Summary
本文提出了一种通过鼓膜入耳蜗进行药物局部化管理的技术。通过这条途径运送药物不会影响化疗药物如顺铂的抗癌功效。
Abstract
保护剂治疗药物性耳毒性的系统管理受到限制, 因为这些保护剂可能会干扰初级药物的化疗效果。这种情况尤其适用于药物顺铂, 其抗癌作用因抗氧化剂而减弱, 为听力丧失提供了足够的保护。其他当前或潜在的 otoprotective 代理可能会造成类似的问题, 如果系统管理。将各种生物制品或保护剂直接应用于耳蜗, 可以使这些药物的高水平在局部具有有限的系统性副作用。在本报告中, 我们展示了一种跨鼓膜的方法, 提供各种药物或生物试剂的耳蜗, 这应该加强对耳蜗的基础科学研究, 并提供一个简单的方法指导使用 otoprotective 剂在诊所。本报告详细介绍了一种跨鼓膜药物传递方法, 并举例说明了该技术如何成功地应用于实验动物治疗顺铂耳毒性。
Introduction
外周听觉系统非常敏感的药物, 如顺铂和氨基糖苷类抗生素。顺铂是一种广泛使用的化疗剂, 用于治疗各种实体肿瘤, 如卵巢, 睾丸, 头颈癌。使用这种药物的耳毒性是剂量限制和相当常见的, 影响75-100% 的患者治疗1。其他药物, 如卡铂和奥沙利铂, 已成为替代顺铂2,3,4,5, 但它们的用处仅限于少数癌症。
早期研究表明活性氧 (ROS) 对顺铂和氨基糖苷类产生的耳毒性有重要作用。随后的研究表明, NOX3 异构体氧化酶是耳蜗中 ROS 的主要来源, 并由顺铂6,7激活。ROS 的产生危及细胞的抗氧化缓冲能力, 导致细胞膜脂质过氧化增加8。此外, 顺铂增加了羟基自由基产生剧毒醛 4-hydroxynonenal (4-他), 一个引发细胞死亡9,10。根据这些发现, 对治疗顺铂耳毒性的几种抗氧化剂进行了研究。这些包括 n-乙酰半胱氨酸 (NAC), 硫代硫酸钠 (STS), 汀和 d-蛋氨酸。然而, 抗氧化剂治疗的一个主要关注是, 这些抗氧化剂可以降低顺铂化疗的功效时, 系统地管理11通过与硫醇组的相互作用的抗氧化剂分子。
鉴于这些问题的抗氧化剂治疗, 本研究的目的是检查传递抗氧化剂和其他药物的耳蜗, 以减少听力损失的跨鼓膜路线。下面描述的药物和短干涉 (si) RNA 的跨鼓膜路线似乎特别有希望。
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Protocol
雄性大鼠是按照国家卫生研究院的动物使用指南和由南伊利诺伊大学医学院实验室动物护理和使用委员会批准的协议处理的。在药物管理局麻醉前和72小时后, 对大鼠进行听觉脑干反应 (ABR) 检查, 以验证其对鼓膜药物传递的影响。
1. 听觉脑干反应 (ABR)
注意:通过听觉测试设备和软件采集 ABR 测量结果。ABR 代表诱发电位或高频波产生的第八颅神经 (波 I 和 II) 和其他高听觉脑干结构, 包括 anteroventral 耳蜗核 (波 III), 侧 lemniscus (波 IV), 和下位丘 (波浪 V)。这些波浪根据延迟被区分。ABR 测量是按照前面描述的12进行的。
- 麻醉大鼠, 混合90毫克/千克氯胺酮和17毫克/千克甲苯噻嗪通过腹腔注射。确认麻醉深度通过脚趾捏反射。对眼睛进行眼部润滑 (或矿物油滴), 防止眼部干燥, 避免麻醉时出现溃疡。
- 把老鼠放在有控制的隔音亭内的加热垫 (37 °c) 的俯卧位置上。听力测试设备位于展台的外面和旁边。
- 相应地插入不锈钢电极: 在后侧面的接地电极, 两个耳朵之间的正电极, 直接顶部的头骨, 和负电极在每耳耳廓下。
- 在8、16和32赫上应用高频传感器作为5毫秒音爆发的声学刺激。确定刺激强度作为分贝声压水平 (dB SPL)。这开始在10分贝的 spl 和达到90分贝的 spl 与 10 db 的步骤大小。使用脉冲精密声电平计, 将声音强度校准为最大输出90分贝的 SPL。
注意:实验结果显示了周围听觉器官、耳蜗和上述听觉结构的完整性。波形是在15毫秒的刺激输入中产生的, 而波的潜伏期取决于传导时间, 这反过来又受到三个关键因素的调节: 大脑体积、强度和声音频率。利用制造商提供的软件记录听觉诱发电位。 - 考虑最小强度, 可以唤起两个不同的波形 (II 和 III) 的0.5 µV 振幅作为阈值突出。
注意:阈值移位表示治疗后的阈值与治疗前获得的阈值的差异。
2. 反式鼓膜注射
- 对药物进行 tympanically, 将大鼠置于左侧褥疮位置。
- 将2.5 毫米的一次性耳镜面插入耳道。
- 使用手术范围, 定位镜面, 使鼓膜可见。
- 使用29克 X ½, 0.5 毫升胰岛素注射器, 绘制50µL 的 [r] n-苯基异丙腺苷 (r-PIA) 溶液 (1 µM), 8-环戊基-13-dipropylxanthine (DPCPX) 溶液 (3 µM), 或 siRNA 溶液 (0.9 µg) 注入 (5 单位)。
- 使用镜面引导针到鼓膜的前下位区。
- 用针在膜上戳一个洞, 并管理1.2.3 中提到的药物。允许老鼠在这个位置休息15分钟。
注意: 50 µL 应该是足够的体积, 以适应鼓膜后。用药后, 耳道不应有液体。 - 将大鼠置于右侧压位位置, 并重复步骤1.2.1 通过 1.2.5, 以供另一耳管理。
- 对于接受顺铂腹腔的大鼠, 在37摄氏度的加热垫上放置大鼠仰卧位。
- 使用21克 X 3/4 蝶形针 (12 英寸长油管), 在无菌磷酸盐缓冲盐水中绘制顺铂 (11 毫克/千克, 1 毫克/毫升溶液)。
- 使用注射器泵, 管理顺铂 (1 毫克/毫升)通过腹腔注射30分钟以上。
注意:对于一个250克大鼠, 体积将是2.75 毫升的速度约0.1 毫升每分钟。
- 在这些程序中继续监测麻醉深度。一旦顺铂管理完成, 把老鼠放回笼子里的俯卧位置, 确保没有任何阻碍它的呼吸。
- 监视老鼠直到完全恢复。
3. 耳蜗解剖和脱钙
- 继最后 ABR (72 小时后), 麻醉大鼠与90毫克/千克氯胺酮的混合物和17毫克/千克甲苯噻嗪通过腹腔注射。用脚趾捏的反射来确认麻醉。弄死老鼠的通过斩首。
- 解剖出的颞骨, 如前所述13。
- 在一个7毫升的玻璃闪烁瓶 (完全覆盖耳蜗) 的 1x PBS 溶液中放置耳蜗4% 多聚甲醛。隔夜冷藏4摄氏度。在室温下取出多聚甲醛并用 1x PBS 清洗。
- 去除 PBS, 完全用120毫米 EDTA 溶液 (pH 7.3) 填满管子。在室温下放置在转子上, 允许脱钙2至3周, 每天更换 EDTA 溶液。
4. Cryosectioning
- 在完成脱钙后, 完全浸入以下溶液中的耳蜗 (每7毫升) 24 小时4摄氏度: 10% 蔗糖, 20% 蔗糖, 1:1 混合物20% 蔗糖和最佳切削温度 (OCT) 嵌入化合物。
- 在15毫米 x 15 毫米 x 5 毫米一次性嵌入模具中, 将新鲜的 OCT 填充并完全覆盖耳蜗。将耳蜗定向到其侧面, 使其与嵌入模具的底部平行, 如 Whitlon et所述。14
- 立即将模具放在干冰上固化 OCT, 并在一夜之间存放在-80 摄氏度。
- 0.01% 聚 l-赖氨酸在室温下浸泡30分钟. 取出幻灯片, 不冲洗, 并允许夜间干燥。将这些幻灯片用于 cryosections。
- 将 OCT 中的耳蜗从-80 摄氏度冷藏库中取出, 放在干冰上。使用锋利的切片刀片 (L x W:80 毫米 x 8 毫米, 厚度0.25 毫米, 切削角度34°), 部分 OCT 块在10µm 使用恒温器在-30 °c。每张幻灯片放置两个部分。
- 完成后, 将幻灯片冷藏4摄氏度。
5. 免疫组化
- 将幻灯片放在幻灯片架上的玻璃显微镜滑动染色盘中。用350毫升的 1x PBS 填充这道菜, 在室温下将幻灯片冲洗5分钟三次。
- 将幻灯片从盘子中取出, 用干擦拭的方法将组织周围的区域晾干, 确保不使组织干燥。
- 使用液体阻断笔, 在组织切片周围画一个圆圈。
- 在室温下, 在 1x PBS 中加入150µL, 其中含有10% 正常 (驴) 血清、1% 非离子洗涤剂和 1% BSA, 以1小时的温度阻断组织。
- 在 1x PBS 中, 用150µL 10% 正常 (驴) 血清、0.1% 非离子洗涤剂和主要抗体 (见下文注), 在4摄氏度的湿润室中, 利用多余的阻断溶液, 在一夜之间孵化组织。
注意:对于下列抗体, 使用了这些稀释: 对于图 2和3, p-STAT1 系列727 1:300。对于图 4, p-STAT1 系列727、1:100 和 TRPV1 1:100。 - 将幻灯片放在幻灯片架上的玻璃显微镜滑动染色盘中。用350毫升的 1x PBS 填充盘子, 在室温下清洗5分钟三倍的幻灯片。
- 在一个含有0.01% 非离子洗涤剂和10% 正常 (驴) 血清的溶液中, 在黑暗中的一个加湿室中, 在室温下进行2到3小时的二次抗体的孵育。
注意:对于以下二次抗体, 使用了这些稀释: 对于图 2和3, 驴抗兔 IgG 1:600。对于图 4, 罗丹明 (TRITC) 驴抗兔 igg 1:500 和驴抗山羊 igg 1:500。 - 将幻灯片放在幻灯片架上的玻璃显微镜滑动染色盘中。用350毫升的 1x PBS 填充盘子, 在室温下清洗5分钟三倍的幻灯片。
- 从幻灯片上轻拍多余的液体, 用干燥的纸巾擦干幻灯片。通过将安装代理的一滴 DAPI 直接添加到组织中来装载幻灯片。慢慢地将盖玻片放在顶部, 确保没有气泡在下面形成, 并允许幻灯片在室温下夜间在黑暗中治愈。将幻灯片存放在4摄氏度。
- 图像幻灯片使用共焦显微镜。使用激光成像如下: DAPI 紫外线激光器, 488 nm 抗兔 IgG 激光, 543 nm 激光为罗丹明 TRITC。
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Representative Results
在顺铂治疗后三天大鼠的 ABR 反应显示阈值显著升高。通过鼓膜 (r) n-phenylisopropyladenosine (r-PIA), 腺苷 A1受体激动剂15, 顺铂前, 这些阈值的升高明显减少。R-PIA 在腺苷 A1受体上的作用的特异性表明, 它是由 8-环戊基-13-dipropylxanthine (DPCPX) 对抗,一个1 受体特定拮抗剂16。这种药物增强顺铂诱发的 ABR 阈值移位 (图 1A)。与其产生听力损失的效果相似, 顺铂也增加了外毛细胞的损失/损伤 (扫描电镜评估) (图 1B)。扫描电镜图像获得如前所述的17。通过对R-PIA (图 1C) 的跨鼓膜管理, 大大减少了这种效果。此外, 我们表明, 通过鼓膜R-PIA 减少基底和顺铂诱导 p-STAT1 免疫反应在耳蜗, 反映了抗炎的性质, 这种药物 (图 2)。
通过鼓膜的途径也可以用来管理生物制剂, 如 siRNAs, 这会产生有益的影响。STAT1 siRNA 对大鼠的鼓膜管理有效地降低了 STAT1 和 p-STAT1 水平, 并阻止了顺铂激活转录因子 (图 3)。
另外的研究表明, NOX3 mRNA 的另一 siRNA 的鼓膜的管理降低了诸如辣椒素等药物的能力, 以增加一些下游调解人, 如瞬态受体电位辣椒 1 (TRPV1) 通道和 p-STAT1 (图 4)。这些调解人与辣椒素引起的听力损失有牵连18。
图 1:跨鼓膜管理 R-PIA 降低了顺铂诱发的听力损失, 并保护外毛细胞丧失。A. ABR 阈值是在大鼠前和72小时的治疗后, 用顺铂 (11 毫克/千克, ip) 后, 经鼓膜管理的r-pia 或 DPCPX + R-pia。以顺铂诱导的 ABR 阈值升高为1AR 激动剂, R-PIA。联合管理一个1AR 拮抗剂, DPCPX, 扭转了 R-PIA 对 abr 阈值的影响, 并显著提高了顺铂在所有测试频率下产生的 ABR 移位。箭头指示零 ABR 阈值移位。B.顺铂治疗对外毛细胞 (OHC) (白箭) 有明显的损伤, 如扫描电镜 (SEM) 所示。r-pia 保护 OHCs 不受顺铂诱发的损伤, 而 DPCPX 削弱了RPIA 的保护作用。C.条形图显示了B中显示的 SEM 图像的定量分析。误差线表示平均值的标准误差。星号 (*) 和 (**) 表明与车辆或顺铂治疗组分别有统计学意义的差异, 而 (**) 表明与R-PIA + 顺铂治疗大鼠有统计学意义的差异 (p< 0.05, n=5)。这个数字是从 Kaur等。19具有权限。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 通过鼓膜管理的一个1AR 激动剂, R-PIA, 降低顺铂-增加 p-STAT1 免疫反应在耳蜗.对大鼠进行了腹腔剂量顺铂 (11 毫克/千克), 增加了 p-STAT1 系列727免疫反应, 评估 72 h 后药物管理局。然而, 1 h 预处理与鼓膜R-PIA 减弱了这种增加 p-STAT1 免疫反应。联合治疗的一个1AR 拮抗剂, DPCPX, 连同激动药逆转 p-STAT1 免疫抑制。蓝色染色代表 DAPI 染色的细胞核, 而绿色染色则代表 p-STAT1 immunolabeling。OHC 和 DC 分别代表外毛细胞和 Deiter 细胞。白色箭头表示三行的 OHCs。左下面板显示的缩放栏为10µm。这个数字是从 Kaur等。19具有权限。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: STAT1 siRNA 阻断顺铂诱导的 p-STAT1 水平.以顺铂 (11 毫克/千克, ip) 为72小时, 从大鼠中分离出的耳蜗部分显示, OHCs 中增加了727 p-STAT1 免疫阳性。前处理与 STAT1 siRNA (0.9 毫克) 减弱顺铂诱导的 p-STAT1 免疫反应增加, 而炒治疗显示没有效果。蓝色染色代表 DAPI 染色的细胞核, 而绿色染色则代表 p-STAT1 immunolabeling。白色箭头表示三行的 OHCs。右下面板显示的刻度条测量10µm。这个数字是从 Kaur等。20具有权限。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: NOX3 siRNA 的鼓膜注射可降低大鼠耳蜗的 TRPV1 和 p-STAT1 水平.麻醉大鼠进行了 siRNA (争抢) 或 NOX3 siRNAs 的反式鼓膜注射, 这是随后两天后通过鼓膜注射辣椒素24小时. 隔离耳蜗从这些动物被染色 p-STAT1727和 TRPV1 免疫反应。辣椒素在耳蜗 (SVA)、外毛细胞 (OHC) 和螺旋神经节 (SG) 细胞中, 增加了 TRPV1 (绿色) 和 p-STAT1727 (红色) 在24小时的免疫反应。然而, 用 NOX3 siRNA 预处理的动物并没有显示 p-STAT1727和 TRPV1 immunolabeling 的任何可见诱导。刻度条 (右下板) 代表50和10µm 为插入。这个数字是从 Mukherjea等。18具有权限。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
通过鼓膜管理途径, 可以将药物和其他药物的局部运送到耳蜗, 如果系统地进行管理, 可能会产生明显的系统性副作用。这种药物管理方法允许药物迅速进入行动地点, 其剂量要比通过系统途径所能达到的要高得多。在这里和发表的结果表明, 通过鼓膜管理的 [R] n-苯基异丙腺苷 (r-PIA) 保护耳蜗从顺铂诱导的外毛细胞损失 (图 1)19和诱导炎症的表现, 减少激活 STAT1 转录因子 (与那些治疗与顺铂或R-PIA + DPCPX + 顺铂) (图 2)19。这些好处可能有助于防止这种药物提供的听力损失。根据以往的经验, 我们断言只有一个药物管理是需要的。这可能表明, 该药物是保留在中耳, 并可以慢慢地进入耳蜗提供保护三天这些动物被评估为耳毒性。这项技术目前正被用来提供其他药物进入内耳, 以确定其功效作为 oto 保护剂。
除了药物外, siRNAs 的鼓膜管理可以提供有效的击倒选择性 rna, 以降低其蛋白质水平, 并提供 oto 保护18,20。再次, 这些 siRNAs 将提供较少的毒性, 如果他们在耳蜗附近分娩。被击倒的期间是三天 (我们的评估期间的极限)。重要的是, 添加 siRNAs 阻止毒性药物, 如顺铂诱导其相应的蛋白质。由于胞外液中核酸的丰富, 细胞内以及将这些分子转化为耳蜗细胞的潜在困难, 击倒的持续时间有些令人吃惊。然而, 对蛋白质的击倒和 oto 保护意味着这些 siRNAs 在有效浓度下到达耳蜗。
尽管上面所述的好处, 预计这项技术的某些限制。这些包括在开始手术前麻醉实验动物的需要。药物必须进行更高浓度的中耳, 因为只有一小部分 (~ 1-10%) 预计达到外淋巴液。此外, 应用药物或生物制品的分布更集中在观察到的最大影响的基础上。
虽然在这里提出的代理的跨鼓膜交付仅限于大鼠, 类似的药物传递方法可用于预防患者谁期待化疗的药物, 如顺铂。预计这种药物的传递方法可以迅速地用于人类筛查大量的化合物, 这表明了治疗实验动物的药物性听力丧失的有效性。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
本文所述的工作得到了 RO1 CA166907、NIDCD RO1-DC 002396 和 RO3 DC011621 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
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