Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Pentylenetetrazole-indusert Kindling musemodell

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56573
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Summary

Dette beskriver en metode for kjemiske kindling med pentylenetetrazole og gir en musemodell av epilepsi. Denne protokollen kan også brukes til å undersøke å anfall induksjon og patogenesen etter epileptiske anfall i mus.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) er en GABA-A reseptor antagonist. En intraperitoneal injeksjon av PTZ i et dyr induserer en akutt, alvorlig beslag på en høy dose, mens sekvensiell injeksjoner av en subconvulsive dose har blitt brukt for utvikling av kjemisk veden, en epilepsi modell. En enkelt lavdose injeksjon av PTZ induserer en mild anfall uten kramper. Imidlertid redusere repeterende lavdose injeksjoner av PTZ terskelen å fremkalle et convulsive anfall. Til slutt, kontinuerlig lavdose administrasjon av PTZ induserer en alvorlig tonisk-kloniske anfall. Denne metoden er enkel og allment gjeldende undersøke i Patofysiologien ved epilepsi, som er definert som en kronisk sykdom som involverer gjentatte beslag. Dette kjemikaliet veden protokollen forårsaker repeterende beslag i dyr. Med denne metoden ble å PTZ-mediert anfall eller graden av forverring av epileptiske anfall anslått. Disse fordelene har ført til bruk av denne metoden for screening anti-epileptisk narkotika og epilepsi-relaterte gener. Dessuten, er denne metoden brukt til å undersøke neuronal skade etter epileptiske anfall fordi histologiske endringer observert i hjernen til epileptiske pasienter vises også i hjernen til kjemisk-opptent dyr. Dermed er denne protokollen nyttig for praktisk produserer dyr modeller av epilepsi.

Introduction

Epilepsi er en kronisk nevrologisk lidelse som kjennetegnes av tilbakevendende beslag og påvirker ca 1% av folk. De underliggende mekanismene epileptogenesis og beslag generasjon i epilepsi pasienter kan ikke være fullt avklart i kliniske studier. Derfor kreves en passende dyr modell for studiet av epilepsi1.

En rekke dyr modeller av epilepsi har blitt brukt til å undersøke fysiologi av epilepsi og identifisere anti-epileptisk narkotika2,3. Blant disse modellene er farmakologiske anfall induksjon en felles metode som brukes til å generere en dyr modell for etterforskningen av patologi epilepsi4. Denne metoden er billig og enkel. Elektroden-mediert veden er også en vanlig metode, men kostnadene ved denne prosedyren er høyere, og metoden krever kirurgisk og elektriske ferdigheter å indusere repeterende beslag5.

Farmakologiske induksjon er også en fordel fordi tidsberegningen og antallet beslag er enkelt kontrolleres. Genetisk musen modeller som viser spontan beslag brukes også i studiet av epilepsi. Forutsi når og hvor ofte beslag oppstår i disse genetiske modellene kan imidlertid være umulig6. Et overvåkingssystem er krevde å observere epileptiske atferden til genmodifiserte mus6.

Kainic acid, pilokarpin og pentylenetetrazole (PTZ) er mye brukt som anfall-inducing narkotika7. Kainic syre er en Agonistiske for glutamat reseptorer pilokarpin aktiverer cholinergic reseptorer. PTZ er en gamma aminobutyric syre (GABA)-reseptor antagonist8. PTZ undertrykker funksjon hemmende synapser, fører til økt neuronal aktivitet. Denne forskriften forårsaker generalisert beslag i dyr9. En enkelt injeksjon kainic syre og pilokarpin kan forårsake akutt beslag, særlig statusen epilepticus (SE)10,11 og kainic syre - eller pilokarpin-mediert SE fremmer kronisk spontan og tilbakevendende beslag12 , 13. electroencephalographic (EEG) opptak og atferdsanalyse har indikert at spontan tilbakevendende beslag er observert en måned etter en enkelt injeksjon12,13. En enkelt injeksjon av en convulsive dose PTZ også induserer akutt anfall. Kronisk spontan beslag etter en enkelt injeksjon av PTZ er imidlertid vanskelig å fremme. Kronisk administrasjon av PTZ er nødvendig å indusere repeterende beslag14. I disse metodene er generering av repeterende beslag stand til å indusere en patologi mer lik som menneskelige epilepsi enn generasjon akutt beslag. Ved PTZ, hver injeksjon fremkaller et anfall, og anfall alvorlighetsgrad blir mer alvorlig på en gradvis måte med hver injeksjon. Til slutt, en enkelt lavdose PTZ injeksjon induserer en alvorlig tonisk-kloniske anfall. I denne fasen fremkaller hver injeksjon alvorlig anfall. I tillegg endre anfall ventetid og varighet også løpet av injeksjoner. Ventetiden til tonic anfall blir ofte kortere i den siste fasen av veden15. Videre er anfall forverring ledsaget av en langvarig anfall varighet16. Gransker molekylær mekanismen regulere anfall alvorlighetsgraden, er ventetid og varighet nyttig for screening anti-epileptisk narkotika17,18,19.

Beslag er vanligvis forårsaket av en enkelt systemisk administrasjon av PTZ og utvinning er veldig rask, innenfor 30 min4,5. Dermed er antallet beslag mer controllable i PTZ-kindling modellen. Imidlertid har EEG overvåking indikert at generalisert toppene kan bli sett opp til 12 h etter PTZ-mediert anfall20. Derfor bør dyr helst være under observasjon for 24 timer etter myoclonic eller tonic anfall21 for mer presise analyse av kindling mekanismer.

Administrasjonen av anti-epileptisk stoffer som ethosuximide, valproate, fenobarbital, vigabatrin og retigabine3, før eller etter PTZ injeksjon begrenser forverring av de anfall alvorsgrad3,22, 23. Tilsvarende vist knockout mus at mangel gener involvert i beslag forverring, som matrise metalloproteinase-924, FGF-2225 og neuritin26, seg å ha redusert anfall alvorlighetsgrad etter flere PTZ injeksjoner. I tillegg observere histopathological endringer etter epileptiske anfall er mulig med denne metoden. Hos pasienter med tinninglappen epilepsi er det typisk histologiske endringer i hjernen, som mosegrodd fiber spirende27,28, unormal granule Nevron migrasjon29, astrogliosis30, neuronal celle død i hippocampus31,32og hippocampus sklerose33. Lignende endringer er observert i epileptiske modell dyr. Blant de tilgjengelige metodene er PTZ-mediert kjemiske veden en god, reproduserbare og rimelig metode for å produsere en dyr modell av epilepsi. I en pilokarpin-mediert SE modell, beslag er vanskelig og mange mus dø eller unnlater å utvikle SE34. I kontrast, er dødelighet og beslag alvorlighetsgraden mer controllable i PTZ modellen. Dessuten PTZ er billigere enn kainic syre, og ferdigheter i musen hjernekirurgi kreves ikke for narkotika administrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen av de Tokyo Metropolitan Institutt for medisinsk vitenskap. Postnatal 8 - 16-uke-gamle mus anbefales. Innavlet belastning er akseptabelt for eksperimentet. C57BL/6 mus er mer motstandsdyktig mot PTZ, mens BALB/c og sveitsiske albino mus er mer følsomme for PTZ. C57BL/6 ble brukt i denne studien. Sårbarhet for PTZ avhenger også en alder av musen. Sammenlignet med yngre mus, er eldre mus mer gjenstridig å PTZ35. Antall dyr som brukes til denne metoden kan variere, men minst 6-10 dyr kreves for hver tilstand.

1. utarbeidelse av PTZ

  1. Oppløse 2 mg/mL PTZ i sterilt 0,9% (w/v) NaCl. Forberede PTZ ved bruk.

2. injeksjon av PTZ

  1. Utføre alle eksperimentene mellom 9:00 og 12:00 PM (formiddag).
  2. Måle dyrets kroppsvekt.
  3. Sett dyr i en observasjon kammer for habituering.
  4. Beregne volumet av PTZ løsning for injeksjon kroppsvekt dyret og den tidligere fastsatte injeksjon dosen under habituering-perioden (3 minutter).
    Merk: For eksempel når 35 mg/kg PTZ, 0.875 mg PTZ kreves for mus veier 25 g (35 mg / kg x 0.025 kg = 0.875 mg). Derfor 437.5 μL av en 2 mg/mL PTZ løsning skal settes inn (0.875 mg/2 mg / mL = 0.4375 mL). Injeksjon dosen av PTZ avhenger av musen genotype og belastning. En dose av 30-35 mg PTZ/kg kroppsvekt anbefales for vill-type C57BL/6 mus, for den første rettssaken. Følsomhet for PTZ avhenger av musen belastning brukes36,37. Injeksjon dosen varierer etter eksperimentet.
  5. Injisere PTZ intraperitoneally med en 1-mL sprøyte knyttet til en 27-gauge nål i den venstre eller høyre delen av magen på dyret. Unngå sprøytebruk på midtlinjen.
    1. Unngå gjentatte injeksjoner i samme posisjon.
  6. Observere dyrenes atferd i 30 min etter PTZ administrasjon (figur 1A), og klassifisere og score unormal atferd som vist nedenfor. Hvis mulig, holde dyr under observasjon for 24 timer, eller minst en ytterligere 6-10 h etter injeksjon, spesielt når anfall alvorlighetsgrad score når 3 eller nyere.
    1. Merk en mild anfall eller opptreden endre inne dyrene utover 30-min observasjon perioden. Dette langvarig observasjon periode kan ta en spesielt viktig og komplett effekten av en subconvulsive dose PTZ i generasjon av kronisk uprovosert beslag i epilepsi.
    2. I tillegg mål anfall varigheten av hver observert beslag som endringer i beslag varighet knyttet til beslaget alvorlighetsgraden. Videre er er ventetiden til første beslaget etter PTZ injeksjon et annet viktig mål å samle. Overvåking av beslag frekvens, varighet og ventetid er avgjørende for noen etter anfall molekylære studier.
  7. Injisere PTZ annenhver dag (figur 1A). Antall injeksjoner, avhenger av målet med forsøket. Eksemplene er som følger:
    1. For å generere helt opptent ferdig dyr, når et dyr opplever et anfall med en score på 5 (tonisk-kloniske anfall), injeksjon i ytterligere tre administrasjoner. I dette tilfellet øke injeksjon dosen Hvis beslag score ikke øker for tre påfølgende administrasjoner. Hvert dyr får et annet nummer og dose PTZ injeksjoner.
    2. Fastsette antall og dose PTZ injeksjon i hver stand til å vurdere sårbarheten til PTZ, inkludert i vurderinger av anti-epilepsi narkotika og studier av fenotypen av genmodifiserte mus. Gi alle dyr samme antall PTZ injeksjoner; totalt 8 til 12 injeksjoner anbefales. Hvis et dyr dør, bør beslag score være angitt som 6.
    3. Bestemme injeksjon dose nødvendig for å opprettholde en høy anfall scorer (4 eller 5) for 10 eller flere injeksjoner for å studere histopathological endringer som oppstår epileptiske anfall. I dette tilfellet skal totale injeksjon nummeret varierer fra 25 til 30. Redusere injeksjon dosen Hvis beslag score når 5. Hvis beslag score synker til 3 eller lavere, øke dosen injeksjon.

3. anfall Score

  1. Observere dyr atferd og spille inn poengsummen.
    1. Klassifisere og score epileptiske atferd som følger38,39 (figur 1B):
      0: normalt, ingen abnormitet.
      1: immobilisering, liggende på magen.
      2: hodet nikker, ansikts, forlemen eller hindlimb myoclonus.
      3: kontinuerlig hele kroppen myoclonus, myoclonic jerks, hale holdt stivt.
      4: oppdrett, tonic beslagleggelse, faller ned på siden.
      5: tonisk-kloniske anfall, faller ned på ryggen, vill rushing og hoppe.
      6: død.
  2. Endre de opptreden vilkårene basert på Racine score40, avhengig av eksperimentelle forhold.

4. etter anfall analyse

  1. Immunohistopathological analyse
    1. Perfusjon fiksering
      1. Forberedelse
        1. Oppløse 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) inne 0.1 M fosfatbuffer (pH 7.4). Varme løsningen på ca 70 ° C med tillegg av en dråpe 1 M NaOH (ca 1 µL av 1 M NaOH 50 mL PFA løsning).
        2. Forberede iskald 4% PFA og fosfat-bufret saltvann (PBS).
        3. Definere en peristaltiske pumpe, en rør og nål. Kjør ca 20 mL vann gjennom røret for å fjerne rester. Deretter plassere den åpne enden av røret i iskalde PBS.
      2. Transcardial perfusjon og utarbeidelse av fast hjernen
        1. Dypt bedøve musen med 50% isoflurane/50% etanol i en liten krukke.
        2. Hold musen i supine posisjon ved låsing tips av deres forelimbs og hindlimbs.
        3. Skjær ventrale midtlinjen av magen og utsette mellomgulvet.
        4. Skjær membranen langs kyst margen. Deretter klippet lateral begge ribbeina og kroppen. Knip xiphoid prosessen med låse tang og evert ribbe buret. Opprettholde plasseringen av xiphoid prosessen ved å feste det med en nål eller klemme den med tang. Utsett hjertet.
        5. Sett inn nålen i venstre ventrikkel og gjøre et kutt i høyre atriet med saks. Vær oppmerksom på ikke å presse nålen langt hjertet, som det kan punkteres en indre vegg.
        6. Starte en jevn strøm av iskalde PBS gjennom nålen bleke blodet (ca 15-20 mL/min).
        7. Når blodet har fjernet fra kroppen, flytte røret til en 4% paraformaldehyde løsning (ca 60 mL) uten tilsetning av bobler. Deretter stopp perfusjonen.
        8. Skjær bak nakken og ryggen og løsner hodet huden og dorsal del av skallen med dissekere saks.
        9. Skjær premaxillary benet mellom øyet banene og fjerne dorsal delen av skallen.
        10. Opprett et gap mellom hjernen og jugal bein fra den bakre siden og klippe trigeminal nerve og optikk chiasm under hjernen. Nøye fjerne hjernen og plasserer den i en flaske som inneholder 4% PFA. Etter fikse hjernen på 4 ° C for 12-16 h.
    2. Hjernen stykke forberedelse
      1. Overføre fast hjernen til 20% sukrose/PBS til hjernen vasker i løsningen å tillate cryoprotection.
      2. Kuttet fast hjernen basert på nødvendig stykke orientering og nødvendig del av hjernen.
      3. Angi cryomicrotome. Bladet i posisjon og opprettholde mikrotomen scenen ved en temperatur under 20 ° C.
      4. Plasser pre-cut hjernen på scenen og pels hjernen med 20% sukrose/PBS. Sukrose/PBS løsningen vil gradvis fryse, dekker hjernen på scenen, inntil hjernen er fullstendig innebygd i frosne 20% sukrose/PBS.
      5. Skjær hjernen (30 µm tykkelse) ved å skyve bladet gjennom vev. Overføre skiver til PBS og holde dem i 4 ° C.
    3. Fluorescerende immunohistochemistry
      1. Vask nødvendig skiver på 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) i 10 minutter, 3 ganger ved romtemperatur (RT).
      2. Blokkere skiver av rugende dem i PBST med 2% geit serum- eller 5% bovin serum albumin (BSA) for 1-2 h på RT.
      3. Inkuber sektorene i et antistoff løsning med egnet konsentrasjonen av primære antistoff PBST med 2% geit serum- eller 5% BSA for 1 til 7 overnattinger på 4 ° C.
      4. Vaske skiver i PBST i 10 minutter, 3 ganger på RT.
      5. Inkuber sektorene i en sekundær antistoff løsning med egnet konsentrasjonen av sekundær antistoff PBST 1-2 h på RT, lys-beskyttet.
      6. Montere skiver på glass lysbilder og dekk med montering medium og dekke glass.
      7. Observere skiver med fluorescens mikroskopi.
  2. Tre-kammer test
    1. Forberedelse
      1. Forbered minst 2 2-6-måneden-gamle 129/Sv mus av samme kjønn som emnet musene skal "fremmed mouse." Venne alle mus i buret før analysen. For hver treningsøkt, plasserer musen i buret og drar musen i 15 min.
      2. Før hver habituering fase med emnet musen, rengjør du hele apparatet og begge bur ved å tørke overflaten med 70% etanol.
      3. Plasser tom merdene i to kamre av 3-kammer apparater og åpne dørene mellom kammer.
      4. Venne emnet musen, plasserer musen emnet i midten kammeret og tillate musen fritt flytte hele apparatet til musen har undersøkt både bur, pluss en ekstra 5 min. emnet dyr som kan være redd for byrået ikke undersøke buret for 20 min, og burde ikke bli brukt for denne analysen. Slike dyr unngå buret og sjelden komme nær buret.
      5. Når Dyret seg inn i midten kammeret, lukke dørene og la musen flytte fritt i midten kammeret for 5 min. I denne perioden, kan du sette en av 129/Sv mus i bur å venne til buret.
    2. Sosialitet analyse
      1. Utføre denne analysen umiddelbart etter habituering perioden temaet musens.
      2. Plasser byrået som inneholder 129/Sv mus, kalt "Stranger 1 buret", i en av siden kamre og plassere tom buret, kalt "objekt buret", i det andre siden kammeret.
      3. Åpne døren og for emnet musen.
      4. Tillate Emnet musen til å flytte fritt for 10 min og registrere følgende atferdsmessige parametere. Hvis emnet musen er redd for musen i fremmed 1 byrået, som indikert av musen unngå fremmed 1 buret og igjen i hjørnet av en av kamre, bør dyr ikke brukes for analyse.
        a) tid brukt i hvert kammer, fremmed 1 kammeret, objektet kammer og midten kammeret.
        b) tid brukt undersøker hver bur, fremmed 1 buret og objektet buret. (Musen er klassifisert som etterforsker byrået Hvis musen er sniffing eller toughing musen eller bur)
        c) antall innganger i hvert kammer (valgfritt)
        d) total avstand reist (valgfritt)
      5. Når musen beveger seg inn i midten kammeret, Lukk dørene.
    3. Sosiale nyhet analyse
      1. Utføre denne analysen umiddelbart etter sosialitet analysen.
      2. Tørk både bur med 70% etanol.
      3. Sett en annen 129/Sv mus i en av merdene, kalt "Stranger 2 buret" og sted den fremmede 2 bur i ett av kamre. Plasser fremmed 1 musen i andre buret, kalt "Stranger 1 buret", og plassere fremmed 1 buret i andre kammeret.
      4. Åpne døren og for emnet musen.
      5. Tillate Emnet musen til å flytte fritt for 10 min, og måle samme atferdsmessige parameterne som beskrives for sosialitet analyse.
        Merk: Fremmed 1 og fremmed 2 musen bør velges tilfeldig. Fremmed 1 kammeret og objektet kammer som fremmed 1 kammer og fremmed 2 kammer bør tilfeldig fastsettes.
  3. Kontekstuelle frykt diskriminering
    1. Condition
      1. Før hver condition rettssaken, rent eksperimentelle apparatet ved å tørke overflaten med 70% etanol.
      2. Plasser musen i en condition apparater med bestemte betingelser (apparater form, vegg farge, gulvet materiale, lukt, belysning og bakgrunn støy volumet bør være forhåndsbestemt). For eksempel var condition apparater her en firkantet apparater med klart plexiglass vegger, et metall rutenett gulvet, etanol lukt, 100 lux lysstyrke, og 65 dB-bakgrunn hvit støy.
      3. Tilstand musen av fot-sjokk med pseudo-tilfeldig timing av 0.1-mA elektrisk sjokk for 2 s x 3 ganger i løpet av 5 minutter.
      4. Tilbake musen hjem buret etter condition.
    2. Minne vurdering
      1. Før hver vurdering, rent eksperimentelle apparatet ved å tørke overflaten med 70% etanol.
      2. Neste dag følgende condition, plassere musen i samme apparatet som sjokk betingelse og måle frysing tid i løpet av 5 minutter.
      3. Senere samme dag, Plasser musen i en roman apparater og måle fryse tiden under en 5-min vurdering. En trekantet apparater med hvit plexiglass vegger, plate gulvet, ingen lukt, 30 lux lysstyrke og 70 dB-hvit støy ble brukt her.
      4. Sammenligne fryse tiden mellom de samme tilstand og romanen tilstand. Mus med en vanlig hukommelse evne vil fryse mer i samme stand enn romanen tilstanden. Frysing er definert ubevegelighet av dyret for mer enn 2 s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repeterende injeksjon av PTZ induserer en økning i beslag alvorlighetsgrad. Seks C57BL/6 mus ble behandlet med PTZ, og en annen 6 mus ble behandlet med saltvann som en kontrollgruppe. PTZ dosen var 35 mg/kg, og 10 injeksjoner ble administrert. Anfall score gradvis økt med PTZ injeksjoner, mens ingen anfall eller unormal atferd ble vekket av saltvann injeksjoner (figur 2). ANOVA etterfulgt av Bonferroni test viste en signifikant forskjell mellom gruppen PTZ-behandlet og gruppen saltholdig-behandlet.

Repeterende anfall fremmer avvikende axonal gren dannelse (mosegrodd fiber spirende) og unormale migrering av granule celler prefiks. Mus ble behandlet med PTZ for 25 injeksjoner (dose ble justert mellom 24 mg/kg og 35 mg/kg å opprettholde alvorlig anfall i mus uten å indusere død skyldes et alvorlig anfall). Musen hjernen ble løst 3 uker etter siste injeksjon. Kontroll hjernen ble løst før PTZ injeksjoner. Hjernen skiver var immunostained med anti-synaptoporin (x 500) og anti-ZnT3 (x 500) antistoffer å observere mosegrodd fiber spirende (figur 3A) og med anti-doublecortin antistoffer (x 200) å observere unormal migrering av granule celler ( Figur 3A). Mosegrodd fiber spirende i granule celle laget ble observert i PTZ-behandlet skiver (figur 3A). Nyfødte granule celler, som er immunoreactive for doublecortin, ble observert i hilus i PTZ-behandlet skiver (figur 3A). Det granule celle laget og hilus vist i figur 3A er illustrert i figur 3B.

Repeterende beslag også svekke normalt mus. Tolv C57BL/6 mus ble behandlet med PTZ (35 mg/kg, 10 injeksjoner), og en annen 12 mus ble behandlet med saltvann som en kontrollgruppe. To uker etter siste injeksjon, ble musene analysert i en 3-kammer test (figur 4A) og kontekstuelle frykt diskriminering test (figur 5A). PTZ-behandlet mus viste normale sosialitet (figur 4B). Mus tilbrakte mer tid i fremmed 1 kammeret enn i objektet kammer (saltvann: p = 0.003, PTZ: p = 0,027) og undersøkt fremmed 1 buret mer enn de har undersøkt objektet buret (saltvann: p = 0,009, PTZ: p = 0.004). Men PTZ-behandlet mus viste unormal sosial nyheten (figur 4C) indikativ svekket sosiale minne. Kontroll mus tilbrakte mer tid i fremmed 2 kammeret enn i fremmed 1 kammer og undersøkt fremmed 2 buret mer enn de har undersøkt fremmed 1 buret, mens opptent musene ikke viser noen signifikant forskjell i tid brukt i kamrene eller tidsbruk undersøker merdene (tid i kammeret: saltvann: p = 0.006, PTZ: p = 0.126. Tiden undersøker: saltvann: p = 0,002, PTZ: p = 0.426). PTZ-behandlet mus viste også svekket minne i innholdsrettet frykt test (figur 5B). Kontroll mus viste lengre frysing tid i sjokk tilstand enn romanen tilstanden, mens PTZ-behandlet mus ikke viser noen signifikant forskjell i iskaldt tid (saltvann: p < 0,001, PTZ: p = 0.060). Kortet t-tester ble utført for statistiske analyser.

Figure 1
Figur 1: kort beskrivelse av protokollen. (A) skjematisk illustrasjon av PTZ-mediert kindling. (B) illustrasjoner av representant dyrenes atferd for respektive anfall score. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: vurdering av convulsive atferd. Gjennomsnittlig beslag score angis i diagrammet. Seks mus ble brukt i hver tilstand, og en serie av injeksjoner ble utført. Etter hver injeksjon, var beslag score overvåket og scoret. Sammenlignet med saltvann injeksjoner, PTZ injeksjoner betydelig økt anfall alvorlighetsgraden (p < 0,001: gjentatt-tiltak ANOVA). Partituret anfall vises som den gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: PTZ-mediert mosegrodd fiber spirende og unormale migrering av granule celler. (A) maksimalt anslått immunohistochemical bilder av hilus, granulat laget og molekylære laget av hippocampus skiver av musene før veden (venstre) og etter veden (høyre). Anti-synaptoporin (øverst) og anti-ZnT3 antistoffer (midten) ble brukt til å visualisere axons granule neurons (mosegrodd fiber). Anti-doublecortin antistoffer ble brukt til å visualisere nyfødte granule neurons (nederst). PTZ-mediert repeterende beslag indusere mosegrodd fiber spirende (piler) og unormale overføringen av granule celler i hilus (pilspisser). Skala bar, 50 μm. Den omtrentlige posisjonen til hvert bilde er angitt i (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: PTZ-mediert unormal sosial atferd. (A) skjematisk illustrasjon av 3-kammer testen. (B) betyr hvor mye tid brukt på hvert kammer og betyr mengden av tiden undersøker hver bur i sosialitet test vises. (C) betyr hvor mye tid brukt på hvert kammer og betyr hvor mye tid brukt undersøker hver bur i sosiale nyhet test vises. Det var tolv mus i begge PTZ - og saltvann-behandlet gruppene. PTZ-mediert beslag indusert unormal sosial atferd (*** p < 0,001, født = ikke signifikant). Alle tider vises som den gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: PTZ-mediert minne verdifall. (A) skjematisk illustrasjon av innholdsrettet frykt diskriminering testen. (B) mener andelen frysing ganger i hver betingelse vises. Det var tolv mus i begge PTZ - og saltvann-behandlet gruppene. Grafen viser gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en allment tilgjengelig protokoll for etablering av en farmakologisk dyr modell av epilepsi. PTZ-mediert kjemiske kindling har en lang historie og aksepterte modell for studiet av epilepsi41histopatologi og cellular patologi. Kjemisk kindling modell av epilepsi er anmeldt tidligere Suzdak og Jansen, 199542. Farmakologiske anfall induksjon, spesielt med PTZ, er en lett og enkel metode for fremkaller alvorlig anfall. Endringer i injeksjon dosen korrelerer med anfall alvorlighetsgrad. Dermed er identifisere den passende dosen over flere studier ved å endre PTZ dose og undersøke den resulterende atferden veldig enkelt.

Mange forskere har forsøkt å opprette knockout eller banke i mus som epilepsi modeller og har lyktes i å produsere mus som viser spontan beslag43,44. Farmakologiske anfall induksjon anses imidlertid fortsatt en god modell for epilepsi. En annen vanlig metode for anfall induksjon enn genet modifikasjon involverer implanting elektrodene i et dyr hjerne og inducing elektrosjokk-mediert beslag. Denne metoden er dyrt, vanskelig, og krever kirurgiske ferdigheter til implantatet elektroden på presis locus i hjernen5.

Kjemisk induksjon av kramper muliggjør rask etterforskning av epileptogenesis og anti-epileptisk narkotikarelaterte screening på lavpris2,4. Hyppigheten og alvorlighetsgraden av spontane beslag og SE varierer avhengig av stoffet brukes. Kainic syre og pilokarpin brukes hovedsakelig til å provosere SE og påfølgende kronisk spontan eller tilbakevendende beslag45,46,47. På den annen side, PTZ brukes både til å fremme SE når gitt i en høy dose og å utvikle kjemisk opptent dyr når gitt i en subconvulsive dose48,49. I tillegg er mekanismer av convulsive medikamenter som forårsaker beslag kjent. Dermed kan blokkerer mekanismen nødvendig å indusere anfall bidra til å identifisere anti-epileptisk narkotika. På den annen side, må genetisk modeller undersøke mekanismer som fremkalle epileptiske anfall50. Etter mekanismer som beslag er indusert er utredet, kan screening av anti-epileptisk narkotika startes.

Representant treff vises her, ble dyr atferd observert i 30 min etter PTZ administrasjon. Men som nevnt i delen protokollen, er dyr opptreden fortrinnsvis observert for 24 h eller minst 6-10 h etter PTZ injeksjon, spesielt når beslaget score når 3 eller høyere. Selv om et dyr overvåkingssystem må overholde dyret hele dagen, er en langvarig observasjon avgjørende for å få en dyp forståelse av epilepsi. I tillegg er anfall varighet og beslag ventetid nyttig tiltak for å samle. Disse målingene er viktig i forbindelse endringer i beslag varighet og latens tid og beslag alvorlighetsgrad.

Etter anfall histopatologi kjemisk opptent dyr har blitt undersøkt, spesielt i hippocampus. Repeterende anfall eller SE indusere mosegrodd fiber spirende27,28, unormal migrasjon nyfødte granule neurons25,29, astrogliosis i hippocampus30og apoptose av pyramidale nevroner 31 , 32. histologiske endringene i hjernen forstyrre nevrologiske funksjoner i epileptiske pasienter. For eksempel er foreningen av epilepsi med autism spectrum disorders (ASD) og intellektuelle handikap (ID) anerkjent51,52,53. Om epileptiske anfall indusere ASD og ID eller ASD og ID indusere epileptiske symptomer er fortsatt et komplisert spørsmål. Nyere studier har vist at PTZ-mediert beslag induserer ASD-lignende sosiale-kognitive impairments54 og ID-like lære underskudd 55,56,57. Disse funnene tyder på at epilepsi-mediert histopatologi utløser neuronal dysfunksjon og psykiske lidelser.

Histologiske endringer fremmes av epilepsi ta tid å utvikle etter anfall induksjon. I denne forbindelse er farmakologiske anfall induksjon en fordel fordi forskere kan styre timing, antall og alvorlighetsgrad av beslag i dyr. Inkludert kjemiske kindling, dyr modeller av epileptogenesis vil fortsette å fremme etterforskningen av både mekanismen av epilepsi induksjon og nevrofysiologiske lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av JSPS KAKENHI grant tall 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, og 17 K 07086, MEXT KAKENHI grant tall 25110737 og 23110525, AMED Grant tall JP18ek0109311, og SENSHIN forskningsstiftelse og i Japan Epilepsi Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  2. Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
  3. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  4. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  5. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. Models of Seizures and Epilepsy. , Academic Press. xvii (2006).
  6. Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
  7. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  8. Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
  9. Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
  10. Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, Suppl 5. 37-39 (2002).
  11. Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), discussion 353 306-313 (1999).
  12. Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
  13. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  14. Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
  15. Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
  16. Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
  17. Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
  18. Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
  19. Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs? Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
  20. Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
  21. Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657 (2013).
  22. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  23. White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, Suppl 7. 2-8 (2003).
  24. Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
  25. Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43 (2013).
  26. Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
  27. Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
  28. Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
  29. Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
  30. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  31. Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
  32. Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
  33. Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
  34. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
  35. Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
  36. Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
  37. Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
  38. Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
  39. Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience. 129 (3), 757-766 (2004).
  40. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  41. Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
  42. Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
  43. Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
  44. Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
  45. Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
  46. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
  47. Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
  48. Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscience. 159 (2), 735-743 (2009).
  49. Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
  50. Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, Suppl 4. 7-12 (2001).
  51. Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship? Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
  52. Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
  53. Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
  54. Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
  55. Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
  56. Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
  57. Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).

Tags

Nevrovitenskap problemet 136 kjemisk veden beslag epilepsi neural plastisitet dyr atferd histopatologi
Pentylenetetrazole-indusert Kindling musemodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shimada, T., Yamagata, K.… More

Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter