Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Pentylenetetrazole-inducerad Kindling musmodell

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56573
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för kemiska kindling med pentylenetetrazole och ger en musmodell av epilepsi. Detta protokoll kan också användas för att undersöka sårbarhet för beslag induktion och patogenes efter epileptiska anfall hos möss.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) är en GABA-A-receptorantagonist. En intraperitoneal injektion av PTZ i ett djur inducerar en akut, svår beslag vid en hög dos, medan sekventiella injektioner av en subconvulsive dos har använts för utveckling av kemiska tändved, en epilepsi modell. En enda låg dos injektion av PTZ inducerar en mild beslag utan kramper. Dock minska repetitiva lågdos-injektioner av PTZ tröskeln för att framkalla en krampaktig beslag. Slutligen, kontinuerlig låg dos administrering av PTZ inducerar ett tonisk-kloniska anfall. Denna metod är enkel och allmänt tillämpliga på undersöka patofysiologin av epilepsi, som definieras som en kronisk sjukdom som innebär att upprepade anfall. Denna kemikalie som tändved protokoll orsakar upprepade krampanfall hos djur. Med den här metoden uppskattades sårbarhet för PTZ-medierad anfall eller graden av försämring av epileptiska anfall. Dessa fördelar har lett till användning av denna metod för screening antiepileptika och epilepsi-relaterade gener. Dessutom har denna metod använts för att undersöka nervcellskador efter epileptiska anfall eftersom de histologiska förändringar som observerats i hjärnan hos patienter med epilepsi visas också i hjärnan hos kemiska-tände djur. Sålunda, detta protokoll är nyttig för att bekvämt producera djurmodeller av epilepsi.

Introduction

Epilepsi är en kronisk neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande anfall och drabbar cirka 1% av personer. De bakomliggande mekanismerna epileptogenes och beslag generation epilepsi patienter klargöras inte fullt i kliniska studier. Därför krävs en lämplig djurmodell för att studera epilepsi1.

En mängd olika djurmodeller av epilepsi har använts att undersöka physiologyen av epilepsi och identifiera antiepileptika2,3. Bland dessa modeller är farmakologiska beslag induktion en vanlig metod som används för att generera en djurmodell för utredning av patologin vid epilepsi4. Metoden är billig och enkel. Elektrod-medlade fnöske är också en vanligt förekommande metod, men kostnaderna för detta förfarande är högre, och metoden kräver kirurgiska och elektriska färdigheter att framkalla upprepade anfall5.

Farmakologisk induktion är också fördelaktigt eftersom tidpunkten och antalet beslag styrs enkelt. Genetiska musmodeller som uppvisar spontana kramper används också i studien av epilepsi. Att förutsäga när och hur ofta kramper uppstår i dessa genetiska modeller kan dock omöjligt6. Ett övervakningssystem krävs att observera epileptiska beteendet hos genetiskt modifierade möss6.

Kainic syra, pilokarpin och pentylenetetrazole (PTZ) används allmänt som beslag-inducerande läkemedel7. Kainic syra är en agonist för glutamatreceptorer och pilokarpin aktiverar kolinerga receptorer. PTZ är en gamma-aminosmörsyra (GABA)-en receptorantagonist8. PTZ dämpar funktionen av hämmande synapser, vilket leder till ökad neuronal aktivitet. Denna förordning medför generaliserade anfall i djur9. En enda injektion av kainic syra och pilokarpin kan inducera akuta krampanfall, särskilt status epilepticus (SE)10,11 och kainic syra - eller pilokarpin-medierad SE främjar kronisk spontan och återkommande anfall12 , 13. elektroencefalografiska (EEG) inspelningar och beteendeanalys har antytt att spontan återkommande anfall iakttas en månad efter en enstaka injektion12,13. En enda injektion av en krampaktig dos av PTZ inducerar också akut anfall. Kronisk spontan kramper efter en enda injektion av PTZ är dock svårt att främja. Kronisk administrering av PTZ krävs för att framkalla upprepade anfall14. I endera metoden är generationen av repetitiva anfall kunna inducera en patologi som är mer liknande till det av mänskliga epilepsi än generationen av akut anfall. När det gäller PTZ, varje injektion väcker ett anfall, och beslag svårighetsgrad blir svårare i en stegvis sätt vid varje injektion. Slutligen inducerar en enda låg dos PTZ-injektion ett tonisk-kloniska anfall. I den här fasen väcker varje injektion svåra anfall. Dessutom ändra beslag latens och varaktighet också under loppet av injektionerna. Latensen till tonic beslag blir ofta kortare i den senare fasen av kindling15. Dessutom åtföljs beslag försämring av en långvarig beslag längd16. Utreda den molekylära mekanism som reglerar beslag svårighetsgraden, är latens och varaktighet användbar för screening antiepileptika17,18,19.

Kramper induceras ofta av en enda systemisk administrering av PTZ och återhämtningen är mycket snabb, inom 30 min4,5. Således är antalet anfall mer kontrollerbar i PTZ-kindling modellen. EEG-övervakning har emellertid förklarat att generaliserad spikar kan ses upp till 12 h efter PTZ-medierad beslag20. Djur bör därför helst förbli under observation för 24 h efter den myokloniska eller tonic beslag21 för mer exakt analys av mekanismerna som tändved.

Administrering av antiepileptiska läkemedel, såsom följden, valproat, fenobarbital, vigabatrin och retigabin3, före eller efter PTZ-injektion mildrar aggravationen av beslag allvarlighetsgrad3,22, 23. Likaså har knockoutmöss som saknar gener inblandade i beslag exacerbation, såsom matrix metalloproteinas-924, FGF-2225 och neuritin26, visat att uppvisa minskad beslag svårighetsgrad efter flera PTZ-injektioner. Dessutom observerar histopatologiska förändringar efter epileptiska anfall är möjlig med denna metod. Hos patienter med tinningloben epilepsi finns det typiska histologiska förändringar i hjärnan, såsom mossiga fiber groning27,28, onormal granule neuron migration29, astrogliosis30, neuronala cell död i hippocampus31,32och Hippocampus skleros33. Liknande förändringar observeras i epileptiska modell djur. Bland de tillgängliga metoderna är PTZ-medierad kemiska kindling en bra, reproducerbar och billig metod att producera en djurmodell av epilepsi. I en pilokarpin-medierad SE modell, anfallskontroll är svårt och många möss dör eller misslyckas med att utveckla SE34. Dödlighet och beslag svårighetsgrad är det däremot mer kontrollerbar i PTZ-modellen. Dessutom PTZ är billigare än kainic syra och färdigheter i mus hjärnkirurgi krävs inte för Läkemedelsverket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella rutiner godkändes av djur vård och användning kommittén av den Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. Postnatal 8 - 16 veckor gamla möss rekommenderas. Någon inavlade stam är godtagbart för experimentet. C57BL/6 möss är mer motståndskraftiga mot PTZ, medan BALB/c och schweiziska albino möss är mer känsliga för PTZ. C57BL/6 användes i denna studie. Sårbarhet för PTZ beror också på åldern av musen. Jämfört med yngre möss, är äldre möss mer refraktära mot PTZ-35. Antalet djur som används för den här metoden kan variera, men åtminstone 6-10 djur krävs för varje villkor.

1. beredning av PTZ

  1. Lös 2 mg/mL PTZ i steril 0,9% (w/v) NaCl. Förbereda PTZ på dagen för användning.

2. injektion av PTZ

  1. Utföra alla experiment mellan 9:00 och 12:00 (middag).
  2. Mäta djurets kroppsvikt.
  3. Placera djuret i en observation kammare för tillvänjning.
  4. Beräkna volymen av PTZ-lösning för injektion baserad på kroppsvikt av djuret och den tidigare fastställda injektion dosen under perioden tillvänjning (3 min).
    Obs: till exempel när 35 mg/kg PTZ används, 0,875 mg av PTZ krävs för en mus som väger 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Därför 437,5 μL av en 2 mg/mL PTZ lösning injiceras (0,875 mg/2 mg / mL = 0.4375 mL). Den injektion dosen av PTZ beror på mus genotyp och stam. För vildtyp C57BL/6 möss rekommenderas en dos på 30-35 mg PTZ/kg kroppsvikt för den första rättegången. Känslighet för PTZ beror på mus stam används36,37. Den injektion dosen varierar beroende på syftet med experimentet.
  5. Injicera PTZ intraperitonealt med en 1 mL spruta bifogas en 27-gauge nål i den vänstra eller högra kvadranten av buken av djuret. Undvik att injicera vid mittlinjen.
    1. Undvik upprepade injektioner på samma position.
  6. Observera djurs beteenden för 30 min efter PTZ-administration (figur 1A), och klassificera och Poäng den onormalt beteenden som visas nedan. Om möjligt, hålla djuren under observation för 24 h eller minst en ytterligare 6-10 h efter injektion, särskilt när de beslag svårighetsgrad poängen når 3 eller högre.
    1. Observera någon mild kramper eller beteendeförändringar hos djur utöver 30 minuters observationsperiod. Detta långvarig observation period kan behandla en särskilt viktig och fullständig effekt av en subconvulsive dos av PTZ i generation av kronisk oprovocerade epileptiska anfall.
    2. Dessutom mäter beslag varaktighet varje observerade beslag som förändringar i beslag varaktighet avse beslag svårighetsgraden. Dessutom är latensen till första beslag efter PTZ-injektion en annan viktig åtgärd för att samla in. Övervakning anfallsfrekvens, varaktighet och latens är avgörande för alla efter beslag molekylära studier.
  7. Injicera PTZ varannan dag (figur 1A). Antalet injektioner beror på syftet med experimentet. Representativt exempel är som följer.
    1. För att generera helt tände avsluta djur, när ett djur upplever ett beslag med en poäng av 5 (tonisk-kloniska anfall), injektionen inom ytterligare tre förvaltningar. Öka i så fall injektion om beslag poäng inte ökar för tre på varandra följande förvaltningar. Varje djur kan få ett annat nummer och dos av PTZ-injektioner.
    2. Fastställa antal och dos av PTZ-injektion i varje skick för utvärdering av sårbarheten till PTZ, inklusive bedömningar av anti epilepsi läkemedel och studier av fenotypen av genetiskt modifierade möss. Ge alla djur samma antal PTZ injektioner; totalt 8 till 12 injektioner rekommenderas. Om ett djur dör, bör de beslag poängen vara betecknas som 6.
    3. Fastställ den injektion behövs för att bibehålla en hög beslag Poäng (4 eller 5) för 10 eller fler injektioner att studera de histopatologiska förändringar som sker epileptiska anfall. I det här fallet bör antalet totala injektion variera från 25 till 30. Minska dosen injektion om beslag Poäng når 5. Om beslag Poäng minskar till 3 eller lägre, öka injektion.

3. beslag Poäng

  1. Observera de djura beteenden och registrera poängen.
    1. Klassificera och poäng de epileptiska beteenden som följer38,39 (figur 1B):
      0: normalt beteende, ingen abnormitet.
      1: immobilisering, liggande på mage.
      2: huvudet nickande, ansiktsbehandling, forelimb eller bakbenet myoklonus.
      3: kontinuerlig hela kroppen myoklonus, myokloniska ryck, svans höll upp stelt.
      4: uppfödning, tonic beslag, faller ner på sin sida.
      5: tonisk-kloniska anfall, faller ner på ryggen, vilda rusar och hoppning.
      6: döden.
  2. Ändra beteende kriterierna baserat på Racine Poäng40, beroende på de experimentella förhållandena.

4. efter beslag analys

  1. Immunohistopathological analys
    1. Perfusion fixering
      1. Beredning
        1. Lös 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4). Värm lösningen till cirka 70 ° C med tillägg av en droppe 1 M NaOH (cirka 1 µL av 1 M NaOH för 50 mL PFA lösning).
        2. Förbereda iskall 4% PFA och fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
        3. Ställa in en Peristaltisk pump, med en tub och nål. Kör ca 20 mL vatten genom röret att rensa ut rester. Sedan placera den öppna änden av röret i iskall PBS.
      2. Transcardial perfusion och beredning av fast hjärnan
        1. Djupt söva musen med 50% isoflurane/50% etanol i en liten burk.
        2. Håll musen i ryggläge genom att fästa tips av sin frambenen och bakbenen.
        3. Skär den ventrala mittlinjen av buken och exponera membranet.
        4. Skär membranet längs den revbens marginalen. Sedan skär båda laterala sidorna av revbenen och kroppen. Nypa den xiphoid processen av låsning tången och evert bröstkorgen. Bibehålla positionen för den xiphoid processen genom att fästa det med en nål eller nyper det med tången. Exponera hjärtat.
        5. Stick in nålen i vänster kammare och göra ett snitt i höger förmak med sax. Vara medveten om att inte tryck nålen för långt in i hjärtat, eftersom det kan genomborra en innervägg.
        6. Påbörja ett stadigt flöde av iskall PBS genom nålen att tvätta ur blodet (cirka 15-20 mL/min).
        7. När blodet har rensats från kroppen, flytta röret till en 4% PARAFORMALDEHYD lösning (cirka 60 mL) utan tillsats av bubblor. Sedan stoppa perfusionen.
        8. Skär bakre nacken och ryggraden och lossnar huvud huden och ryggdelen av skallen med dissekera saxen.
        9. Skär Premaxilla benet mellan ögat banor och helt ta bort den dorsala delen av skallen.
        10. Skapa en klyfta mellan hjärnan och alexs ben från bakre sida och skär trigeminal nerver och optiska chiasm under hjärnan. Ta försiktigt bort hjärnan och placera den i en injektionsflaska innehållande 4% PFA. Efter fixa hjärnan vid 4 ° C i 12-16 h.
    2. Hjärnan slice förberedelse
      1. Överföra fast hjärnan till 20% sackaros/PBS tills hjärnan sjunker in i lösningen för cryoprotection.
      2. Skär fast hjärnan utifrån krävs slice orientering och obligatorisk del av hjärnan.
      3. Ange cryomicrotome. Ställa bladet i position och underhålla mikrotomen scenen vid en temperatur under-20 ° C.
      4. Placera färdigskurna hjärnan på scenen och belägga hjärnan med 20% sackaros/PBS. Sackaros/PBS lösningen kommer gradvis att frysa, som täcker hjärnan på scenen, tills hjärnan är helt inbäddad i frysta 20% sackaros/PBS.
      5. Skiva hjärnan (30 µm tjocklek) genom att skjuta bladet genom vävnaden. Överföra skivor i PBS och hålla dem vid 4 ° C.
    3. Fluorescerande immunohistokemi
      1. Tvätta de nödvändiga skivorna i 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) i 10 min, 3 gånger i rumstemperatur (RT).
      2. Blockera skivor genom inkubering i PBST med 2% get serum eller 5% bovint serumalbumin (BSA) för 1-2 h på RT.
      3. Inkubera skivor i en antikropp-lösning med passande koncentrationen av primär antikropp i PBST med 2% get serum eller 5% BSA för 1 till 7 övernattningar vid 4 ° C.
      4. Tvätta skivor i PBST i 10 min, 3 gånger på RT.
      5. Inkubera sektorerna i en sekundär antikropp lösning med lämpliga koncentrationen av sekundär antikropp i PBST för 1-2 h på RT, ljus-skyddade.
      6. Montera skivor på objektglas och täck med monteringsmedium och skyddsglaset.
      7. Iaktta skivor med fluorescensmikroskopi.
  2. Tre-kammartest
    1. Beredning
      1. Förbereda minst 2 2-6-månad-gammal 129/Sv möss av samma kön som ämnet mössen att vara ”främling mus”. Habituerar alla möss i buren innan analys. För varje träningspass, Placera musen i buren och låt musen för 15 min.
      2. Innan varje tillvänjning fas med ämnet musen, ren hela apparaten och båda burarna genom att torka av ytan med 70% etanol.
      3. Placera de tomma burarna i två avdelningar med 3-kammare apparaten och öppna dörrarna mellan kamrarna.
      4. Till habituerar angående musen, placera en ämne-mus i center kammaren och låt musen för att fritt flytta hela apparaten tills musen har undersökt både burar, plus en ytterligare 5 min. ämnet djur som kan vara rädda för buren inte undersöka buren i 20 min och bör inte användas för denna analys. Sådana djur undvika buren och sällan komma nära buren.
      5. Efter djuret flyttar in i center-kammaren, stänga dörrarna och låt musen röra sig fritt i centrum kammaren för 5 min. Under denna period, att sätta en av 129/Sv mössen i en bur till habituerar till buren.
    2. Socialitet analys
      1. Utföra denna analys omedelbart efter tillvänjning angående musen.
      2. Placera buren som innehåller en 129/Sv mus, kallas ”främling 1 buren”, i en av de side kamrarna och placera tomma buren, kallas ”objekt buren”, i den andra sida kammaren.
      3. Öppna dörren och övervaka beteendet hos ämnet musen.
      4. Låt ämnet musen att röra sig fritt under 10 min och registrera följande beteende parametrar. Om ämnet musen är rädd för musen i den främling 1 bur, som indikeras av musen undvika främling 1 buren och kvar i hörnet av en av avdelningarna, bör djuret inte användas för analys.
        (a) tid i varje kammare, främling 1 kammaren, objektet kammare och center kammare.
        (b) tid utreda varje bur, främling 1 buren och objektet buren. (Musen klassificeras som undersöker buren om musen sniffar eller toughing musen eller bur)
        (c) antalet ingångar i varje kammare (tillval)
        (d) totala färdsträcka (tillval)
      5. När musen flyttas in i center-kammaren, Stäng dörrarna.
    3. Sociala nyhet analys
      1. Utföra denna analys omedelbart efter socialitet analysen.
      2. Torka både burar med 70% etanol.
      3. Placera en annan 129/Sv mus i en av burarna, kallas ”främling 2 buren” och ställe den främling 2 bur i en av avdelningarna. Placera musen för främling 1 i andra buren, kallas den ”främling 1 bur”, och placera främling 1 buren i andra kammaren.
      4. Öppna dörren och övervaka beteendet hos ämnet musen.
      5. Låt musen för föremål att röra sig fritt under 10 min, och mäta samma beteende parametrar beskrivs för socialitet analys.
        Obs: Främling 1 och främling 2 musen bör väljas slumpmässigt. Främling 1 kammaren och objektet kammare samt den främling 1 kammare och främling 2 kammare bestämmas slumpmässigt.
  3. Kontextuella rädsla diskriminering
    1. Luftkonditionering
      1. Innan varje luftkonditionering rättegång, ren den experimentella apparaten genom att torka av ytan med 70% etanol.
      2. Placera en mus i en luftkonditionering apparatur med särskilda villkor (apparater form, väggfärg, golvmaterial, lukt, belysning och bakgrund buller volym bör bestämmas före). Till exempel var luftkonditionering apparaten används här en fyrkantig apparatur med klar plexiglas väggar, ett metallgaller golv, etanol lukt, 100 lux ljusstyrka och 65-dB vit bakgrundsljud.
      3. Villkor musen av foten-chock med pseudo-slumpmässiga timing av 0,1-mA elektriska chocker för 2 s x 3 gånger under loppet av 5 min.
      4. Återgå musen till buren efter konditionering.
    2. Minnesutvärderingen
      1. Innan varje bedömning, ren den experimentella apparaten genom att torka av ytan med 70% etanol.
      2. Nästa dag följande luftkonditionering, Placera musen i samma apparatur som chocka villkorar och mäta frysa tiden under loppet av 5 min.
      3. Senare samma dag, Placera musen i en roman apparatur och mäta frysa tiden under en 5-min bedömning. Här användes en triangulär apparatur med vit plexiglas väggar, platta golv, ingen lukt, 30 lux ljusstyrka och 70-dB vitt brus.
      4. Jämföra frysa tiden mellan samma skick och nya tillstånd. Möss med en normal minne förmåga kommer att frysa mer i samma skick än i ny skick. Frysning är definierade orörlighet av djuret för mer än 2 s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repetitiva injektion av PTZ inducerar en ökning i beslag svårighetsgrad. Sex C57BL/6 möss behandlades med PTZ, och en annan 6 möss behandlades med koksaltlösning som en kontrollgrupp. PTZ-dosen var 35 mg/kg och 10 injektioner gavs. Beslag Poäng ökade gradvis med PTZ-injektioner, medan inga anfall eller onormala beteenden var framkallat av saltlösning injektioner (figur 2). ANOVA följt av Bonferroni test visade en signifikant skillnad mellan den PTZ-behandlade gruppen och den saltlösning-behandlade gruppen.

Repetitiva beslag främjar avvikande axonal gren bildandet (mossiga fiber groning) och onormala migration av granule celler i hippocampus. Möss behandlades med PTZ för 25 injektioner (dosen justerades mellan 24 mg/kg och 35 mg/kg att upprätthålla svåra krampanfall hos möss utan att förmå dödsfall som orsakas av ett anfall). Mus hjärnor fastställdes 3 veckor efter den sista injektionen. Kontroll hjärnor fastställdes innan PTZ-injektioner. Hjärnan skivor var immunostained med anti-synaptoporin (x 500) och anti-ZnT3 (x 500) antikroppar att iaktta mossiga fiber groning (figur 3A) och med anti-doublecortin antikroppen (x 200) att observera onormal migration av granule celler ( Figur 3A). Mossiga fiber groning i granule cellen lagret observerades i PTZ-behandlade skivor (figur 3A). Nyfödd granule celler, som är immunreaktiva för doublecortin, observerades i hilus i PTZ-behandlade skivor (figur 3A). De granule cellager och hilus visas i figur 3A illustreras i figur 3B.

Repetitiva anfall också försämra normalt beteende hos möss. Tolv C57BL/6 möss behandlades med PTZ (35 mg/kg, 10 injektioner), och en annan 12 möss behandlades med koksaltlösning som en kontrollgrupp. Två veckor efter den sista injektionen, analyserades mössen i en 3-kammare test (figur 4A) och kontextuella rädsla diskriminering test (figur 5A). PTZ-behandlade möss visade normala socialitet (figur 4B). Möss tillbringat mer tid i Stranger 1 kammaren än i objektet kammare (saltlösning: p = 0,003, PTZ: p = 0,027) och undersökt främling 1 buren mer än de undersökta objekt buren (saltlösning: p = 0,009, PTZ: p = 0,004). PTZ-behandlade möss visade dock avvikande sociala nyhet (figur 4 c) vägledande av försämrat socialt minne. Kontroll möss tillbringat mer tid i Stranger 2 kammaren än i Stranger 1 kammare och undersökt främling 2 buren mer än de undersökta främling 1 buren, medan tände möss inte visade någon signifikant skillnad i tid tillbringade i kamrarna eller tid utreda burar (tid i kammaren: saltlösning: p = 0,006, PTZ: p = 0.126. Tid undersöker: saltlösning: p = 0,002, PTZ: p = 0.426). PTZ-behandlade möss visade också försämrat minne i kontextuella rädsla test (figur 5B). Styra möss visade en längre frysa tid i chock tillstånd än i romanen tillstånd, medan PTZ-behandlade möss inte visade någon signifikant skillnad i frysning tid (saltlösning: p < 0,001, PTZ: p = 0.060). Oparat t-test utfördes för statistiska analyser.

Figure 1
Figur 1: kortfattad beskrivning av protokollet. (A) Schematisk illustration av PTZ-medlade fnöske. (B) illustrationer av representativa djurs beteenden för respektive beslag noter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: bedömning av krampaktig beteende. De genomsnittliga beslag Poängen indikeras i figuren. Sex möss användes i varje skick, och en serie av injektioner utfördes. Efter varje injektion, var beslag poängen övervakas och gjorde. Jämfört med saltlösning injektioner, PTZ-injektioner betydligt ökade beslag svårighetsgrad (p < 0.001: upprepade-åtgärder ANOVA). Varje beslag Poäng visas som den medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: PTZ-medierad mossiga fiber groning och onormal migration av granule celler. (A) Max projiceras immunhistokemisk bilder av hilus, korniga lagret och molekylära lagret av hippocampus skivor av mössen före kindling (vänster) och efter kindling (höger). Anti-synaptoporin (överst) och anti-ZnT3 antikroppar (mitten) användes för att visualisera axoner av granule nervceller (mossiga fibrer). Anti-doublecortin antikroppen användes för att visualisera nyfödda granule nervceller (nederst). PTZ-medierad upprepade anfall inducera mossiga fiber groning (pilar) och onormala migration av granule celler in i hilus (pilspetsar). Skalstapeln, 50 μm. Den ungefärliga platsen för varje bild indikeras i (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: PTZ-medierad avvikande socialt beteende. (A) Schematisk illustration av testet 3-kammare. (B) den genomsnittliga mängden tid tillbringas i varje kammare och den genomsnittliga mängden tid utreda varje bur i socialitet testet visas. (C) den genomsnittliga mängden tid tillbringas i varje kammare och den genomsnittliga mängden tid tillbringade undersöker varje bur i sociala nyhet testet visas. Det fanns tolv möss i båda PTZ - och saltlösning-behandlade grupperna. PTZ-medierad anfall inducerad avvikande socialt beteende (*** p < 0,001, n.s. = inte signifikant). Alla tider visas som den medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: PTZ-medierad minnesförsämring. (A) Schematisk illustration av kontextuella rädsla diskriminering testet. (B) den genomsnittliga procentuella frysning gånger i varje villkor visas. Det fanns tolv möss i båda PTZ - och saltlösning-behandlade grupperna. Grafen visar den genomsnittliga ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett brett tillgängligt protokoll för inrättandet av en farmakologisk djurmodell av epilepsi. PTZ-medierad kemiska kindling har en lång historia och är en allmänt vedertagen modell för att studera epilepsi41histopatologi och cellulär patologi. Den kemiska kindling modellen av epilepsi har granskats tidigare av Suzdak och Jansen, 199542. Farmakologiska beslag induktion, särskilt med PTZ, är en lätt och enkel metod för att framkalla svåra anfall. Förändringar i injektion dosen korrelerar med beslag svårighetsgrad. Således är det mycket lätt att identifiera lämplig dos över flera prövningar genom ändring av PTZ-dosen och undersöka den resulterande beteenden.

Många forskare har försökt att skapa knockout eller inpressning möss som epilepsi modeller och har lyckats framställa möss som uppvisar spontana kramper43,44. Farmakologiska beslag induktion anses dock fortfarande vara en bra modell för epilepsi. En annan vanlig metod för beslag induktion än genmodifiering innebär implantera elektroder i ett djurs hjärna och framkalla elchocker-medierad anfall. Denna metod är dyrt, svårt och kräver kirurgiska skicklighet att implantatet elektroden på det exakta locus i hjärnan5.

Kemisk inducering av konvulsioner möjliggör snabb utredning av epileptogenes och antiepileptiska läkemedel screening vid låg kostnad2,4. Frekvensen och svårighetsgraden av spontana kramper och SE varierar beroende på drogen används. Kainic syra och pilokarpin används huvudsakligen för att provocera SE och efterföljande kronisk spontan eller återkommande anfall45,46,47. Däremot, PTZ används både för att främja SE när det gavs i en hög dos och att utveckla kemiskt upptänd djur när det ges i en subconvulsive dos48,49. Mekanismerna i krampaktig läkemedel som inducerar anfall är dessutom väl känt. Således, blockerar mekanismen som krävs för att framkalla krampanfall kan hjälpa för att identifiera antiepileptika. Å andra måste genetiska modeller undersöka de mekanismer som framkallar epileptiska anfall50. Efter de mekanismer genom vilka beslag induceras är klarlagd, kan screening av antiepileptika startas.

I de representativa resultat visas här, observerades djurs beteende i 30 min efter PTZ-administrering. Dock som nämnts i avsnittet protokoll, observeras djurs beteende helst för 24 h eller minst 6-10 h efter PTZ-injektion, särskilt när beslag Poäng når 3 eller högre. Även om ett djur som övervakningssystem kan behöva iaktta djuret hela dagen, är en långvarig observation kritiska för att få en djup förståelse av epilepsi. Beslag varaktighet och beslag latens är dessutom användbar åtgärder för att samla in. Dessa mätningar är viktiga när det gäller förändringar i beslag varaktighet och latens tid och beslag svårighetsgrad.

Den efter beslag histopatologin av kemiskt tände djur har undersökts, särskilt i hippocampus. Återkommande kramper eller SE inducera mossiga fiber groning27,28, onormal migration av nyfödda granule nervceller25,29, astrogliosis i hippocampus30och apoptos av pyramidal nervceller 31 , 32. dessa histologiska förändringar i hjärnan störa neurologiska funktioner hos patienter med epilepsi. Associering av epilepsi med autismspektrumstörningar (ASD) och intellektuella funktionshinder (ID) är exempelvis väl erkända51,52,53. Om epileptiska anfall inducera ASD och -ID eller ASD och inducera epileptiska symtom är fortfarande en komplicerad fråga. Nyare studier har visat att PTZ-medierad anfall inducerar ASD-liknande social-kognitiva funktionsnedsättningar54 och ID-liknande lärande underskott 55,56,57. Dessa fynd tyder som den epilepsi-medierad histopatologin framkallar den neuronal dysfunktion och psykiska störningar.

Histologiska förändringar främjas av epilepsi ta tid att utveckla efter beslag induktion. I detta avseende är farmakologisk beslag induktion fördelaktigt eftersom forskare kan styra timing, antalet och svårighetsgraden av anfall hos djur. Inklusive kemiska tändved, djurmodeller av epileptogenes kommer att fortsätta att främja utredningen av båda mekanismen för epilepsi induktion och relaterade neurofysiologiska störningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete var delvis stöds av JSPS KAKENHI grant nummer 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, och 17 K 07086, MEXT KAKENHI grant nummer 25110737 och 23110525, AMED Grant nummer JP18ek0109311, och SENSHIN medicinsk forskningsstiftelsen och Japan Epilepsi Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  2. Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
  3. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  4. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  5. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. Models of Seizures and Epilepsy. , Academic Press. xvii (2006).
  6. Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
  7. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  8. Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
  9. Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
  10. Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, Suppl 5. 37-39 (2002).
  11. Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), discussion 353 306-313 (1999).
  12. Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
  13. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  14. Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
  15. Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
  16. Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
  17. Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
  18. Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
  19. Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs? Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
  20. Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
  21. Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657 (2013).
  22. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  23. White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, Suppl 7. 2-8 (2003).
  24. Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
  25. Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43 (2013).
  26. Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
  27. Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
  28. Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
  29. Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
  30. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  31. Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
  32. Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
  33. Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
  34. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
  35. Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
  36. Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
  37. Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
  38. Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
  39. Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience. 129 (3), 757-766 (2004).
  40. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  41. Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
  42. Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
  43. Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
  44. Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
  45. Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
  46. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
  47. Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
  48. Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscience. 159 (2), 735-743 (2009).
  49. Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
  50. Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, Suppl 4. 7-12 (2001).
  51. Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship? Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
  52. Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
  53. Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
  54. Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
  55. Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
  56. Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
  57. Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).

Tags

Neurovetenskap fråga 136 kemiska tändved epilepsi djurens beteende neural plasticitet beslag histopatologi
Pentylenetetrazole-inducerad Kindling musmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shimada, T., Yamagata, K.… More

Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter