Summary
Vi presenterer en teknikk for lokaliserte administrasjon av medikamenter gjennom trans-tympanic ruten i sneglehuset. Narkotika-leveranser gjennom denne ruten ville ikke forstyrre anti-kreft effekten av cellegifter som cisplatin.
Abstract
Systemisk administrasjonen av beskyttende agenter til å behandle narkotikainduserte ototoksisitet begrenses av muligheten for at disse beskyttende agenter kan forstyrre chemotherapeutic effekten av primære narkotika. Dette gjelder særlig for narkotika cisplatin, handlingene anticancer er svekket av antioksidanter som gir tilstrekkelig beskyttelse mot hørselstap. Andre eksisterende eller potensielle otoprotective agenter kan utgjøre et lignende problem, hvis administrert systemisk. Bruk av ulike biologicals eller beskyttende agenter direkte til sneglehuset ville tillate for høye nivåer av disse agentene lokalt med begrenset systemisk bivirkninger. I denne rapporten viser vi en trans-tympanic metode for levering av ulike legemidler eller biologiske reagenser til sneglehuset, som skal forbedre grunnleggende forskning på cochlea og gir en enkel måte å styre bruken av otoprotective agenter i klinikkene. Denne rapporten viser en metode for trans-tympanic narkotika-leveranser og gir eksempler på hvordan denne teknikken har vært brukt med hell i forsøksdyr for å behandle cisplatin ototoksisitet.
Introduction
Eksterne hørselen er utsøkt sensitive til stoffer som cisplatin og aminoglycoside antibiotika. Cisplatin er en mye brukt chemotherapeutic agent for behandling av en rekke solide svulster, eggstokkreft, testikler og hode og nakke kreft. Ototoksisitet med bruk av dette stoffet er dose-begrensende og ganske vanlig, påvirker 75-100% av pasienter behandlet1. Andre stoffer, som carboplatin og oxaliplatin, har dukket opp som alternativer til cisplatin2,3,4,5, men nytten er begrenset til noen kreftformer.
Studier har vist den kritiske rollen reaktive oksygen arter (ROS) i formidling av ototoksisitet produsert av cisplatin og aminoglycosides. Studier viste at NOX3 isoformen av NADPH oksidase er hovedkilden til ROS i cochlea, og aktiveres ved cisplatin6,7. Generering av ROS kompromisser økt antioksidant bufring kapasitet på cellene, fører til lipid peroxidation mobilnettet membraner8. Videre øker cisplatin produksjonen av hydroksylradikaler som genererer svært giftige aldehyd 4-hydroxynonenal (4-HNE), en initiator celle død9,10. Basert på disse resultatene, har flere antioksidanter blitt undersøkt for behandling av cisplatin ototoksisitet. Disse inkluderer N-acetyl-cystein (NAC), natrium tiosulfat (m), amifostine og D-metionin. Svært viktig antioksidant terapi er imidlertid at disse antioksidantene kan redusere cisplatin chemotherapeutic effekt når det gis systemisk11 til samspillet av cisplatin med thiol grupper i antioksidant molekyler.
I lys av disse problemene med antioksidant terapi var målet med denne studien å undersøke trans-tympanic ruten å levere antioksidanter og andre stoffer til sneglehuset å redusere hørselstap. Trans-tympanic ruten av narkotika og kort konflikt (si) RNA, beskrevet nedenfor, vises særlig lovende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mannlige Wistar rotter ble håndtert i samsvar med National Institutes of Health dyret bruker retningslinjer og en protokoll som er godkjent av Southern Illinois University skolen av medisin laboratorium Animal Care og bruke komiteen. Auditory hjernestammen svar (ABR) ble utført på rotter mens under anestesi før Rusgiften Administrasjonen og 72 h etter for å kontrollere effekten av trans-tympanic narkotika-leveranser.
1. auditiv hjernestammen svar (ABR)
Merk: ABR målinger ble samlet ved hjelp av auditory teste utstyr og programvare. ABR representerer evoked potensial eller høyfrekvente bølger generert av den åttende cranial nerven (bølge I og II) og andre høyere auditiv hjernestammen strukturer inkludert anteroventral cochlear kjernen (bølge III), laterale lemniscus (bølge IV) og mindreverdig colliculus (bølge V). Disse bølgene er differensiert avhengig av ventetid. ABR målinger ble utført som beskrevet tidligere12.
- Bedøve rotter med en blanding av 90 mg/kg ketamin og 17 mg/kg xylazine via intraperitoneal injeksjon. Bekreft dybden av anestesi via tå-klype refleks. Bruke ophthalmica smøring (eller mineralolje drops) på begge øynene å hindre øynene tørker og unngå sårdannelse under anestesi.
- Sett rotta i liggende stilling på en varmeputen (37 ° C) i en kontrollert akustisk messe. Audiology testutstyr ligger utenfor og messe.
- Sett inn rustfritt stål elektroder tilsvarende: bakken elektroden bak flanke, den positive elektroden mellom to ørene direkte på toppen av skallen, og de negative elektrodene under høydepunkt av hvert øre.
- Bruke akustisk stimuli bruker høyfrekvente Transducers som et 5 ms tone utbrudd på 8, 16 og 32 kHz. Bestemme stimulans intensiteter som desibel lydtrykknivået (dB SPL). Dette begynner på 10 dB SPL og når 90-dB SPL 10 dB-trinn størrelse. Kalibrere lyd intensiteten til en maksimal effekt på 90-dB SPL bruker en impuls presisjon lydnivåmåleren.
Merk: Testresultatet gir en indikasjon på integriteten til eksterne hørselsorganet sneglehuset og nevnte auditiv strukturer. Bølgeformene genereres innen 15 ms stimulans inngang og ventetiden på bølgene avhenger av varmeledning tid, som igjen er regulert av tre kritiske faktorer: volumet av hjernen, intensiteten og hyppigheten av lyden. Auditory evoked potensial ble registrert bruker programvare som leveres av produsenten. - Vurdere minimum intensiteten som kan fremkalle to andre bølgeformer (II og III) på 0,5 µV amplituden som terskelen fremtredende.
Merk: Terskelen Skift representerer forskjellen i terskelen målt etter behandling sammenlignet med terskelen innhentet før behandling.
2. Trans-Tympanic injeksjoner
- For å administrere stoffet trans-tympanically, sett rotta i venstre lateral liggesår posisjon.
- 2,5 disponibel øre spekulum inn i ørekanalen.
- Plasser spekulum bruken av et kirurgisk omfang, slik at trommehinnen er synlig.
- Bruke en 29 G X ½, 0,5 mL insulinsprøyte, trekke opp 50 µL av [R] - N - fenyl isopropyl adenosin (R-PIA) løsning (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) løsning (3 µM), eller siRNA løsning (0.9 µg) å injisere (5 enheter).
- Bruk spekulum skal lede nålen til fremre dårligere regionen trommehinnen.
- Stikk et hull gjennom membranen med nålen og administrere medikamentene nevnt i 1.2.3. Tillate rotta å hvile i denne posisjonen i 15 min.
Merk: 50 µL bør være tilstrekkelig volumet til å passe bak trommehinnen. Ingen væsken skal være i ørekanalen etter administrasjon. - Sett rotta høyre lateral liggesår plasser og gjenta 1.2.1 gjennom 1.2.5 administrasjon i det andre øret.
- For rotter mottar cisplatin intraperitoneally, plassere rotta i supine posisjon på en varmeputen på 37 ° C.
- Bruker en 21 G X 3/4 sommerfugl p (12" lengde rør), trekke opp cisplatin (11 mg/kg, 1 mg/mL løsning i sterilt fosfat buffer saltvann [PBS]).
- Bruker en sprøytepumpe, administrere cisplatin (1 mg/mL) via intraperitoneal injeksjon over 30 min.
Merk: For en 250-g rotte, ville volumet være 2,75 mL med en hastighet på ca 0,1 mL per min.
- Fortsette å overvåke dybden av anestesi gjennom disse prosedyrene. Når cisplatin administrasjon er fullført, sett rotta tilbake i buret i liggende stilling, sørge for at det er ingenting å hindre sin puste.
- Overvåke rotta til helt frisk.
3. sneglehuset disseksjon og Avkalking
- Etter den endelige ABR (etter 72 h), bedøve rotte med en blanding av 90 mg/kg ketamin og 17 mg/kg xylazine via intraperitoneal injeksjon. Bekreft anestesi med en tå-klype refleks. Euthanize rotte via halshogging.
- Dissekere ut temporal benet som beskrevet tidligere13.
- Plasser sneglehuset i 4% paraformaldehyde i 1 x PBS løsningen i en 7-mL scintillation hetteglass (helt dekker sneglehuset). Kjøleskap over natten på 4 ° C. Fjerne paraformaldehyde og vask med 1 x PBS ved romtemperatur.
- Fjern PBS og fylle røret helt med en 120 mM løsning av EDTA (pH 7.3). Plasser på en rotator ved romtemperatur og tillate avkalkning av 2 til 3 uker, endre EDTA løsningen daglig.
4. og kryosnitt
- Ved ferdigstillelse av Avkalking, helt fordype sneglehuset i følgende løsninger (7 mL hver) 24 h på 4 ° C: 10% sukrose, 20% sukrose, 1:1 blanding av 20% sukrose og optimal kutte temperatur (OCT) innebygging sammensatte.
- Plass frisk OCT sammensatte fylle og dekker sneglehuset i en 15 x 15 mm x 5 mm disponibel innebygging mold. Plasser sneglehuset på siden slik at den blir parallell til bunnen av innebygging mold, som beskrevet av Whitlon et al. 14
- Umiddelbart plassere mold på tørris stivne Tilpasningsverktøy for Office og lagre-80 ° c over natten.
- Fordype objektglass 0,01% Poly-L-Lysine ved romtemperatur for 30 min. Fjern lysbildene, ikke skyll, og la det tørre over natten. Bruk disse lysbildene for cryosections.
- Fjerne sneglehuset OCT fra-80 ° C fryseren og plassere den på tørris. Med en skarp mikrotomen blad (L x W: 80 mm x 8 mm, dybde 0,25 mm, cutting vinkel på 34 °), seksjon OCT blokkene på 10 µm ved hjelp av en kryostaten på-30 ° C. Plass to deler per lysbilde.
- Kjøleskap lysbilder på 4 ° C når du er ferdig.
5. Immunohistochemistry
- Plass lysbildene i en barometer microscope skyve flekker retten på en objektglasstativet. Fylle fatet med 350 mL 1 x PBS og vask lysbilder for 5 min tre ganger ved romtemperatur.
- Fjern lysbildene fra retten og tørke av området rundt vevet med en tørr tørke, husk ikke å tørke av vev.
- Bruke flytende blokkerer penn, tegne en sirkel rundt delen vev.
- Blokkere vevet 1t ved romtemperatur ved å legge 150 µL av blokkering løsning inneholder 10% vanlig (esel) serum, 1% ikke-ionisert vaskemiddel og 1% BSA på 1 x PBS.
- Trykk av overflødig blokkerer løsning og ruge vevet overnatting på 4 ° C i en fuktet kammer med 150 µL av 10% vanlig (esel) serum 0,1% ikke-ionisert vaskemiddel og primære antistoff (se merknaden nedenfor) i 1 x PBS.
Merk: Følgende antistoffer, disse fortynninger ble brukt: figur 2 og 3, p-STAT1 Ser727 1:300. Figur 4, p-STAT1 Ser727, 1: 100 og TRPV1 1: 100. - Plass lysbildene i barometer microscope skyve flekker retten på en objektglasstativet. Fylle fatet med 350 mL 1 x PBS og vask lysbilder for 5 min tre ganger ved romtemperatur.
- Inkuber med sekundær antistoffer fortynnet i en løsning som inneholder 0,01% ikke-ionisert vaskemiddel og 10% vanlig (esel) serum i 1 x PBS 2 til 3 h ved romtemperatur i en fuktet kammer i mørket.
Merk: Følgende sekundære antistoffer, disse fortynninger ble brukt: figur 2 og 3, esel anti-kanin IgG 1:600. Figur 4: Rhodamine (TRITC) esel anti-kanin IgG 1:500 og esel anti-geit IgG 1:500. - Plass lysbildene i barometer microscope skyve flekker retten på en objektglasstativet. Fylle fatet med 350 mL 1 x PBS og vask lysbilder for 5 min tre ganger ved romtemperatur.
- Tapp overflødig væske ut av lysbildet, og tørr lysbildet med en tørr tørke rundt vevet. Montere lysbilder ved å legge en dråpe montering agent med DAPI direkte på vevet. Sakte plasser på dekkglassvæske på, slik at ingen bobler dannes under, og la lysbildene herdes natten i romtemperatur i mørket. Lagre lysbilder på 4 ° C.
- Bilde lysbilder ved hjelp av AC confocal mikroskopi. Bruke lasere for imaging som følger: UV laser for DAPI, 488 nm laser for esel anti-kanin IgG og 543 nm laser for rhodamine TRITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR svar målt i rotter på tre dager etter cisplatin administrasjon viste en betydelig høyde i terskler. Heving av disse grensene ble betydelig redusert i rotter administreres med trans-tympanic [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosin en1 reseptor Agonistiske15, før cisplatin. Spesifisiteten av handlingen av R-PIA adenosin en1 reseptor ble demonstrert av observasjon at det var antagonized av 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX), en A1 reseptor-spesifikke antagonist16. Dette stoffet kraftig cisplatin-indusert ABR terskelen Skift (figur 1A). Lik sin effekten av produserende hørselstap, cisplatin også økt tap/skade å ytre hårcellene (vurdert av skanning elektronmikroskop [SEM]) (figur 1B). SEM bildene ble oppnådd som beskrevet tidligere17. Denne effekten ble betydelig redusert med trans-tympanic administrasjon av R-PIA (figur 1C). Videre viser vi at trans-tympanic R-PIA reduserer basal og cisplatin-indusert p-STAT1 immunoreactivity i sneglehuset, reflekterer den anti-inflammatoriske eiendommen av dette stoffet (figur 2).
Trans-tympanic ruten kan også brukes til å administrere biologiske som siRNAs, som resulterer i gunstige effekter. Trans-tympanic administrasjon av STAT1 siRNA rotter effektivt redusert STAT1 og p-STAT1 og blokkert aktivering av denne transkripsjon faktoren av cisplatin (Figur 3).
Flere studier viser at trans-tympanic administrasjon av en annen siRNA for NOX3 mRNA redusert evne til stoffer som capsaicin å øke noen nedstrøms meglere, som midlertidig reseptor potensielle vanilloid 1 (TRPV1) kanal og p-STAT1 ( Figur 4). Disse meglere er innblandet i capsaicin-indusert hørselstap tap18.
Figur 1: Trans-tympanic administrasjon av R-PIA redusert Cisplatin-indusert hørselstap og beskyttet mot tap av ytre hårcellene. A. ABR terskler ble målt i rotter før og 72 h etter behandle dem med cisplatin (11 mg/kg, IP) etter trans-tympanic administrasjon av R-PIA eller DPCPX + R-PIA. Cisplatin-indusert rettighetsutvidelse ABR terskelen ble vist å dempes av A1AR Agonistiske, R-PIA. Co administrasjon av A1AR antagonist, DPCPX, tilbakeføres effekten av R-PIA for ABR terskelen og betydelig opphøyet ABR skifter produsert av cisplatin på alle frekvenser testet. Pilen viser null ABR terskelen SKIFT. B. Cisplatin behandling viste betydelig skade på ytre hårcellene (OHC) (hvit pil) som demonstrert av skanning elektronmikroskop (SEM). R-PIA beskyttet OHCs mot cisplatin forårsaket skader, mens DPCPX dempes beskyttende effekten av R-PIA. C. stolpediagrammet viser kvantitativ analyse av SEM bildene som vises i B. Feilfeltene angir standard feil av gjsnitt. Stjerner (*) og (*) angir en statistisk signifikant forskjell fra kjøretøy eller cisplatin behandlingsgrupper, henholdsvis, mens (*) angir en statistisk signifikant forskjell fra R-PIA + cisplatin-behandlet rotter (p < 0,05, n = 5). Dette tallet ble tilpasset fra Kaur et al. 19 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Trans-tympanic administrasjon av en1AR Agonist, R-PIA, redusert Cisplatin-økt p-STAT1 Immunoreactivity i sneglehuset. Rotter ble gitt en intraperitoneal dose av cisplatin (11 mg/kg), som økte p-STAT1 Ser727 immunoreactivity, vurdert på 72 h innlegget narkotika administrasjon. Imidlertid 1t forbehandling med trans-tympanic R-PIA avstumpet denne økningen i p-STAT1 immunoreactivity. Co behandling av A1AR antagonist, DPCPX, sammen med Agonistiske reversert hemming av p-STAT1 immunoreactivity. Blå flekker representerer DAPI-farget kjerner, mens grønne flekker representerer p-STAT1 immunolabeling. OHC og DC representerer ytre hår celle og Deiters celle, henholdsvis. Hvite pilene angir tre radene i OHCs. Skala bar vises i nedre venstre panel er 10 µm. Dette tallet ble tilpasset fra Kaur et al. 19 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Trans-tympanic administrasjon av STAT1 siRNA blokkert Cisplatin-indusert p-STAT1 nivåer. Cochlea deler isolert fra rotter administrert med cisplatin (11 mg/kg, IP) for 72 h viste økt Ser727 p-STAT1 immunoreactivity i OHCs. Forbehandling med trans-tympanic STAT1 siRNA (0.9 mg) dempes cisplatin-indusert økning i p-STAT1 immunoreactivity, mens scrambled behandling viste ingen effekt. Blå flekker representerer DAPI-farget kjerner, mens grønne flekker representerer p-STAT1 immunolabeling. Hvite pilene angir tre radene i OHCs. Baren skala vises i nedre høyre panel måler 10 µm. Dette tallet ble tilpasset fra Kaur et al. 20 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Trans-tympanic injeksjon av NOX3 siRNA reduserer TRPV1 og p-STAT1 nivåer i rotte sneglehuset. Bedøvet rotter var administrert krypterte siRNA (pakke) eller NOX3 siRNAs av trans-tympanic injeksjoner, som ble etterfulgt to dager senere av trans-tympanic injeksjoner av capsaicin for 24 h. isolert cochleae fra disse dyrene var farget for p-STAT1 Ser727 og TRPV1 immunoreactivity. Capsaicin økt både TRPV1 (grønn) og p-STAT1 Ser727 (rød) immunoreactivity på 24 h i stria vascularis (SVA) og ytre hårcellene (OHC) spiral ganglion (SG) celler. Dyr forbehandlet med NOX3 siRNA viste imidlertid ikke noen synlig induksjon av p-STAT1 Ser727 og TRPV1 immunolabeling. Skala barer (nedre høyre panel) representerer 50 og 10 µm for insets. Dette tallet ble tilpasset fra Mukherjea et al. 18 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trans-tympanic administrasjon ruten gir lokaliserte levering av narkotika og andre stoffer til sneglehuset som ellers kunne produsere betydelige systemisk bivirkninger hvis administrert systemisk. Dette stoffet administrasjon tillater rask tilgang av narkotika til området av handlingen ved betydelig høyere doser enn kan oppnås gjennom systemisk ruten. Resultatene presenteres her og publisert tidligere viste at trans-tympanic administrasjon av [R] - N - fenyl isopropyl adenosin (R-PIA) beskyttet sneglehuset cisplatin-indusert ytre hår cellen tap (figur 1)19 og induksjon av betennelse som demonstrert av redusert aktivering av STAT1 transkripsjon faktor (sammenlignet med de behandlet med cisplatin eller R-PIA + DPCPX + cisplatin) (figur 2)19. Disse fordelene kan bidra til beskyttelse fra hørselstap by av dette stoffet. Basert på tidligere erfaringer, hevde vi eneste stoffet administrasjon er nødvendig. Dette kan indikere at stoffet beholdes i mellomøret og kan sakte tas i sneglehuset beskytter de tre dagene disse dyrene er vurdert for ototoksisitet. Denne teknikken brukes til å levere andre rusmidler i det indre øret å avgjøre deres effekt som oto-protectants.
I tillegg til narkotika, kan trans-tympanic administrasjon av siRNAs gi effektiv knockdown av selektive RNAs å redusere deres protein nivå og gi oto-beskyttelse18,20. Igjen, disse siRNAs ville gi mindre toksisitet hvis de leveres i nærheten av sneglehuset. Varigheten av knockdown var opp til tre dager (grensen på vår vurdering periode). Viktigere, blokkerer tillegg av siRNAs induksjon av deres tilsvarende protein som ototoxic stoffer, som cisplatin. Varigheten av knockdown er noe overraskende gitt av nucleases ekstracellulære væske og celler og den potensielle problemer med å få disse molekylene i cochlea celler. Men innebære demonstrasjon av både knockdown proteiner og oto-beskyttelse at disse siRNAs er nå sneglehuset ved effektiv konsentrasjoner.
Til tross for fordelene beskrevet ovenfor, er visse begrensninger av denne teknikken forventet. Disse inkluderer behovet for anesthetizing forsøksdyr før du starter prosedyren. Narkotika må administreres på høyere konsentrasjoner i mellomøret siden bare en liten brøkdel (~ 1-10%) er forventet for å nå perilymph. I tillegg er fordelingen av brukt narkotika eller biologicals mer konsentrert på basen der den største effekten er observert.
Mens trans-tympanic levering av agenter presenteres her var begrenset til rotter, kan en lignende metode for narkotika-leveranser brukes prophylactically hos pasienter som venter kjemoterapi med stoffer som cisplatin. Det er forventet at denne metoden for narkotika-leveranser kan vedtas raskt for mennesker å skjermen en rekke forbindelser som har vist effekt i behandling av stoff-indusert hørselstap i forsøksdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Noen interessekonflikt erklært.
Acknowledgments
Arbeidet som er beskrevet i denne artikkelen ble støttet av en NCI RO1 CA166907 NIDCD RO1-DC 002396 og RO3 DC011621.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J.
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
