Summary
Этот протокол описывает метод химического растопки с pentylenetetrazole и предоставляет мышиной модели эпилепсии. Этот протокол также может использоваться расследовать уязвимость захват индукционные и патогенеза после эпилептические припадки у мышей.
Abstract
Pentylenetetrazole (PTZ) является антагонистом ГАМК-А рецепторов. Внутрибрюшинной инъекции PTZ в животное индуцирует острый, тяжелой захват в высокой дозе, в то время как последовательные инъекции subconvulsive дозы были использованы для разработки химического, блоки розжига, модели эпилепсии. Однократное введение малых доз PTZ индуцирует мягкий захват без судорог. Однако повторяющихся низкой дозы инъекций PTZ снизить порог вызывают судорожного приступа. Наконец непрерывной низкодозированные управление PTZ индуцирует тяжелой тонизирующий клонические захват. Этот метод является простым и широко применяются для изучения патофизиологии эпилепсии, который определяется как хроническая болезнь, которая включает повторяющиеся приступы. Это химическое вещество, разжигания протокол вызывает повторяющиеся судороги в животных. С помощью этого метода оценкам уязвимости PTZ-опосредованной изъятий или степень обострение эпилептические припадки. Эти преимущества привели к использованию данного метода для проверки Средства противоэпилептические и генов, связанных с эпилепсией. Кроме того этот метод был использован расследовать нейрональных повреждения после эпилептических припадков, потому что гистологические изменения, наблюдаемые в мозг больных эпилепсией, также появляются в мозг химических возгорелся животных. Таким образом этот протокол является полезным для удобно производить Животные модели эпилепсии.
Introduction
Эпилепсия является хронические неврологические расстройства, которое характеризуется периодические приступы и затрагивает приблизительно 1% людей. Основных механизмов формирования epileptogenesis и изъятие у больных эпилепсией не выяснен в клинических исследованиях. Таким образом является подходящей моделью животных требуется для изучения эпилепсии1.
Разнообразие животных моделей эпилепсии были использованы для изучения физиологии эпилепсии и выявления анти-эпилептических наркотиков2,3. Среди этих моделей фармакологические захват индукции это общий метод, используемый для создания модели на животных для расследования случаев патологии эпилепсии4. Этот метод является недорогим и простым. Электрод опосредованной растопку также часто используемый метод, но расходы на этой процедуры, выше, и метод требует хирургического и электрические навыки, чтобы побудить повторяющиеся приступы5.
Фармакологических индукции также выгодно, потому что легко контролируются сроки и количество изъятий. Генетическая мыши модели, которые exhibit спонтанные судороги используются также в изучении эпилепсии. Однако предсказать, когда и как часто судороги возникают в этих генетических модели может быть невозможным6. Система мониторинга требуется соблюдать эпилептические поведение генетически измененных мышей6.
Каиновая кислота, пилокарпин и pentylenetetrazole (PTZ) широко используются как захват заставить наркотиков7. Каиновая кислота является агонистом рецепторов глутамата, а пилокарпин активирует холинергических рецепторов. PTZ-это гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК)-антагонист рецепторов8. PTZ подавляет функцию тормозящее синапсы, приводит к увеличению активности нейронов. Это положение вызывает обобщенных изъятий в животных9. Одной инъекции Каиновая кислоты и пилокарпин может вызвать острые приступы, особенно статус эпилептический (SE)10,11 и Каиновая кислота - или пилокарпин опосредованной SE способствует хронической спонтанной и периодические приступы12 , 13. Энцефалографические (ЭЭГ) записи и анализа поведения указали, что спонтанное периодические приступы наблюдаются через месяц после однократной инъекции12,13. Одной инъекции судорожными дозы PTZ также вызывает острый захват. Однако трудно содействовать хронический спонтанные судороги после однократной инъекции PTZ. Хронический управление PTZ требуется навести повторяющиеся приступы14. В любом методе поколение повторяющиеся приступы способен побудить больше похожи на что человека эпилепсии, чем поколение острые приступы патологии. В случае PTZ каждой инъекции вызывает захват, и захват тяжести становится более серьезным образом поэтапно с каждой инъекции. Наконец одной инъекции PTZ низких доз вызывает тяжелых тонизирующий клонические захват. В этой фазе каждый инъекций вызывает серьезные судороги. Кроме того Задержка захвата и продолжительность также изменить течение инъекции. Задержка захвата тоник часто становится короче на последнем этапе разжигания15. Кроме того захват обострения сопровождается длительной захват продолжительность16. Исследуя молекулярный механизм, регулирующий серьезность захват, задержка и продолжительность полезен для скрининга анти-эпилептических наркотиков17,18,19.
Приступы часто индуцированных единого системного управления PTZ, и восстановление очень быстро, в течение 30 мин4,5. Таким образом количество изъятий более управляема в модели PTZ-растопку. Однако ЭЭГ-мониторинг указал, что обобщенные пики могут рассматриваться до 12 ч после PTZ-опосредованной захвата20. Таким образом животные предпочтительно должен оставаться под наблюдением за 24 ч после миоклоническая или тонизирующим захват21 для более точного анализа механизмов растопку.
Администрация анти-эпилептических наркотиков, таких как этосуксимид, вальпроат, фенобарбитал, Вигабатрин и retigabine3, до или после инъекции PTZ снижает опасность обострения захват тяжести3,22, 23. Аналогичным образом было показано нокаут мышей, что отсутствие генов участвует в захват обострения, например матрицы металлопротеиназы-924, FGF-2225 и neuritin26, демонстрируют снижение захвата тяжести после нескольких PTZ инъекции. Кроме того наблюдая гистопатологические изменения после эпилептические припадки возможен с помощью этого метода. У больных с височной эпилепсией есть типичные гистологические изменения в головном мозге, например моховые волокна прорастают27,28, Аномальные гранул нейрон миграции29, astrogliosis30, нейрональные клетки смерть в гиппокампе31,32и33склероз гиппокампа. Аналогичные изменения наблюдаются в эпилептические модель животных. Среди доступных методов PTZ-опосредованной химических растопку является хорошим, воспроизводимые и недорогой способ получения животной модели эпилепсии. В модели пилокарпин опосредованной SE захват управления трудно и много мышей умрет или не развивать SE34. В отличие от этого смертности и тяжести захват более управляемой в модели PTZ. Кроме того PTZ является менее дорогостоящим, чем Каиновая кислоты, и для введения препарата не требуются навыки в хирургии мозга мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были утверждены животное уход и использование Комитета Токио Метрополитен института медицинских наук. Послеродовые 8 - рекомендуется 16-week-old мышей. Все инбредных деформации является приемлемым для эксперимента. Мышей C57Bl/6 более устойчивы к PTZ, тогда как альбинос мышей BALB/c и Швейцарии более чувствительны к PTZ. В этом исследовании были использованы C57Bl/6. Уязвимость для PTZ также зависит от возраста мыши. По сравнению с молодых мышей, старых мышей более тугоплавкие, PTZ-35. Количество животных, используемых для этого метода может варьироваться, но по крайней мере 6-10 животных требуются для каждого условия.
1. Подготовка PTZ
- Растворите PTZ 2 мг/мл стерильного 0,9% (w/v) NaCl. Подготовьте PTZ в день использования.
2. инъекции PTZ
- Выполните все эксперименты с 9:00 до 12:00:00 (полдень).
- Измерение массы тела животного.
- Поместите животное в камеру наблюдения для привыкания.
- В период привыкания (3 мин) рассчитайте объем PTZ раствор для инъекций, на основе массы тела животного и ранее определенных инъекций доза.
Примечание: например, когда используется 35 мг/кг PTZ, 0.875 мг PTZ требуется для мыши, массой 25 г (35 мг / кг x 0,025 кг = 0,875 мг). Таким образом, следует вводить 437.5 мкл раствора PTZ 2 мг/мл (0,875 мг/2 мг / мл = 0.4375 мл). Инъекций доза PTZ зависит от генотипа мыши и процедите. Для дикого типа мышей C57BL/6 30-35 мг PTZ/кг веса тела рекомендуется для первого судебного разбирательства. Чувствительность к PTZ зависит от мыши используется напряжение36,37. Инъекций доза зависит от цели эксперимента. - Придать внутрибрюшинно PTZ с 1 мл шприц, прикрепленных к 27-иглы в левый или правый квадранте живота животного. Избегайте инъекций в средней линии.
- Избегайте повторные инъекции на той же позиции.
- Наблюдать за животного поведения для 30 мин после приема PTZ (рис. 1а) и классификации и оценка ненормальное поведение, как показано ниже. Если это возможно Держите животных под наблюдением 24 часа, или по крайней мере дополнительные 6-10 ч после инъекции, особенно после того, как оценка тяжести изъятия достигает 3 или выше.
- Примечание любой мягкий судороги или поведенческие изменения в животных за период наблюдения 30-мин. Это длительное наблюдение, что период может выступать особенно важными и полный эффект subconvulsive дозы PTZ в поколении хронической неспровоцированных припадков эпилепсии.
- Кроме того мера захват продолжительность каждого наблюдаемого захват как изменения в продолжительности захвата относятся захват тяжести. Кроме того задержка первый захват после инъекции PTZ является еще одной важной мерой для сбора. Контроль за захват частоты, длительности и задержка имеет решающее значение для любого после захвата молекулярных исследований.
- Придать PTZ каждый день (рис. 1A). Количество инъекций зависит от цели эксперимента. Показательными примерами являются следующие.
- Для создания полностью растопленном животных, как только животное испытывает захват с счетом 5 (тонизирующий клонические захват), закончить инъекции в течение еще трех администраций. В этом случае увеличивайте дозу, инъекции, если захват оценка не увеличивается за три последовательных администраций. Каждое животное может получить другой номер и доза PTZ инъекции.
- Исправьте номер и дозы инъекций PTZ в каждом состоянии для оценки уязвимости для PTZ, в том числе в борьбе с эпилепсией наркотиков и изучение фенотипа генетически измененных мышей. Дать все животные одинаковое количество PTZ инъекции; рекомендуется в общей сложности 8-12 инъекций. Если животное умирает, счет изъятия следует обозначать как 6.
- Определение дозы инъекций, необходимо поддерживать высокий захват Оценка (4 или 5) для 10 или более инъекции для изучения гистопатологические изменения, которые происходят эпилептические припадки. В этом случае общая инъекция номер должен варьироваться от 25 до 30. Уменьшение дозы инъекций если захват Оценка достигает 5. Если счет захвата уменьшается в 3 или меньше, увеличение дозы инъекций.
3. захват Оценка
- Наблюдать животного поведения и записывать результаты.
- Классификация и оценка эпилептические поведения как следует38,39 (рис. 1B):
0: нормально, без отклонений.
1: иммобилизация, лежа на животе.
2: головной кивая, лица, передних конечностей или задних конечностей миоклонус.
3: непрерывное всего тела миоклонус, миоклоническая рывков, хвост поднял сухо.
4: воспитание, тоник захват, падает на его стороне.
5: тонизирующий клонические захват, падают на спину, дикий, бросаясь и прыжки.
6: смерть.
- Классификация и оценка эпилептические поведения как следует38,39 (рис. 1B):
- Измените поведенческие критерии, основанные на Расин Оценка40, в зависимости от экспериментальных условий.
4. После захвата анализ
- Immunohistopathological анализ
- Фиксация перфузии
- Подготовка
- Растворяют параформальдегида 4% (w/v) (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4). Тепло решение примерно 70 ° C с добавлением капли 1 M NaOH (примерно 1 мкл 1 M NaOH для 50 мл раствора PFA).
- Подготовить ледяной 4% PFA и фосфат амортизированное saline (PBS).
- Настройка Перистальтический насос, с метро и иглы. Запуск приблизительно в 20 мл воды через трубку, чтобы убрать остатки. Затем место открытый конец трубки в ледяной PBS.
- Transcardial перфузии и подготовка фиксированной мозга
- Глубоко анестезировать мыши с 50% isoflurane/50% этанола в баночку.
- Держите мышь в лежачем положении, закрепляя кончики их передние конечности и гомотерия.
- Вырезать вентральной средней линии живота и разоблачить диафрагмы.
- Вырежьте диафрагмы вдоль реберную маржа. Затем режут оба боковых ребер и тела. Щепотка мечевидного отростка, замок щипцами и Эверт грудной клетки. Сохранить позицию мечевидного отростка, закрепляя ее с помощью иглы или щипать с щипцами. Разоблачить сердце.
- Вставить иглу в левый желудочек и сделать разрез в правое предсердие, используя ножницы. Имейте в том, чтобы не толкать иглу слишком далеко в сердце, как он может пробить внутренних стен.
- Начните устойчивый поток ледяной PBS через иглу промыть крови (приблизительно 15-20 мл/мин).
- Когда кровь была очищена от тела, переместите трубку к решению параформальдегида 4% (примерно 60 мл) без добавления пузыри. Затем остановите перфузии.
- Вырезать сзади шеи и позвоночника и шелушиться кожу головы и спинной части черепа с рассечения ножницы.
- Вырезать строение костей между орбитами глаз и полностью удалить спинную часть черепа.
- Создать разрыв между мозгом и скуловой кости с задней стороны и вырезать тройничного нервов и зрительных нервов под мозга. Тщательно удалить мозга и поместить его в пробирку, содержащую 4% PFA. После исправления мозга на 4 ° C для 12-16 ч.
- Подготовка
- Подготовка срез мозга
- Фиксированный мозга можно передать 20% сахарозы/PBS до тех пор, пока мозг погружается в решение для криозащиты.
- Вырежьте фиксированной мозга, основанный на требуемый кусочек ориентацию и необходимой частью мозга.
- Установите cryomicrotome. Установите лезвие в положении и поддерживать микротом стадии при температуре до-20 ° C.
- Поместить нарезанные мозга на сцене и пальто мозга с 20% сахарозы/PBS. Постепенно будет заморозить раствор сахарозы/PBS, охватывающих мозга на сцене, пока мозг полностью внедрен в замороженных 20% сахарозы/PBS.
- Срез мозга (толщиной 30 мкм), двигая лезвие через ткани. Перенесите ломтики в PBS и держать их на 4 ° C.
- Флуоресцентный иммуногистохимии
- Мыть необходимые фрагменты в 0,1% тритон X-100/PBS (PBST) за 10 мин, 3 раза при комнатной температуре (RT).
- Блокировать ломтики, инкубации их в PBST с 2% козьего сыворотки или 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) для 1-2 ч на RT.
- Инкубировать ломтики в раствор антител с подходящим концентрации основного антитела в PBST с 2% козьего сыворотки или 5% BSA 1 до 7 суток при 4 ° C.
- Вымойте ломтики в PBST за 10 мин, 3 раза на RT.
- Инкубируйте ломтики в вторичное антитело раствор с подходящие концентрации вторичных антител в PBST для 1-2 ч на RT, свет защищены.
- Смонтировать ломтики на стеклянных вставках и накрыть монтажа средних и стеклом.
- Наблюдать за ломтики с микроскопии флуоресцирования.
- Фиксация перфузии
- Трехкамерная тест
- Подготовка
- Подготовить по крайней мере 2 2-6-месячного 129/Sv мышей того же пола как предмет мышей быть «чужой мыши». Приучать всех мышей в клетке перед анализом. Для каждой учебной сессии поместите указатель мыши в клетке и оставьте мышь за 15 мин.
- Перед каждой фазы привыкание с предметом мыши очистите весь аппарат и оба клетки, вытирая поверхность с 70% этиловом спирте.
- Пустые клетки в двух бортовых камер 3-камерная аппарата и открыть двери между камерами.
- Приучать тему мышь, поместите мышь субъекта в зале центра и позволить мыши, чтобы свободно передвигаться по всей территории аппарат до тех пор, пока мышь изучила обе клетки, плюс дополнительные 5 минут тема животных, которые могут быть страшные клетки не расследовать клетке для 20 мин и не должны использоваться для этого анализа. Такие животные избежать клетке и редко приходят близко к клетке.
- После того, как животное перемещается в центр камеру, закройте двери и пусть мыши свободно перемещаться в зале центра 5 мин. В этот период положите один из 129/Sv мышей в клетке, чтобы приучать к клетке.
- Социальность анализ
- Провести этот анализ сразу же после периода привыкания предмет мыши.
- Место клетки, содержащие 129/Sv мыши, называют «незнакомец 1 клетка», в одном из бортовых камер и место пустые клетки, называют «объект клетка», в другой стороне камеры.
- Откройте дверь и контролировать поведение субъекта мыши.
- Разрешить вопрос мышь двигаться свободно в течение 10 мин и записывать следующие поведенческие параметры. Если предмет мышь боится мыши в клетке незнакомец 1, как указано мышью избежать незнакомец 1 клетка и оставаясь в углу одной из палат, животное не должно использоваться для анализа.
) время, проведенное в каждой камере, незнакомец 1 палаты, объект палаты и палаты центр.
b) время, проведенное расследование каждой клетки, незнакомец 1 клетка и клетка объект. (Мышь классифицируется как расследование клетку, если мышь нюхать или toughing мыши или клетка)
c) количество входов в каждой камере (опционально)
d) общее расстояние, пройденное (опционально) - После того, как мышь перемещается в центр камеру, закройте двери.
- Анализ социальных Новинка
- Провести этот анализ сразу же после анализа социальности.
- Протрите обе клетки с 70% этиловом спирте.
- Место другой 129/Sv мыши в одном из клетки, называют «Незнакомец 2 клетки» и место незнакомец 2 клетки в одной из палат. Поместите курсор мыши 1 незнакомец в другие клетки, называют «незнакомец 1 клетка» и незнакомец 1 клетка в другой палаты.
- Откройте дверь и контролировать поведение субъекта мыши.
- Разрешить тему мышь двигаться свободно в течение 10 мин и измерить же поведенческих параметров, описанных для анализа социальности.
Примечание: 1 незнакомец и Незнакомка 2 мыши должен быть выбран случайным образом. Незнакомец 1 камеры и объект камеры, а также незнакомец 1 камеры и незнакомец 2 камеры должна определяться произвольно.
- Подготовка
- Контекстуальные страха дискриминации
- Принадлежности
- Перед каждой принадлежности суда очистите экспериментальный аппарат, вытирая поверхность с 70% этиловом спирте.
- Место мыши в принадлежности аппарат с особыми условиями (аппарат форма, цвет стен, материал пола, запах, освещения и фоновый шум тома должны быть заранее определены). Например принадлежности аппарат, используемый здесь был квадратный аппарат с ясно плексиглас стены, пола металлическую сетку, запах этанола, 100 люкс яркости и 65-dB фон белый шум.
- Состояния мыши по фут шок с псевдо-случайных сроков током 0,1 мА 2 s x 3 раз в течение 5 мин.
- Вернуться домой клетку мыши после кондиционирования.
- Оценки памяти
- Перед каждой оценки очистите экспериментальный аппарат, вытирая поверхность с 70% этиловом спирте.
- На следующий день следующие принадлежности, поместите указатель мыши в же аппарат как состояние шока и измерить время замораживания в течение 5 мин.
- Позже тот же день, поместите указатель мыши в Роман аппарат и измерить время замораживания во время оценки 5-мин. Треугольная аппарат с белым плексиглас стены, плиты пола, не запах, 30 люкс яркость и 70 dB белый шум был использован здесь.
- Сравните время замораживания между же состояния и Роман. Мышей с обычной памяти способность будет заморозить больше в том же состоянии, чем в новых условиях. Замораживание является определенным неподвижность животного для более чем 2 s.
- Принадлежности
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Повторяющихся инъекций PTZ индуцирует увеличение тяжести изъятия. Шесть мышей C57BL/6 относились с PTZ, и еще 6 мышей были относиться с saline как в контрольной группе. PTZ доза была 35 мг/кг, и осуществлялось 10 инъекций. Оценка захват постепенно увеличилось с PTZ инъекции, в то время как без изъятий или ненормального поведения были вызваны физиологическим инъекции (рис. 2). ANOVA, следуют Бонферрони тест показал существенное различие между PTZ-лечение группой и группой физиологического раствора лечение.
Повторяющихся захват способствует формирование аберрантных аксональное филиал (моховое волокна прорастания) и аномальные миграция гранул клеток в зубчатой извилине гиппокампа. Мышей были относиться с PTZ для 25 инъекций (доза была скорректирована между 24 мг/кг и 35 мг/кг для поддержания тяжелой захват мышей не вызывая смерти, вызванные тяжелой захват). Мозг мыши были зафиксированы 3 недели после последней инъекции. Управления мозги были исправлены до инъекции PTZ. Срезы мозга были immunostained с анти synaptoporin (x 500) и антител анти ZnT3 (x 500) соблюдать моховые волокна прорастания (Рисунок 3А) и антитела анти Даблкортин (x 200) соблюдать аномальные миграции клеток ( гранул Рисунок 3A). Моховые волокна прорастают в слое гранул клеток наблюдалось в PTZ-лечение срезы (рис. 3A). Клеток новорожденных гранул, которые иммунореактивных для Даблкортин, были замечены в хилус в PTZ-лечение срезы (рис. 3A). Слоя клеток гранул и показано на рисунке 3A хилус проиллюстрирована на рисунке 3B.
Повторяющиеся приступы также нарушить нормальное поведение мышей. Двенадцать мышей C57BL/6 относились с PTZ (35 мг/кг, 10 инъекций), и еще 12 мышей были относиться с saline как в контрольной группе. Через две недели после последней инъекции, мышей были проанализированы в 3-камерный (рис. 4A) и испытания контекстной страха дискриминации (Рисунок 5A). PTZ-лечение мышей показало нормальное социальности (рис. 4B). Мышей провел больше времени в зале 1 незнакомец, чем в объекте камеры (физиологическим: p = 0,003, PTZ: p = 0,027) и исследованы незнакомец 1 клетка больше, чем они расследовали объект Кейдж (физиологическим: p = 0,009, PTZ: p = 0,004). Однако PTZ-лечение мышей показало ненормальные социальные Новинка (рис. 4 c) свидетельствует о нарушения социальной памяти. Мышь управления провел в камере незнакомец 2 больше времени, чем в чужой 1 камеры и исследованы незнакомец 2 клетки, больше, чем они расследовали незнакомец 1 клетки, тогда как растопленном мышей не показывают каких-либо значительной разницы во времени провел в камерах или время, проведенное расследование клетки (время в камере: физиологический: p = 0,006, PTZ: p = 0,126. Время расследование: физиологический: p = 0,002, PTZ: p = 0.426). PTZ-лечение мышей также показан нарушения памяти в контекстной страх тест (Рисунок 5B). Контроль мышей показало длиннее время замораживания в состоянии шока, чем в новых условиях, тогда как PTZ-лечение мышей не показывают каких-либо значительные различия в замораживание время (физиологическим: p < 0,001, PTZ: p = 0,060). Непарные t тесты были проведены для статистического анализа.
Рисунок 1: краткое описание протокола. (A) схематическая иллюстрация PTZ-опосредованной растопку. (B) иллюстрации представитель животного поведения для оценки соответствующих захват. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: оценки поведения, судорожными. Средний захват оценки указаны в графе. Шесть мышей были использованы в каждом состоянии, и был проведен один из серии инъекций. После каждой инъекции захват баллы были мониторинг и забил. По сравнению с физиологическим инъекции, PTZ инъекции значительно увеличили захват тяжести (p < 0,001: повторил мер ANOVA). Каждый захват Оценка отображается как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: PTZ-опосредованной моховые волокна прорастания и аномальные миграция гранул клеток. (A) максимум прогнозам иммуногистохимических изображения хилус, зернистый слой и молекулярный слой гиппокампа ломтики мышей до розжига (слева) и после растопки (справа). Анти synaptoporin (вверху) и антитела анти ZnT3 (средний) были использованы для визуализации гранул нейронов (моховое волокна). Антитела анти Даблкортин был использован для визуализации новорожденных гранул нейронов (внизу). PTZ-опосредованной повторяющиеся приступы вызывают моховые волокна, прорастания (стрелки) и аномальные миграция гранул клеток в хилус (стрелок). Линейки, 50 мкм. В указано приблизительное положение каждого изображения (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: PTZ-опосредованной аномальные социальное поведение. (A) схематическая иллюстрация 3-камерный теста. (B) среднее количество времени, проведенное в каждой камере и показано среднее количество времени, провел расследование каждой клетке в тесте социальности. (C) среднее количество времени, проведенное в каждой камере и среднее количество времени провел расследование, каждой клетке в социальной новизна теста отображаются. Там были двенадцать мышей в обеих групп относились PTZ и физиологического раствора. PTZ-опосредованной изъятий вызванных ненормальным социальное поведение (*** p < 0,001, н.с. = не значительные). Все время показано как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: ухудшение PTZ-опосредованной памяти. (A) схематическая иллюстрация контекстуальные страха дискриминации теста. (B) показываются средний процент замораживания раз в каждом состоянии. Там были двенадцать мышей в обеих групп относились PTZ и физиологического раствора. График показывает среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем широко доступной протокол для создания фармакологических животной модели эпилепсии. PTZ-опосредованной химических растопку имеет долгую историю и является общепринятой моделью для изучения гистопатология и клеточной патологии эпилепсии41. Химические растопку модели эпилепсии был рассмотрен ранее Suzdak и Янсен, 199542. Фармакологических захват индукции, особенно с PTZ, является легкой и простой метод для вызывая тяжелые судороги. Изменения в инъекций доза коррелируют с захватом тяжести. Таким образом очень легко определить соответствующие дозы течение нескольких судебных разбирательств, изменив PTZ дозы и изучения результирующее поведение.
Многие исследователи пытались создать нокаутом или стучите в мышах как модели эпилепсии и добились успеха в производстве мышей, которые демонстрируют спонтанные судороги43,-44. Однако фармакологические захват индукции до сих пор считается хорошей моделью для лечения эпилепсии. Другой общий метод для захвата индукции помимо генной модификации включает имплантировать электроды в мозг животного и вызывая судороги, электрошок опосредованной. Этот метод является дорогостоящим, сложным и требует хирургического умение имплантата электрода на точные локус в мозг5.
Химической индукции судороги позволяет быстрое расследование epileptogenesis и анти-эпилептических наркотиков скрининг на низкой стоимости2,4. Частоту и выраженность спонтанного изъятий и SE зависимости препарат, который используется. Каиновая кислоты и пилокарпин используются главным образом для провоцировать SE и последующих хронический спонтанное или рецидивирующие судороги45,,4647. С другой стороны, PTZ используется как для содействия SE когда дано в высок дозы и развивать химически возгорелся животных, когда дано в subconvulsive дозе48,49. Кроме того механизмы судорожными препаратов, которые индуцируют судороги, хорошо известны. Таким образом необходимо побудить захват механизм блокирования может помочь выявить анти-эпилептических наркотиков. С другой стороны генетической модели необходимы для изучения механизмов, которые вызывают эпилептические припадки50. После того, как механизмы, посредством которых индуцированной изъятий освещены, скрининг анти-эпилептических наркотиков может быть запущен.
В представитель результаты, показанные здесь поведение животных наблюдалось 30 мин после приема PTZ. Однако как уже упоминалось в разделе протокол, поведение животных желательно наблюдается за 24 ч или по крайней мере 6-10 ч после инъекции PTZ, особенно после того, как захват Оценка достигает 3 или выше. Хотя система мониторинга животного может потребоваться наблюдать животных на весь день, длительное наблюдение имеет решающее значение для получения глубокого понимания эпилепсии. Кроме того продолжительность ареста и конфискации задержки являются полезные меры для сбора. Эти измерения являются важными, когда касающиеся изменения в продолжительности захвата и задержка времени и захват тяжести.
После захвата гистопатология химически растопленном животных была исследована, особенно в гиппокампе. Повторяющиеся судороги или SE побудить моховые волокна прорастают27,28, ненормальное миграции новорожденных гранул нейронов25,29, astrogliosis в гиппокампе30и апоптоза нейронов пирамидальный 31 , 32. Эти гистологические изменения в мозге нарушить неврологических функций больных эпилепсией. Например Ассоциация эпилепсии с расстройствами спектра аутизма (ASD) и умственной инвалидности (ID) является признанным51,52,53. Ли эпилептические припадки побудить ASD и Идентификаторов или ASD и вызвать эпилептические симптомы-прежнему сложный вопрос. Недавние исследования показали, что PTZ-опосредованной изъятий побудить54 ASD-как социально когнитивные расстройства и ID-как обучения дефицита 55,56,57. Эти результаты показывают, что эпилепсия опосредованной гистопатология вызывает нейрональных дисфункции и психических расстройств.
Гистологические изменения, пропагандируемые эпилепсии занять время развиваться после захвата индукции. В этом отношении фармакологических захват индукции выгодно, потому что исследователи могут контролировать сроки, количество и тяжесть изъятий в животных. Включая химические растопку, Животные модели epileptogenesis будет продолжать содействовать расследованию механизма индукции эпилепсии и психофизиологических расстройств, связанных с.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа частично поддерживается номера грантов JSP-страницы KAKENHI, 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 и 17 K 07086, номера грантов МПКСНТ KAKENHI 25110737 и 23110525, AMED Грант номер JP18ek0109311 и СЕНЬШИН медицинский исследовательский фонд и Японии Фонд исследований эпилепсии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentylenetetrazole | Sigma-Aldrich | P6500 | |
| Sodium chloride | MANAC | 7647-14-5 | |
| Mouse | CLEA Japan | C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male | |
| Syringe (1mL) | Terumo | SS-01T | |
| Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Weighing scale | Mettler | PE2000 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium hydroxide | nacalai tesque | 31511-05 | |
| Peristatic pump | ATTO | SJ1211 | |
| Sucrose | nacalai tesque | 30404-45 | |
| Microtome | Yamato | REM-700 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710 |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| anti-synaptoporin antibody | Synaptic systems | 102 002 | |
| anti-ZnT3 antibody | Synaptic systems | 197 002 | |
| anti-doublecortin | Santa Cruz | sc-8066 | This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390). |
| Contextual fear discrimination test apparatus | O'hara | ||
| Three chamber test apparatus | Muromachi |
References
- Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. Models of Seizures and Epilepsy. , Academic Press. xvii (2006).
- Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
- Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
- Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
- Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
- Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, Suppl 5. 37-39 (2002).
- Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), discussion 353 306-313 (1999).
- Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
- Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
- Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
- Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
- Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
- Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
- Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
- Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs? Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
- Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
- Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657 (2013).
- Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
- White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, Suppl 7. 2-8 (2003).
- Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
- Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43 (2013).
- Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
- Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
- Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
- Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
- Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
- Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
- Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
- Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
- Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
- Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
- Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience. 129 (3), 757-766 (2004).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
- Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
- Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
- Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
- Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
- Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
- Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
- Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscience. 159 (2), 735-743 (2009).
- Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
- Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, Suppl 4. 7-12 (2001).
- Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship? Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
- Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
- Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
- Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
- Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
- Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
- Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).
