Summary
Presenteren we een techniek gelokaliseerde beheer van drugs via de trans-tympanic route in het slakkenhuis. Drug bezorging via deze route zou niet interfereren met de anti-kanker werkzaamheid van het chemotherapeutische geneesmiddelen zoals cisplatine.
Abstract
De systemische toediening van beschermende middelen voor de behandeling van drug-geïnduceerde ototoxiciteit wordt beperkt door de mogelijkheid dat deze beschermende middelen zou kunnen met de chemotherapeutische werkzaamheid van de primaire drugs interfereren. Dit geldt met name voor de drug cisplatine, wiens antikanker acties zijn verzwakt door anti-oxidanten die adequate bescherming tegen verlies van het gehoor biedt. Andere huidige of potentiële otoprotective agenten kunnen opleveren een soortgelijk probleem, als systemisch toegediend. De toepassing van verschillende biologicals of beschermende middelen rechtstreeks naar het slakkenhuis zou voor hoge niveaus van deze agenten lokaal met beperkt systemische bijwerkingen. In dit verslag tonen wij een trans-tympanic methode van de levering van verschillende drugs of biologische reagentia aan het slakkenhuis, die moet verbeteren van fundamenteel wetenschappelijk onderzoek op het slakkenhuis en bieden een eenvoudige manier van het leiden van het gebruik van otoprotective stoffen in de klinieken. Dit verslag een methode van levering van de trans-tympanic drug gedetailleerd en bevat voorbeelden van hoe deze techniek is gebruikt met succes in proefdieren te behandelen cisplatine ototoxiciteit.
Introduction
Het perifere auditieve systeem is prachtig gevoelig voor drugs zoals cisplatine en aminoglycoside antibiotica. Cisplatine is een veel gebruikte chemotherapeutische agent voor de behandeling van een verscheidenheid van solide tumoren, zoals ovariële testiculaire en hoofd en nek kanker. Ototoxiciteit ervaren met het gebruik van deze drug is dosis-beperken en vrij gemeenschappelijk,1treft 75-100 procent van de patiënten behandeld. Andere drugs, zoals carboplatin en oxaliplatin, opgedoken als alternatieven voor cisplatine2,,3,,4,5, maar het nut ervan is beperkt tot een paar kankers.
Vroege studies hebben de kritische rol van reactieve zuurstof soorten (ROS) in het bemiddelen van de ototoxiciteit geproduceerd door cisplatine en aminoglycosiden aangetoond. Latere studies is gebleken dat de NOX3 isovorm van NADPH oxidase de primaire bron van ROS in het slakkenhuis is, en wordt geactiveerd door cisplatine6,7. De generatie van ROS compromissen verhoogde de antioxidant buffercapaciteit van cellen, wat leidt tot lipide peroxidatie van cellulaire membranen8. Bovendien, cisplatine verhoogt de productie van hydroxyl radicalen die zeer toxische aldehyde 4-hydroxynonenal (4-HNE), initiator van9,10van de dood van de cel genereren. Op basis van deze bevindingen, verschillende antioxidanten onderzocht voor de behandeling van cisplatine ototoxiciteit. Het gaat hierbij om N-acetyl-cysteïne (NAC), natrium thiosulfate (STS), amifostine en D-methionine. Een grote zorg van antioxidant therapie is echter dat deze antioxidanten cisplatine chemotherapeutische werkzaamheid bij toediening systemisch11 door de interactie van cisplatine met thiol-groepen in de antioxidant moleculen kunnen verminderen.
Met het oog op deze problemen met antioxidant therapie was het doel van deze studie om de trans-tympanic route antioxidanten en andere drugs te leveren aan het slakkenhuis om verlies van het gehoor te controleren. De trans-tympanic route van drugs- en korte inmenging (si) RNA, hieronder beschreven, lijkt veelbelovend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mannelijke Wistar ratten werden behandeld in overeenstemming met het National Institutes of Health dier gebruiken richtlijnen en een protocol goedgekeurd door de Southern Illinois University School van geneeskunde Laboratory Animal Care en Comité gebruiken. Auditieve brainstem response (ABR) werd uitgevoerd op ratten terwijl onder verdoving vóór drug administration en 72 uur na om te controleren of het effect van de trans-tympanic drug levering.
1. auditieve Brainstem Response (ABR)
Opmerking: ABR metingen werden verzameld met behulp van de auditieve test apparatuur en software. ABR vertegenwoordigt evoked potentials of hoge-frequentie golven gegenereerd door de achtste craniale zenuw (Golf I en II) en andere hogere auditieve hersenstam structuren met inbegrip van anteroventral cochleair kern (Golf III), laterale lemniscus (Golf IV) en inferior colliculus (Golf V). Deze golven worden onderscheiden afhankelijk van de latentie. ABR metingen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven12.
- Anesthetize ratten met een mengsel van 90 mg/kg ketamine en 17 mg/kg xylazine via intraperitoneale injectie. Bevestig de diepte van de verdoving via teen-snuifje reflex. Ophthalmic smering (of minerale olie druppels) toepassen op beide ogen te drogen van de ogen voorkomen en te vermijden ulceratie tijdens anesthesie.
- Plaats de rat in de vatbaar positie op een verwarming pad (37 ° C) binnenkant van een gecontroleerde akoestische stand. Audiologie testapparatuur ligt buiten en naast de stand.
- RVS elektroden dienovereenkomstig invoegen: de elektrode van de grond aan de achterzijde flank, de positieve elektrode tussen de twee oren direct boven op de schedel, en de negatieve elektroden onder de pinna van elk oor.
- Toepassing akoestische stimuli met behulp van hoge-frequentie omvormers als een 5 ms tone-burst op 8, 16 en 32 kHz. Bepalen intensiteit stimulus als decibel geluidsdrukniveau (dB-SPL). Dit begint bij 10 dB SPL en 90-dB SPL met een 10-dB stap-grootte bereikt. Het geluid intensiteit voor een maximale lichtopbrengst van 90-dB SPL met behulp van een impuls precisie geluidsmeter kalibreren.
Opmerking: Het testresultaat geeft een indicatie van de integriteit van de perifere hoorzitting-orgel, het slakkenhuis en de bovengenoemde auditieve structuren. De golfvormen worden gegenereerd binnen 15 ms van input van de stimulus en de latentie van de golven hangt af van conductie tijd, die op zijn beurt wordt geregeld door drie cruciale factoren: volume van de hersenen, de intensiteit en de frequentie van het geluid. Auditieve evoked potentialen werden opgenomen met behulp van software die wordt geleverd door de fabrikant. - Overwegen de minimale intensiteit die twee verschillende golfvormen (II en III) van 0.5 µV amplitude als drempel prominent oproepen kan.
Opmerking: Drempel shift vertegenwoordigt het verschil in de drempelwaarde gemeten na behandeling met de drempel verkregen vóór de behandeling vergeleken.
2. Trans-Tympanic injecties
- Voor het beheer van de drug trans-tympanically, de rat in de linker laterale decubitus positie te plaatsen.
- 2.5 mm wegwerp oor specula invoegen in de gehoorgang.
- Met het gebruik van een chirurgische scope, plaatst u de specula zodat het membraan van de tympanic zichtbaar is.
- Met behulp van een 29 G X ½, 0,5 mL insuline spuit, opstellen van 50 µL van het [R] - N - fenyl isopropyl adenosine (R-PIA) oplossing (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) oplossing (3 µM) of siRNA oplossing (0.9 µg) te injecteren (5 stuks).
- Gebruik de specula om de naald in de regio anterior inferieur van het tympanic-membraan.
- Zak een gat door het membraan met de naald en beheren van de drugs in 1.2.3 genoemd. Laat de rat tot rust in deze positie gedurende 15 minuten.
Opmerking: 50 µL moet het voldoende volume om te passen achter het tympanic membraan. Geen vloeistof moet in de gehoorgang na toediening. - Plaats de rat in het recht laterale decubitus positie en herhaal stappen 1.2.1 via 1.2.5 voor administratie in het andere oor.
- Voor ratten cisplatine intraperitoneally ontvangen, plaatst u de rat in de liggende positie op een verwarming pad bij 37 ° C.
- Met behulp van een 21 G X 3/4 butterfly naald (12" lengte buis), opstellen van cisplatine (11 mg/kg, 1 mg/mL oplossing in een steriele fosfaat buffer zoutoplossing [PBS]).
- Met een spuitpomp, beheren cisplatine (1 mg/mL) via intraperitoneale injectie meer dan 30 min.
Opmerking: Voor een 250-g rat zou het volume 2.75 / mL bij een snelheid van ongeveer 0,1 mL per min.
- Blijven volgen van de diepte van de verdoving in deze procedures. Zodra cisplatine administratie voltooid is, plaatst u de rat terug in de kooi in de vatbaar positie, om ervoor te zorgen is er niets aan de ademhaling belemmeren.
- Toezicht op de rat tot volledig hersteld.
3. slakkenhuis dissectie en botontkalking
- Na de definitieve ABR (na 72 h), anesthetize de rat met een mengsel van 90 mg/kg ketamine en 17 mg/kg xylazine via intraperitoneale injectie. Verdoving met een teen-snuifje reflex bevestigen. De rat via onthoofding euthanaseren.
- Ontleden uit het bot van de temporale zoals eerder beschreven13.
- Slakkenhuis in 4% paraformaldehyde in 1 x PBS oplossing in een 7-mL glas Scintillatie flesje (volledig die betrekking hebben op het slakkenhuis) plaatsen. 'S nachts koelkast bij 4 ° C. Paraformaldehyde verwijderen en wassen met 1 x PBS bij kamertemperatuur.
- Verwijderen van PBS en volledig vullen van de buis met een 120-mM-oplossing van EDTA (pH 7.3). Plaats op een rotator op kamertemperatuur en laat ontkalking voor 2 tot 3 weken, dagelijks veranderen van de EDTA-oplossing.
4. Cryosectioning
- Na de voltooiing van botontkalking, dompel volledig het slakkenhuis in de volgende oplossingen (7 mL elk) gedurende 24 uur bij 4 ° C: 10 gewichtspercenten sacharose, 20% sucrose, 1:1 mengsel van 20 gewichtspercenten sacharose en optimale scherpe temperatuur (OCT), samengestelde insluiten.
- Plaats verse OCT samengestelde te vullen en volledig bedekt het slakkenhuis in een 15 mm x 15 mm x 5 mm beschikbare schimmel te embedding. Oriënteren het slakkenhuis op zijn kant zodat er parallel aan de onderkant van de insluiten schimmel, zoals beschreven door Whitlon et al. 14
- Plaats direct de schimmel op droog ijs stollen van de LGO en opslaan bij-80 ° C's nachts.
- Onderdompelen van Microscoop dia's in 0.01% Poly-L-Lysine bij kamertemperatuur voor 30 min. verwijderen de dia's niet spoelen en laat droog 's nachts. Gebruik deze dia's voor cryosecties.
- Verwijder het slakkenhuis in LGO uit de diepvries-80 ° C en plaats het op droog ijs. Met behulp van een scherpe microtoom mes (L x b: 80 mm x 8 mm, dikte 0,25 mm, snij hoek van 34 °), afdeling de OCT blokken op 10 µm met behulp van een cryostaat op-30 ° C. Twee secties per dia plaats.
- Koelkast dia's bij 4 ° C wanneer u klaar bent.
5. Immunohistochemistry
- De dia's in een glasplaatje Microscoop kleuring van schotel op het rek van een dia plaatsen. Vul de schotel met 350 mL 1 x PBS en de dia's gedurende 5 minuten wassen drie keer bij kamertemperatuur.
- De dia's te verwijderen van de schotel en droog uit de omgeving van het weefsel met een droog doekje, zeker niet te drogen uit het weefsel.
- Met een vloeibare blokkerende pen, teken een cirkel rond het gedeelte van het weefsel.
- Blokkeren het weefsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur door het toevoegen van 150 µL van blokkerende oplossing met 10% normaal (ezel) serum, nonionic wasmiddel 1% en 1% BSA in 1 x PBS.
- Tik uit overtollige blokkerende oplossing en Incubeer het weefsel 's nachts bij 4 ° C in een bevochtigde kamer met 150 µL van 10% normaal (ezel) serum, 0,1% nonionic wasmiddel en primair antilichaam (Zie de onderstaande opmerking) in 1 x PBS.
Opmerking: Voor de volgende antistoffen, deze verdunningen werden gebruikt: voor Figuur 2 en 3, p-STAT1 Ser727 1:300. Voor Figuur 4, p-STAT1 Ser727, 1:100 en TRPV1 1:100. - De dia's in het glas microscoopglaasje kleuring schotel op een dia rack plaatsen. Vul de schotel met 350 mL 1 x PBS en dia's voor 5 min drie keer wassen bij kamertemperatuur.
- Incubeer met de secundaire antilichamen verdund in een oplossing met 0,01% nonionic wasmiddel en 10% normaal (ezel) serum in 1 x PBS gedurende 2 tot 3 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde zaal in het donker.
Opmerking: Voor de volgende secundaire antilichamen, deze verdunningen werden gebruikt: voor Figuur 2 en 3, Donkey anti-konijn IgG 1:600. Figuur 4, Rhodamine (TRITC) Donkey anti-konijn IgG 1:500 en Donkey anti-geit IgG 1:500. - De dia's in het glas microscoopglaasje kleuring schotel op een dia rack plaatsen. Vul de schotel met 350 mL 1 x PBS en dia's voor 5 min drie keer wassen bij kamertemperatuur.
- Tik op overtollige vocht van de dia wegslepen en drogen van de dia met een droog doekje rond het weefsel. Mount dia's door toevoeging van een druppel van de agent van de montage met DAPI rechtstreeks op het weefsel. Langzaam plaats van het dekglaasje aan bovenop, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden gevormd onder, en laat de dia's te genezen overnachten bij kamertemperatuur in het donker. Winkel dia's bij 4 ° C.
- Het imago van dia's met behulp van de confocal microscopie. Gebruik van lasers voor imaging-als volgt: UV laser voor DAPI, 488 nm laser voor Donkey anti-konijn IgG en 543 nm laser voor rhodamine TRITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR reacties gemeten bij ratten op drie dagen volgende cisplatine administratie een aanzienlijke verhoging in drempels toonde. Hoogte van deze drempels was aanzienlijk verminderd bij ratten toegediend met trans-tympanic [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosine een1 receptor agonist15, vóór cisplatine. Het specifieke karakter van het optreden van R-PIA op de adenosine receptor van een1 werd aangetoond door de observatie dat het werd tegengewerkt door 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX), een A1 specifieke receptor antagonist16. Deze drug Potentiation cisplatine-geïnduceerde ABR drempel verschuivingen(Figuur 1). Vergelijkbaar met het effect van de productie van gehoorverlies, cisplatine stegen ook de verlies/schade aan de buitenste haarcellen (beoordeeld door scanning elektronen microscopie [SEM]) (Figuur 1B). SEM beelden werden verkregen als eerder beschreven17. Dit effect werd aanzienlijk verminderd door trans-tympanic administratie van R-PIA (Figuur 1C). Bovendien tonen we dat trans-tympanic R-PIA vermindert basale en cisplatine-geïnduceerde p-STAT1 immunoreactivity in het slakkenhuis, als gevolg van de anti-inflammatoire eigenschap van deze drug (Figuur 2).
De trans-tympanic route kan ook worden gebruikt voor het beheren van biologics zoals siRNAs, waardoor de gunstige effecten. Trans-tympanic beheer van STAT1 siRNA aan ratten effectief verlagingen van de STAT1 en p-STAT1 en de activering van deze transcriptiefactor geblokkeerd door cisplatine (Figuur 3).
Bijkomende studies tonen aan dat toediening van de trans-tympanic van een andere siRNA voor de mRNA NOX3 verlaagd het vermogen van drugs zoals capsaïcine te verhogen van sommige downstream bemiddelaars, zoals voorbijgaande receptor potentiële vanilloid 1 kanaal (TRPV1) en p-STAT1 ( Figuur 4). Deze bemiddelaars zijn betrokken bij de capsaïcine-geïnduceerde hoorzitting verlies18.
Figuur 1: Trans-tympanic beheer van R-PIA verminderd cisplatine-geïnduceerd gehoorverlies en beschermd tegen verlies van de buitenste haarcellen. A. ABR drempels werden gemeten in ratten vóór en 72 uur na de behandeling met cisplatine (11 mg/kg, i.p.) na toediening van de trans-tympanic van R-PIA of DPCPX + R-PIA. Cisplatine-geïnduceerde hoogte van ABR drempel bleek te worden verzwakt door de A1AR agonist, R-PIA. Co-beheer van de A1AR antagonist, DPCPX, het effect van R-PIA omgekeerd op ABR drempel en aanzienlijk verhoogde die de ABR verschuivingen geproduceerd door cisplatine helemaal de frequenties getest. De pijl geeft nul ABR drempel shift. B. cisplatine behandeling bleek aanzienlijke schade aan de buitenste haarcellen (Kopklep) (witte pijl), zoals aangetoond door het scannen van elektronen microscoop (SEM). R-PIA beschermd de OHCs tegen cisplatine veroorzaakte schade, terwijl DPCPX het beschermende effect van R verzwakt-PIA. C. het staafdiagram toont de kwantitatieve analyse van de beelden van de SEM in Bweergegeven. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde. Sterretjes (*) en (*) geven een statistisch significant verschil van voertuig of cisplatine behandeling in groepen, respectievelijk, terwijl (*) een statistisch significant verschil van R geeft-PIA + cisplatine behandelde ratten (p < 0,05, n = 5). Dit cijfer werd aangepast van Kaur et al. 19 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Trans-tympanic beheer van een1AR-Agonist, R-PIA, verminderd cisplatine-verhoogd p-STAT1 Immunoreactivity in het slakkenhuis. Ratten werden toegediend een intraperitoneaal dosis van cisplatine (11 mg/kg), die verhoogd p-STAT1 Ser727 immunoreactivity, beoordeeld op 72 h post drug administration. Echter 1 h voorbehandeling met trans-tympanic R-PIA afgerond deze toename in p-STAT1 immunoreactivity. Gezamenlijke behandeling van de A1AR antagonist, DPCPX, samen met agonist omgekeerd de remming van de p-STAT1 immunoreactivity. Blauwe vlekken vertegenwoordigt DAPI gebeitste kernen, terwijl p-STAT1 immunolabeling groene kleuring vertegenwoordigt. Kopklep vertegenwoordigen DC en buitenste Haarcel en Deiter van de cel, respectievelijk. Witte pijlen geven aan dat de drie rijen van de OHCs. Schaal balk weergegeven in het lagere linker paneel is 10 µm. Dit cijfer werd aangepast van Kaur et al. 19 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Trans-tympanic beheer van STAT1 siRNA niveaus geblokkeerd cisplatine-geïnduceerde p-STAT1. Cochleair secties geïsoleerd van ratten toegediend met cisplatine (11 mg/kg, i.p.) voor 72 h toonde verhoogde Ser727 p-STAT1 immunoreactivity in OHCs. Voorbehandeling met trans-tympanic STAT1 siRNA (0.9 mg) verzwakt cisplatine-geïnduceerde toename van p-STAT1 immunoreactivity, overwegende dat krabbelde behandeling toonden geen effect. Blauwe vlekken vertegenwoordigt DAPI gebeitste kernen, terwijl p-STAT1 immunolabeling groene kleuring vertegenwoordigt. Witte pijlen geven aan dat de drie rijen van de OHCs. De bar van de schaal weergegeven in het onderste rechterdeelvenster meet 10 µm. Dit cijfer werd aangepast van Kaur et al. 20 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Trans-tympanic injectie van NOX3 siRNA vermindert TRPV1 en p-STAT1 niveaus in het slakkenhuis Rat. Narcose ratten werden door de overheid gereguleerde gecodeerde siRNA (scramble) of NOX3 siRNAs door de trans-tympanic injecties, die werd twee dagen later gevolgd door trans-tympanic injecties van capsaïcine voor 24 h. geïsoleerde cochleae van deze dieren waren gebeitst voor p-STAT1 Ser727 en TRPV1 immunoreactivity. Capsaïcine toegenomen zowel TRPV1 (groen) en p-STAT1 Ser727 (rood) immunoreactivity op 24 h in stria vascularis (SVA), buitenste haarcellen (Kopklep) en spiraal peesknoopcellen (SG). Dieren voorbehandeld met NOX3 siRNA bleek echter niet alle zichtbare inductie van p-STAT1 Ser727 en TRPV1 immunolabeling. Schaal staven (lagere rechter paneel) 50 en 10 µm voor inzetstukken. Dit cijfer werd aangepast van Mukherjea et al. 18 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De route van de trans-tympanic administratie zorgt voor gelokaliseerde levering van drugs en andere agenten aan het slakkenhuis die significante systemische bijwerkingen als systemisch toegediend anders kon produceren. Deze wijze van toediening van de drug biedt snelle toegang van drugs op de site van actie bij aanzienlijk hogere doseringen dan zou kunnen worden bereikt door de systemische route. Resultaten hier gepresenteerd en gepubliceerd eerder toonden aan dat trans-tympanic beheer van [R] - N - fenyl isopropyl adenosine (R-PIA) beschermd het slakkenhuis van buitenste Haarcel cisplatine-geïnduceerde verlies (Figuur 1)19 en inductie van ontsteking zoals aangetoond door verminderde activatie van transcriptiefactor STAT1 (in vergelijking met die behandeld met cisplatine of R-PIA + DPCPX + cisplatine) (Figuur 2)19. Deze voordelen kunnen bijdragen tot de bescherming van gehoorverlies die worden geboden door deze drug. Op basis van eerdere ervaringen, beweren we slechts één drug administration nodig is. Dit kan erop wijzen dat de drug wordt bewaard in het middenoor en kon langzaam worden overgenomen in het slakkenhuis om de drie dagen die deze dieren worden beoordeeld voor ototoxiciteit bescherming te bieden. Deze techniek wordt momenteel gebruikt om andere drugs in het binnenoor om te bepalen hun werkzaamheid als oto-protectants.
Naast geneesmiddelen, kan trans-tympanic beheer van siRNAs bieden effectieve knockdown van selectieve RNAs te reduceren van hun eiwitniveaus en bieden oto-bescherming18,20. Nogmaals, zou deze siRNAs minder toxicities bieden, als ze worden geleverd in de nabijheid van het slakkenhuis. De duur van het knockdown werd tot drie dagen (de limiet van onze beoordelingsperiode). Nog belangrijker is, blokkeert de toevoeging van siRNAs de inductie van hun overeenkomstige eiwit door ototoxische drugs, zoals cisplatine. De duur van het knockdown is enigszins verwonderlijk gezien de overvloed van nucleasen in extracellulaire vloeistof, en in cellen en de potentiële moeilijkheden bij het verkrijgen van deze moleculen in cochleaire cellen. Demonstratie van beide knockdown van eiwitten en oto-bescherming zou echter betekenen dat deze siRNAs zijn het bereiken van het slakkenhuis in effectieve concentraties.
Ondanks de voordelen die hierboven beschreven, zijn bepaalde beperkingen van deze techniek verwacht. Het gaat hierbij om de behoefte aan anesthetizing van de proefdieren vóór het opstarten van de procedure. Drugs moeten worden toegediend bij hogere concentraties in het middenoor, aangezien slechts een klein deel (~ 1-10%) naar verwachting bereiken van de perilymph. Bovendien, is de verdeling van de toegepaste drugs of biologicals meer geconcentreerd op het honk waar de grootste effecten worden waargenomen.
Terwijl trans-tympanic levering van agenten die hier gepresenteerd beperkt tot ratten was, kan een soortgelijke methode voor drug delivery prophylactically worden gebruikt bij patiënten die chemotherapie met geneesmiddelen zoals cisplatine verwachten. Verwacht wordt dat deze methode van drug levering snel kon worden aangenomen voor de mens om het scherm van een groot aantal verbindingen die werkzaamheid is gebleken in de behandeling van drug-geïnduceerd gehoorverlies bij proefdieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflict verklaard.
Acknowledgments
Het werk in dit artikel beschreven werd gesteund door een NCI RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC 002396 en RO3 DC011621.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J. Subclasses of external adenosine receptors. Proc Natl Acad Sci. 77 (5), 2551-2554 (1980).
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
