख़राब डेटा के लिए टी-टेस्ट का उपयोग कर प्रस्तुत किया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : बड़े घने कोर पुटिका आकार पर आसमाटिक दबाव का प्रभाव । LDCVs की गणना की मात्रा, घने कोर प्रोटीन और हेलो घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स आसपास के समाधान attolitres (aL) में isotonic में chromaffin कोशिकाओं के उनि छवियों की छवि विश्लेषण से गणना की गई (n = 12) और hypertonic (n = 9) बफ़र्स । परिणाम सेल प्रति ३११ बुलबुले के एक औसत से एकत्र किए गए थे और एकल कोशिकाओं (± SEM) से औसत । isotonic और hypertonic बफ़र्स की तुलना न किए गए t-परीक्षण से p-मान रिपोर्ट की जाती हैं । P-मान है ०.०३८५ (*) के लिए पुटिका वॉल्यूम, ०.३९६७ घने कोर वॉल्यूम के लिए, ०.००४७ (* *) हेलो वॉल्यूम24के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम यहां एक प्रोटोकॉल और तीन पूरक विश्लेषणात्मक तरीकों के संयोजन के लाभ स्रावी बुलबुले और exocytosis प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए कैसे एक शारीरिक बल जैसे आसमाटिक दबाव स्रावी बुलबुले को प्रभावित कर सकते है की एक बेहतर समझ हासिल वर्तमान और स्रावी कोशिकाओं में exocytosis प्रक्रिया । इन तरीकों में शामिल कार्बन फाइबर microelectrode amperometry, जो exocytosis गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए एक स्थापित विधि है, intracellular विद्युत cytometry, जो उनके देशी वातावरण में बुलबुले के quantal आकार का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और स्रावी पुटिका वॉल्यूम पर नजर रखने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेज एनालिसिस । इस काम में, एक isotonic और एक hypertonic extracellular वातावरण को उजागर chromaffin कोशिकाओं पर एकल पुटिका exocytosis घटनाओं की amperometry रिकॉर्डिंग से मात्रात्मक डेटा इकट्ठा करके, हम पुष्टि की है कि आसमाटिक सदमे काफी कम कर देता है exocytosis के दौरान जारी की मात्रा न्यूरोट्रांसमीटर और है कि इन कोशिकाओं reversibly पुनर्प्राप्त और मूल मात्रा जारी कर सकते हैं, अगर एक isotonic वातावरण (चित्रा 3) में वापस रखा.

amperometric रिकॉर्डिंग समय बनाम exocytosis घटनाओं की आवृत्ति की जानकारी प्रदान की है और इसलिए भी अलग आसमाटिक वातावरण में कोशिकाओं पर exocytosis गतिविधि में परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस डेटा की व्याख्या की जा सकती है और विचार किया जा सकता है कि गतिविधि में परिवर्तन तुरंत हो या समय के एक समारोह के रूप में । जैसा कि हम पिछले काम में दिखाया गया है, हालांकि आसमाटिक तनाव exocytotic गतिविधि में बाधा, यह नहीं लगता था कि24बुलबुले के आसानी से पट्टे पर लेने वाले पूल के संलयन में बाधा । exocytosis गतिविधि डेटा भी रिकॉर्डिंग समय की अवधि के दौरान कुल exocytotic गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां हम दो अलग आसमाटिक शर्तों को उजागर chromaffin कोशिकाओं पर exocytosis की एक 3 मिनट की रिकॉर्डिंग से exocytosis घटनाओं की संचित संख्या प्रस्तुत करते हैं । इन आंकड़ों आसमाटिक तनाव का अनुभव कोशिकाओं के exocytosis गतिविधि में एक अवरोध दिखाने के लिए और है कि इस गतिविधि की एक आंशिक वसूली एक extracellular isotonic वातावरण के लिए वापस कोशिकाओं के बाद प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि, बहुत महत्वपूर्ण बात, नियंत्रण प्रयोगों से पता चला कि कई Ba2 + समय सीमा के भीतर उत्तेजना इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया हर बार एक सेल स्राव को उत्तेजित किया गया था द्वारा exocytosis गतिविधि में एक महत्वपूर्ण कमी का कारण बना. तीसरी लगातार Ba2 + उत्तेजना से, केवल exocytosis गतिविधि का एक तिहाई बनाए रखा गया था, और स्पष्ट रूप से बेरियम, और शायद यह भी इन प्रयोगों में उत्तेजना के समय, पुटिका चक्र को प्रभावित कर रहा था. यह क्यों exocytotic गतिविधि आसमाटिक सदमे के बाद isotonic समाधान में रखा कोशिकाओं में बरामद किया गया था और क्यों इन कोशिकाओं isotonic स्थितियों में तीन के बाद कोशिकाओं की तुलना में गतिविधि में एक समान सापेक्ष कमी प्रदर्शित समझाने के लिए प्रासंगिक हो सकता है अनुक्रमिक बा२ + उत्तेजना. इसलिए, exocytosis के amperometry रिकॉर्डिंग पल बुलबुले प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज ट्रिगर कर रहे हैं से स्रावी बुलबुले के बारे में जानकारी प्रदान करता है, फ्यूजन ताकना के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर जारी. इस प्रकार एकल पुटिका न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई और exocytosis गतिविधि पर जानकारी पर मात्रात्मक डेटा एकत्र किया जा सकता है.

न्यूरोट्रांसमीटर जारी की मात्रा exocytosis की विधा है कि शुरू हो रहा है द्वारा विनियमित किया जा सकता है, जहां या तो पूर्ण पुटिका सामग्री या सामग्री का हिस्सा जारी किया है. केवल एक पुटिका से निष्कासित कर दिया है कि पता लगाता है कि कार्बन फाइबर amperometry का उपयोग कर exocytosis रिलीज का केवल अध्ययन करके, यह अलग करने के लिए मुश्किल है अगर न्यूरोट्रांसमीटर का पता लगाया मात्रा में परिवर्तन जारी मोड में एक बदलाव से संबंधित है exocytosis, सेलुलर पुटिका सामग्री रिलीज को प्रभावित करने वाले भौतिक गुणों में परिवर्तन, या पुटिका quantal आकार में परिवर्तन करने के लिए । इसलिए, intracellular विद्युत cytometry का उपयोग माप के साथ exocytosis के amperometric रिकॉर्डिंग के पूरक द्वारा, जीवित कोशिकाओं पर पुटिका quantal आकार के सीटू माप में और इसलिए की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है exocytosis के दौरान बुलबुले से पुटिका सामग्री रिहाई के अंश26।

इस काम में, यदि पुटिका quantal आकार आसमाटिक तनाव से प्रभावित था की जांच करने के लिए, हम ठहराव और पुटिका और quantal स्थितियों के संपर्क में कोशिकाओं पर isotonic hypertonic आकार के मूल्यांकन के लिए इस तकनीक को लागू किया । एक जीवित कोशिका के कोशिका द्रव्य में nanotip इलेक्ट्रोड के सम्मिलन के रूप में बल्कि आक्रामक माना जाता है, इन प्रयोगों केवल सेल प्रति एक बार प्रदर्शन किया गया और एक ही सेल में दोहराया नहीं थे. इसलिए, ये प्रयोग एक isotonic और एक hypertonic extracellular वातावरण में उजागर बेतरतीब ढंग से चयनित कोशिकाओं के समूहों से व्यक्तिगत माप के रूप में तरजीही रूप से किया जाता है । पुटिका quantal आकार में परिवर्तन की तुलना के रूप में intracellular विद्युत cytometry द्वारा मापा मात्रा exocytosis में जारी न्यूरोट्रांसमीटर में फेरबदल करने के लिए, एक intracellular रिकॉर्डिंग की प्रयोगात्मक शर्तों के मिलान पर विचार करना चाहिए और इसके अलावा अलग यादृच्छिक कोशिकाओं पर exocytosis की amperometry रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करते हैं । यदि अध्ययन एक ही सेल पर किया जाता है, यह इन प्रायोगिक प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण है के लिए भी लगातार BaCl2 उत्तेजना के प्रभाव पर विचार, और प्रयोगात्मक शर्तों intracellular cytometry के लिए इस्तेमाल किया उन मैच सुनिश्चित माप. यह भी ध्यान देने योग्य है कि यह सही स्थान और इलेक्ट्रोड की गहराई को नियंत्रित करने के लिए जब एक सेल में डाला जाता है मुश्किल है लायक है । इस प्रकार, प्रत्येक कोशिका पुटिका quantal आकार विश्लेषण के लिए एक यादृच्छिक नमूना प्रदान करता है । इसके अलावा, इस विधि का उपयोग पुटिका quantal आकार की जांच में मतभेद अंतर नहीं है, उदाहरण के लिए, पुटिका परिपक्वता और इसलिए भी माप के लिए भिन्नता जोड़ सकते हैं. Intracellular प्रयोगों से पता चला कि पुटिका quantal आकार extracellular आसमाटिक दबाव के संपर्क में कोशिकाओं पर कम किया गया था । इस विधि द्वारा पाया quantal आकार में सापेक्ष कमी exocytosis के दौरान न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में सापेक्ष परिवर्तन की टिप्पणियों की तुलना में किया गया था. इस अध्ययन में पाया गया कि quantal आकार में सापेक्ष गिरावट आसमाटिक तनाव संवेदन कोशिकाओं पर न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में ड्रॉप के रूप में एक ही क्रम पर था.

यदि आसमाटिक तनाव पुटिका न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता में फेरबदल किया गया था सत्यापित करने के लिए, पुटिका मात्रा isotonic और hypertonic शर्तों को उजागर किया गया था कि रासायनिक तय chromaffin कोशिकाओं के लिए उनि इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. उनि इमेजिंग विश्लेषण से पता चला कि बुलबुले हटना जब कोशिकाओं को एक आसमाटिक सदमे से अवगत करा रहे हैं और आकार में सापेक्ष कमी एक साथ पुटिका quantal आकार के साथ एक निरंतर न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता को बनाए रखने के लिए समायोजित किया जाता है24. जो नैनोमीटर छवि संकल्प प्रदान करता है उनि छवि विश्लेषण, दो चरणों भेद कर सकते हैं, घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स और आसपास के हेलो समाधान LDCVs अंदर, और इस तरह यह घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए संभव बनाता है और हेलो समाधान की मात्रा की गणना । इस विश्लेषण से, पुटिका मात्रा में गिरावट के लिए मुख्य रूप से घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स24आसपास के हेलो समाधान से एक कम मात्रा से संबंधित होना निर्धारित किया गया था ।

संक्षेप में, इस अध्ययन के एक कैसे तीन विश्लेषणात्मक तरीके संयुक्त है प्रदर्शन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, और न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई से पहले स्रावी बुलबुले के लक्षण वर्णन और क्या इन बुलबुले से जारी कर रहे हैं जब कोशिकाओं को ट्रिगर कर रहे हैं की अनुमति देता है exocytosis, कैसे स्रावी बुलबुले और exocytosis की तरह कोशिका कार्यों extracellular तनाव से प्रभावित है की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए । इस प्रोटोकॉल भी कैसे exocytosis और पुटिका quantal आकार पर न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज पर सवालों के जवाब में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है भौतिक वातावरण में अन्य परिवर्तन या संभावित दवाओं है कि स्रावी कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं द्वारा प्रभावित है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों के लिए धन और Dalsjöfors Kött अटल बिहारी (Dalsjöfors, स्वीडन) गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों के दान के लिए स्वीडिश अनुसंधान परिषद (349-2007-8680) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

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References

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३२ Chromaffin कोशिकाओं आसमाटिक दबाव घने कोर बुलबुले न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता quantal आकार exocytosis amperometry intracellular cytometry संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
स्रावी बुलबुले और Exocytosis पर आसमाटिक तनाव के प्रभाव की निगरानी
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Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. S. Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis. J. Vis. Exp. (132), e56537, doi:10.3791/56537 (2018).

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