Summary
Questo protocollo descrive un metodo di accensione chimica con pentylenetetrazole e fornisce un modello murino di epilessia. Questo protocollo è utilizzabile anche per indagare vulnerabilità per induzione di sequestro e patogenesi dopo crisi epilettiche nei topi.
Abstract
Pentylenetetrazole (PTZ) è un antagonista del recettore GABA-A. Un'iniezione intraperitoneale di PTZ in un animale induce un acuto, grave sequestro a dosi elevate, mentre le iniezioni sequenziale di una dose di subconvulsive sono state utilizzate per lo sviluppo della chimica dell'accensione, un modello di epilessia. Una singola iniezione di basse dosi di PTZ induce una lieve crisi senza convulsioni. Tuttavia, ripetitivo della basso-dose iniezioni di PTZ diminuiscono la soglia per evocare un grippaggio convulsivo. Infine, la somministrazione continua di basse dosi di PTZ induce un grippaggio tonico-clonic severo. Questo metodo è semplice e ampiamente applicabile per studiare la fisiopatologia dell'epilessia, che è definita come una malattia cronica che coinvolge i sequestri ripetitivi. Questo prodotto chimico legnetti protocollo causa convulsioni ripetitive in animali. Con questo metodo, è stato stimato vulnerabilità alle crisi epilettiche PTZ-mediata o il grado di esasperazione dei grippaggi epilettici. Questi vantaggi hanno portato all'uso di questo metodo per lo screening di farmaci antiepilettici e geni correlati all'epilessia. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per studiare il danno neuronale dopo i grippaggi epilettici perché i cambiamenti istologici osservati nei cervelli dei pazienti epilettici appaiono anche nei cervelli degli animali ha acceso chimico. Così, questo protocollo è utile per produrre convenientemente modelli animali di epilessia.
Introduction
L'epilessia è una malattia neurologica cronica che è caratterizzata dai grippaggi ricorrenti e colpisce circa l'1% di persone. I meccanismi di generazione di epilettogenesi e sequestro nei pazienti di epilessia non possono essere completamente chiariti negli studi clinici. Di conseguenza, un modello animale adeguato è richiesto per lo studio dell'epilessia1.
Una varietà di modelli animali di epilessia sono stati utilizzati per studiare la fisiologia di epilessia e per identificare farmaci anti-epilettici2,3. Tra questi modelli, induzione farmacologica sequestro è un metodo comunemente utilizzato per generare un modello animale per lo studio della patologia di epilessia4. Questo metodo è poco costoso e semplice. L'accensione dell'elettrodo-mediata è anche un metodo comunemente usato, ma i costi di questa procedura sono superiori, e il metodo richiede competenze chirurgiche ed elettriche per indurre i grippaggi ripetitivo5.
Induzione farmacologica è vantaggiosa anche perché i tempi e il numero dei sequestri sono facilmente controllabili. Modelli genetici murini che presentano crisi epilettiche spontanee sono utilizzati anche nello studio dell'epilessia. Tuttavia, quando e quanto spesso i grippaggi derivano in questi modelli genetici di predizione può essere Impossibile6. Un sistema di monitoraggio è necessario per osservare il comportamento epilettico di topi geneticamente modificati6.
Acido kainic, pilocarpina e pentylenetetrazole (PTZ) sono ampiamente usati come d'induzione sequestro farmaci7. L'acido kainic è un agonista dei recettori del glutammato, e Pilocarpina attiva i recettori colinergici. PTZ è un acido gamma aminobutirrico (GABA)-un recettore antagonista8. PTZ sopprime la funzione delle sinapsi inibitorie, portando a un aumento dell'attività neuronale. Il presente regolamento fa sì che i grippaggi generalizzati in animali9. Una singola iniezione di acido kainic e Pilocarpina può indurre i grippaggi acuti, soprattutto lo stato epilettico (SE)10,11 e kainic acido o pilocarpina-mediata SE promuove cronica spontanea e ricorrente grippaggi12 , 13. analisi dei comportamenti e le registrazioni di electroencephalographic (EEG) hanno indicato che i grippaggi ricorrenti spontanei sono osservati un mese dopo una singola iniezione12,13. Una singola iniezione di una dose convulsiva di PTZ induce anche sequestro acuta. Tuttavia, crisi epilettiche spontanee croniche dopo una singola iniezione di PTZ sono difficili da promuovere. La somministrazione cronica di PTZ è necessaria per indurre i grippaggi ripetitivo14. In entrambi i metodi, la generazione dei sequestri ripetitivi è in grado di indurre una patologia più simile a quella dell'epilessia umana che la generazione di acuta crisi epilettiche. Nel caso di PTZ, ogni iniezione evoca un grippaggio e severità di sequestro diventa più grave in un modo graduale con ogni iniezione. Infine, una singola iniezione di PTZ della basso-dose induce un grippaggio tonico-clonic severo. In questa fase, ogni iniezione evoca i grippaggi severi. Inoltre, la latenza di grippaggio e la durata anche cambiare nel corso delle iniezioni. La latenza di grippaggio tonico diventa spesso più breve in quest'ultima fase di accensione15. Inoltre, aggravamento di grippaggio è accompagnato da un sequestro prolungata durata16. Indagando i meccanismi molecolari che regolano la severità di sequestro, latenza e la durata è utile per lo screening di farmaci anti-epilettici17,18,19.
I grippaggi sono comunemente indotti da una singola somministrazione sistemica di PTZ, e il recupero è molto veloce, entro 30 min4,5. Così, il numero dei sequestri è più controllabile nel modello PTZ-accendendo. Tuttavia, monitoraggio EEG ha indicato che picchi generalizzati possono essere visto fino a 12 ore dopo il sequestro di PTZ-mediata20. Pertanto, gli animali devono preferibilmente rimanere sotto osservazione per 24 h dopo le convulsioni miocloniche o tonic21 per un'analisi più precisa dei meccanismi di accensione.
La somministrazione di farmaci anti-epilettici, quali etosuccimide, valproato, fenobarbital, vigabatrin e retigabina3, prima o dopo l'iniezione di PTZ mitiga l'esasperazione del sequestro gravità3,22, 23. Allo stesso modo, topi knockout che mancanza geni coinvolti nell'esacerbazione di grippaggio, come matrix metalloproteinase-924, FGF-2225 e neuritin26, sono stati indicati per esibire la gravità ridotta sequestro dopo iniezioni multiple di PTZ. Inoltre, osservando alterazioni istopatologiche dopo i grippaggi epilettici è possibile con questo metodo. In pazienti con epilessia del lobo temporale, ci sono cambiamenti istologici tipici del cervello, come fibre muscose spuntano27,28, granello anormale del neurone migrazione29, astrogliosis30, un neurone delle cellule morte nell'ippocampo31,32e sclerosi hippocampal33. Simili cambiamenti sono osservati in animali modello epilettico. Tra i metodi disponibili, accensione chimica PTZ-mediata è un metodo buono, riproducibile e poco costoso per produrre un modello animale di epilessia. In un modello SE Pilocarpina-mediata, controllo delle crisi è difficile e molti topi muoiono o non riescono a svilupparsi SE34. Al contrario, la mortalità e la severità di sequestro sono più controllabili nel modello PTZ. Inoltre, PTZ è meno costoso di acido kainic e competenze in chirurgia del cervello del mouse non sono necessarie per l'amministrazione di droga.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di uso del Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science e cura degli animali. Postnatale 8 - 16-settimana-vecchi topi sono raccomandati. Qualsiasi ceppo inbred è accettabile per l'esperimento. Topi C57BL/6 sono più resistenti a PTZ, mentre topi albini BALB/c e svizzeri sono più sensibili a PTZ. C57BL/6 sono stati utilizzati in questo studio. Vulnerabilità di PTZ dipende anche dall'età del mouse. Rispetto ai più giovani topi, topi più vecchi sono più refrattari a PTZ35. Il numero di animali utilizzati per questo metodo può variare, ma almeno 6-10 animali sono necessari per ogni condizione.
1. preparazione di PTZ
- Sciogliere 2 mg/mL PTZ in sterile 0,9% (p/v) NaCl. Preparare PTZ il giorno di utilizzo.
2. iniezione di PTZ
- Eseguire tutti gli esperimenti tra 9:00 e 12:00 (mezzogiorno).
- Misurare il peso corporeo dell'animale.
- Metti l'animale in una camera di osservazione per l'assuefazione.
- Durante il periodo di assuefazione (3 min), calcolare il volume di soluzione PTZ per l'iniezione basata sul peso corporeo dell'animale e la dose di iniezione precedentemente determinato.
Nota: ad esempio, quando viene utilizzato 35mg/kg PTZ, 0,875 mg di PTZ è richiesto per un mouse pesa 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0.875 mg). Pertanto, deve essere iniettato 437.5 μL di soluzione di PTZ di 2 mg/mL (0.875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). La dose di iniezione di PTZ dipende dal genotipo del mouse e ceppo. Per topi C57BL/6 di selvaggio-tipo, si raccomanda una dose di 30-35 mg PTZ/kg di peso corporeo per la prima prova. Sensibilità a PTZ dipende il mouse ceppo utilizzato36,37. La dose di iniezione varia secondo lo scopo dell'esperimento. - Iniettare PTZ intraperitonealmente con una siringa 1 mL ad un ago calibro 27 nel quadrante destro o sinistro dell'addome dell'animale. Evitare di iniettare al midline.
- Evitare iniezioni ripetute nella stessa posizione.
- Osservare i comportamenti degli animali per 30 min dopo la somministrazione di PTZ (Figura 1A) e classificare e segnare il comportamento anormale, come illustrato di seguito. Se possibile, tenere gli animali sotto osservazione per 24 ore, o almeno un post-iniezione di altre 6-10 h, soprattutto una volta che raggiunge il Punteggio di severità di sequestro 3 o superiore.
- Nota qualsiasi lieve crisi epilettiche o cambiamenti comportamentali negli animali oltre il periodo di osservazione di 30 min. Questa prolungata osservazione periodo può rivolgere un effetto particolarmente importante e completo di una dose subconvulsive di PTZ nella generazione di grippaggi cronici non provocati nell'epilessia.
- Inoltre, misura la durata di sequestro di ogni grippaggio osservato come cambiamenti nella durata di sequestro riguardano la severità di sequestro. Inoltre, la latenza al primo sequestro dopo l'iniezione di PTZ è un'altra importante misura per raccogliere. Monitoraggio della frequenza delle crisi, la durata e la latenza è fondamentale per qualsiasi studio molecolare post-sequestro.
- Iniettare PTZ ogni altro giorno (Figura 1A). Il numero di iniezioni dipende l'obiettivo dell'esperimento. Esempi rappresentativi sono i seguenti.
- Per generare gli animali completamente accesi, una volta che un animale sperimenta un grippaggio con un punteggio di 5 (grippaggio tonico-clonic), finire l'iniezione all'interno di altre tre amministrazioni. In questo caso, aumentare la dose di iniezione se il Punteggio di sequestro non aumenta per tre amministrazioni consecutive. Ogni animale può ricevere un numero diverso e una dose di iniezioni di PTZ.
- Fissare il numero e la dose di iniezione PTZ in ogni condizione di valutazione della vulnerabilità per PTZ, compresi nelle valutazioni di farmaci anti-epilessia e studi del fenotipo di topi geneticamente modificati. Dare tutti gli animali lo stesso numero di iniezioni PTZ; un totale di 8-12 iniezioni è raccomandato. Se un animale muore, il Punteggio di sequestro deve essere indicato come 6.
- Determinare la dose di iniezione necessaria mantenere un sequestro elevato Punteggio ottenuto (4 o 5) per 10 o più iniezioni studiare i cambiamenti istopatologici che si verificano crisi epilettiche. In questo caso, il numero totale di iniezione dovrebbe variare da 25 a 30. Diminuire la dose di iniezione se raggiunge il Punteggio di sequestro 5. Se il Punteggio di sequestro si riduce a 3 o inferiore, aumentare la dose di iniezione.
3. Punteggio di sequestro
- Osservare i comportamenti animali e registrare i punteggi.
- Classificare e segnare i comportamenti epilettici come segue38,39 (Figura 1B):
0: comportamento normale, nessuna anomalia.
1: immobilizzazione, sdraiato sulla pancia.
2: testa annuendo, trattamento viso, degli arti anteriori o hindlimb mioclono.
3: continuo corpo intero mioclono, mioclonica cretini, coda tenuto ritto.
4: sequestro allevamento, tonica, cadendo su un fianco.
5: grippaggio tonico-clonic, cadendo sul dorso, selvaggio, correndo e saltando.
6: morte.
- Classificare e segnare i comportamenti epilettici come segue38,39 (Figura 1B):
- Modificare i criteri comportamentali basati sul Racine Punteggio40, a seconda delle condizioni sperimentali.
4. post-sequestro analisi
- Immunohistopathological analisi
- Fissazione di perfusione
- Preparazione
- Paraformaldeide al 4% (p/v) (PFA) si dissolvono in 0.1 M tampone fosfato (pH 7,4). Riscaldare la soluzione a circa 70 ° C con l'aggiunta di una goccia di 1 M NaOH (circa 1 µ l di 1 M NaOH per 50 mL di soluzione PFA).
- Preparare 4 ghiacciata % PFA e tampone fosfato salino (PBS).
- Impostare una pompa peristaltica, con un tubo e un ago. Eseguire circa 20 mL di acqua attraverso il tubo per eliminare i residui. Quindi, posizionare l'estremità aperta del tubo in PBS ghiacciata.
- Perfusione perfusione e preparazione del cervello fisso
- Profondamente anestetizzare il mouse con etanolo al 50% isoflurane/50% in un vasetto.
- Tenere il mouse in una posizione supina da appuntare le punte delle loro zampe anteriori e posteriori.
- Tagliare la linea mediana ventrale dell'addome ed esporre il diaframma.
- Tagliare il diaframma lungo il margine costale. Quindi, tagliare entrambi i lati laterali delle nervature e corpo. Pizzicare il processo xifoideo di pinza bloccante ed evert la gabbia toracica. Mantenere la posizione del processo xifoideo di blocco con un ago o che intrappola con il forcipe. Esporre il cuore.
- Inserire l'ago nel ventricolo di sinistra e fare un taglio nell'atrio di destra usando le forbici. Essere consapevoli di non spingere l'ago troppo lontano nel cuore, come può bucare un muro interno.
- Iniziare un flusso costante di PBS ghiacciata attraverso l'ago per lavare fuori il sangue (circa 15-20 mL/min).
- Quando il sangue è stato eliminato dal corpo, è possibile spostare il tubo ad una soluzione di paraformaldeide 4% (circa 60 mL) senza l'aggiunta di bolle. Quindi, arrestare la perfusione.
- Tagliare il collo posteriore e della colonna vertebrale e staccare la pelle di testa e la parte dorsale del cranio con forbici di dissezione.
- Tagliare l'osso premascellare tra le orbite oculari e rimuovere completamente la porzione dorsale del cranio.
- Creare un divario tra il cervello e l'osso jugal dal lato posteriore e tagliare i nervi di trigeminal e chiasm ottico sotto il cervello. Rimuovere il cervello con cautela e posizionarlo in un flaconcino contenente 4% PFA. Post-fissare il cervello a 4 ° C per 12-16 h.
- Preparazione
- Preparazione di fetta di cervello
- Trasferire il cervello fisso al saccarosio/PBS al 20% fino a quando il cervello si affonda nella soluzione per consentire crioprotezione.
- Tagliare il cervello fisso basato sull'orientamento richiesto fetta e la parte necessaria del cervello.
- Impostare il cryomicrotome. Impostare la lama in posizione e mantenere la fase microtomo a una temperatura inferiore a-20 ° C.
- Posizionate il cervello pre-tagliato sullo stage e rivestire il cervello con saccarosio/PBS al 20%. La soluzione di saccarosio/PBS congelerà gradualmente, che coprono il cervello sul palco, fino a quando il cervello è completamente immersa in congelati saccarosio/PBS al 20%.
- Affettare il cervello (30 µm di spessore) facendo scorrere la lama attraverso il tessuto. Trasferire le fette in PBS e tenerli a 4 ° C.
- Immunohistochemistry fluorescente
- Lavare le fette necessarie nello 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) per 10 min, 3 volte a temperatura ambiente (TA).
- Bloccare le fette di incubarle in PBST con 2% capra siero o 5% albumina di siero bovino (BSA) per 1-2 h a TA.
- Incubare le fette in una soluzione dell'anticorpo con l'adeguata concentrazione di anticorpo primario in PBST con 2% capra BSA siero o 5% per pernottamenti di 1 a 7 a 4 ° C.
- Lavare le fette in PBST per 10 minuti, 3 volte a TA.
- Incubare le fette in una soluzione di anticorpo secondario con l'adeguata concentrazione di anticorpo secondario in PBST per 1-2 h a RT, protetto da luce.
- Montare le fette su vetrini e coprite con mezzo di montaggio e copertura in vetro.
- Osservare le fette con microscopia di fluorescenza.
- Fissazione di perfusione
- Tre-camera di prova
- Preparazione
- Preparare almeno 2 2-6-mese 129/Sv topi dello stesso sesso come i topi di soggetto di essere il "mouse Stranger". Habituate tutti i topi in gabbia prima dell'analisi. Per ogni sessione di allenamento, posizionare il mouse nella gabbia e lasciare il mouse per 15 min.
- Prima di ogni fase di assuefazione con il mouse di soggetto, pulire l'intero apparato ed entrambi gabbie strofinando la superficie con etanolo al 70%.
- Posizionare le gabbie vuote nelle camere di due laterali dell'apparecchio 3-alloggiamento e aprire le porte tra le camere.
- Habituate il mouse di soggetto, porre un mouse di soggetto nella camera centro e consentire il mouse per muoversi liberamente in tutta l'apparecchio fino a quando il mouse è studiato entrambi gabbie, più un animali oggetto di ulteriori 5 min che possono essere timorosi della gabbia non fanno indagare la gabbia per 20 minuti e non deve essere utilizzato per questa analisi. Tali animali evitare la gabbia e raramente vengono vicino alla gabbia.
- Dopo che l'animale si muove nella camera del centro, chiudere le porte e lasciare che il mouse muoversi liberamente nella camera centro per 5 min. Durante questo periodo, uno dei topi 129/Sv messo in una gabbia a habituate alla gabbia.
- Analisi di socialità
- Eseguire questa analisi subito dopo il periodo di assuefazione del mouse oggetto.
- Posizionare la gabbia contenente un mouse 129/Sv, definito la "gabbia sconosciuto 1", in uno degli alloggiamenti laterali e posizionare la gabbia vuota, definita la "gabbia di oggetto", nel vano di lato.
- Aprire la porta e monitorare il comportamento del mouse oggetto.
- Consentire il mouse di soggetto di muoversi liberamente per 10 min e registrare i seguenti parametri comportamentali. Se il mouse soggetto ha paura del mouse nella gabbia 1 straniero, come indicato dal mouse evitando la gabbia 1 straniero e restanti nell'angolo di una delle camere, l'animale non deve essere utilizzato per l'analisi.
a) tempo trascorso in ogni camera, camera di 1 straniero, l'oggetto camera e camera di centro.
b) il tempo trascorso studiando ogni gabbia, gabbia 1 straniero e la gabbia di oggetto. (Il mouse è classificato come indagando la gabbia se il mouse è lo sniffing o toughing il mouse o la gabbia)
c) il numero di ingressi in ogni camera (opzionale)
d) totale distanza percorsa (opzionale) - Dopo che il mouse si sposta nella camera del centro, chiudere le porte.
- Analisi sociale novità
- Eseguire questa analisi immediatamente dopo l'analisi di socialità.
- Pulire entrambi gabbie con etanolo al 70%.
- Posizionare un altro 129/Sv mouse in una delle gabbie, definite il "Stranger 2 gabbia" e posto l'estraneo 2 gabbia in uno degli alloggiamenti. Inserire il mouse 1 straniero nella gabbia, definita la "gabbia di Stranger 1" e la gabbia 1 straniero in altra camera.
- Aprire la porta e monitorare il comportamento del mouse oggetto.
- Consentire il mouse di soggetto di muoversi liberamente per 10 min e misurare gli stessi parametri del comportamento descritti per l'analisi di socialità.
Nota: Il mouse 1 straniero e sconosciuto 2 dovrebbe essere scelto in modo casuale. Sconosciuto 1 camera e camera di oggetto nonché sconosciuto 1 sezione e sconosciuto 2 camera dovrebbe essere determinati in modo casuale.
- Preparazione
- Contestuale paura discriminazione
- Condizionata
- Prima di ogni prova condizionata, pulire l'apparato sperimentale strofinare la superficie con etanolo al 70%.
- Posizionare un mouse in un apparato condizionata con specifiche condizioni (apparato forma, colore della parete, materiale del pavimento, odore, illuminazione e volume di rumore di sfondo deve essere predeterminati). Ad esempio, l'apparato di condizionata usato qui era un apparecchio quadrato con pareti di plexiglass trasparente, un piano di griglia del metallo, un odore di etanolo, 100 lux di luminosità e rumore bianco sfondo 65-dB.
- Il mouse di circostanza di piede-scossa con tempismo pseudo-caso di 0,1-mA scosse elettriche per 2 s x 3 volte nel corso di 5 min.
- Tornare il mouse alla gabbia a casa dopo il condizionamento.
- Valutazione della memoria
- Prima di ogni valutazione, è necessario pulire l'apparato sperimentale strofinare la superficie con etanolo al 70%.
- Il giorno successivo seguente condizionata, posizionare il mouse sull'apparecchio stesso come condizione di scossa e misurare il tempo di congelamento nel corso di 5 min.
- Più tardi lo stesso giorno, posizionare il mouse in un apparato di romanzo e misurare il tempo di congelamento durante una valutazione di 5 min. Un apparato triangolare con pareti in plexiglass bianco, pavimento piatto, nessun odore, 30 lux di luminosità e rumore bianco 70-dB è stato usato qui.
- Confrontare il tempo di congelamento tra la stessa condizione e la condizione di romanzo. I topi con una capacità di memoria normale congelerà più nella stessa condizione che nella condizione di romanzo. Il congelamento è definito immobilità dell'animale per più di 2 s.
- Condizionata
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Representative Results
Iniezione ripetuta di PTZ induce un aumento nella severità di sequestro. Sei topi C57BL/6 sono stati trattati con PTZ, e un altro 6 topi sono stati trattati con soluzione salina come gruppo di controllo. La dose PTZ era 35 mg/kg e 10 iniezioni sono state amministrate. Il Punteggio di grippaggio è aumentato gradualmente con iniezioni di PTZ, considerando che nessun grippaggi o comportamenti anormali sono stati evocati da iniezioni di soluzione salina (Figura 2). ANOVA seguita da test di Bonferroni ha evidenziato una differenza significativa tra il gruppo trattato con PTZ e il gruppo salino-trattati.
Ripetitiva sequestro promuove formazione aberrante ramo assonale (fibre muscose sprouting) e anomalie della migrazione delle cellule del granello nell'ippocampo. Topi sono stati trattati con PTZ per 25 iniezioni (la dose è stata aggiustata tra 24 mg/kg e 35 mg/kg per mantenere sequestro severo nei topi senza indurre la morte causata da una grave crisi epilettica). I cervelli di topo sono stati fissati 3 settimane dopo l'ultima iniezione. Cervelli di controllo sono stati fissati prima iniezioni di PTZ. Fette del cervello immunostained con gli anticorpi anti-ZnT3 (x 500) per osservare la germogliatura muscosi della fibra (Figura 3A) e anti-synaptoporin (x 500) e con l'anticorpo anti-doublecortin (x 200) per osservare la migrazione anormale delle cellule del granello ( Figura 3A). Muscoso della fibra che spuntano nello strato delle cellule del granello è stata osservata in fette PTZ-trattati (Figura 3A). Cellule del granello neonato, che sono immunoreactive per doublecortin, sono state osservate all'interno di hilus nelle fette PTZ-trattati (Figura 3A). La strato delle cellule del granello e hilus illustrato nella Figura 3A è illustrata nella Figura 3B.
Crisi epilettiche ripetute anche alterano il normale comportamento dei topi. Dodici topi C57BL/6 sono stati trattati con PTZ (35 mg/kg, 10 iniezioni), e un altro 12 topi sono stati trattati con soluzione salina come gruppo di controllo. Due settimane dopo l'ultima iniezione, i topi sono stati analizzati in un 3-camera di prova (Figura 4A) e la contestuale paura discriminazione test (Figura 5A). Topi PTZ-trattati hanno mostrato normale socialità (Figura 4B). Topi trascorso più tempo in aula 1 straniero che nell'oggetto dell'alloggiamento (Salina: p = 0,003, PTZ: p = 0.027) e studiato la gabbia 1 straniero più che hanno studiato la gabbia di oggetto (Salina: p = 0,009, PTZ: p = 0,004). Tuttavia, topi PTZ-trattati hanno mostrato le novità sociale anomali (Figura 4) indicativo di indebolimento della memoria sociale. Topi di controllo trascorso più tempo in aula 2 sconosciuto che nel 1 straniero dell'alloggiamento e studiato la gabbia 2 straniero più di quanto hanno studiato la gabbia 1 straniero, mentre i topi accesi non hanno mostrato alcuna differenza significativa nel tempo trascorso negli alloggiamenti o tempo trascorso studiando le gabbie (tempo in aula: Salina: p = 0,006, PTZ: p = 0.126. Tempo indagando: Salina: p = 0,002, PTZ: p = 0.426). Topi trattati con PTZ inoltre ha mostrato la memoria alterata nel contestuale paura test (figura 5B). Controllare i topi hanno mostrato un tempo di congelamento più lungo nella condizione di scossa più in condizione di romanzo, mentre topi PTZ-trattati non hanno mostrato alcuna differenza significativa nel tempo di congelamento (soluzione salina: p < 0,001, PTZ: p = 0.060). Spaiato t-test sono stati effettuati per analisi statistiche.
Figura 1: breve descrizione del protocollo. (A) illustrazione schematica di legna da ardere PTZ-mediata. (B) illustrazioni dei comportamenti animali rappresentativi per i punteggi di sequestro rispettivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: valutazione del comportamento convulsiva. I punteggi medi di sequestro sono indicati nel grafico. Sei topi sono stati utilizzati in ogni condizione, e una serie di iniezioni è stata effettuata. Dopo ogni iniezione, i punteggi di sequestro sono stati monitorati e segnati. Rispetto alle iniezioni di soluzione salina, iniezioni di PTZ aumentato significativamente la severità di sequestro (p < 0,001: misure ripetute ANOVA). Ogni punteggio di sequestro è mostrato come la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: migrazione di germinazione e anormale di fibre muscose PTZ-mediata delle cellule del granello. (A) massimo proiettava immagini di immunohistochemical del hilus, strato granulare e strato molecolare di fette hippocampal dei topi prima dell'accensione (a sinistra) e dopo (a destra) dell'accensione. Anti-synaptoporin (in alto) e gli anticorpi anti-ZnT3 (medio) sono stati utilizzati per visualizzare gli assoni dei neuroni del granello (fibre muschiose). L'anticorpo anti-doublecortin era usato per visualizzare i neuroni del granello neonato (in basso). PTZ-mediata sequestri ripetitivi inducono muscosi della fibra che spuntano (frecce) e anomalie della migrazione delle cellule del granello nel hilus (frecce). Barra della scala, 50 μm. La posizione approssimativa di ogni immagine è indicata (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: PTZ-mediata anormale comportamento sociale. (A) illustrazione schematica del test 3-camera. (B) la quantità media di tempo trascorso in ogni aula e sono indicati la quantità media di tempo trascorso studiando ogni gabbia nel test di socialità. (C) la quantità media di tempo trascorso in ogni camera e la quantità media di tempo trascorso studiando ogni gabbia nel test novità sociale sono mostrati. C'erano dodici topi in entrambi i gruppi trattati con soluzione fisiologica e PTZ. PTZ-mediata i grippaggi indotti anormale comportamento sociale (* * * p < 0,001, n.s. = non significativo). Tutti gli orari sono indicati come la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: compromissione della memoria PTZ-mediata. (A) illustrazione schematica del test di discriminazione contestuale paura. (B) sono mostrati la percentuale media di tempi di congelamento in ogni condizione. C'erano dodici topi in entrambi i gruppi trattati con soluzione fisiologica e PTZ. Il grafico mostra la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, presentiamo un protocollo ampiamente accessibile per l'istituzione di un modello animale farmacologico dell'epilessia. PTZ-mediata accensione chimica ha una lunga storia ed è un modello comunemente accettato per lo studio della patologia istopatologia e cellulare di epilessia41. Il modello di accensione chimica dell'epilessia è stato rivisto in precedenza da Suzdak e Jansen, 199542. L'induzione farmacologica sequestro, soprattutto con PTZ, è un metodo facile e semplice per evocare i grippaggi severi. Modifiche della dose di iniezione correlano con la severità di sequestro. Quindi, identificare la dose appropriata sopra parecchie prove modificando la dose PTZ e esaminando il comportamento risultante è molto facile.
Molti ricercatori hanno tentato di creare KO o topi knock-in come modelli di epilessia e sono riusciti a produrre topi che presentano crisi epilettiche spontanee43,44. Tuttavia, induzione farmacologica del sequestro è ancora considerato un buon modello per l'epilessia. Un altro metodo comune per l'induzione di sequestro diverso da modificazione genetica coinvolge impiantare elettrodi nel cervello di un animale e indurre i grippaggi elettroshock-mediata. Questo metodo è costoso, difficile e richiede abilità chirurgica per l'impianto dell'elettrodo al luogo preciso nel cervello5.
Induzione chimica di convulsioni consente la ricerca rapida di epilettogenesi e farmaco antiepilettico di screening a basso costo2,4. La frequenza e la gravità delle crisi epilettiche spontanee e SE variano a seconda del farmaco utilizzato. Pilocarpina e acido Kainic vengono utilizzati principalmente per provocare SE e successivi sequestri spontaneo o ricorrente cronica45,46,47. D'altra parte, PTZ viene utilizzato sia per promuovere SE quando somministrato in un'alto-dose e di sviluppare chimicamente ha acceso gli animali quando somministrato a una dose subconvulsive48,49. Inoltre, i meccanismi di convulsi farmaci che inducono i grippaggi sono ben noti. Così, bloccando il meccanismo necessario per indurre il sequestro può contribuire ad per identificare farmaci anti-epilettici. D'altra parte, i modelli genetici sono tenuti a studiare i meccanismi che evocano i grippaggi epilettici50. Dopo sono chiariti i meccanismi da cui i grippaggi sono indotti, lo screening di farmaci anti-epilettici può essere avviato.
Nei risultati rappresentativi mostrati qui, comportamento degli animali è stato osservato per 30 min dopo la somministrazione di PTZ. Tuttavia, come accennato nella sezione protocollo, comportamento animale è preferibilmente osservato per 24 ore o almeno 6-10 ore dopo l'iniezione di PTZ, soprattutto una volta che il sequestro Punteggio ottenuto raggiunge 3 o superiore. Anche se un animale sistema di monitoraggio potrebbe essere richiesto di osservare l'animale per tutta la giornata, un'osservazione prolungata è fondamentale per l'ottenimento di una profonda comprensione dell'epilessia. Inoltre, la durata del sequestro e la latenza di sequestro sono misure utili a raccogliere. Queste misurazioni sono importanti quando relativi cambiamenti nella durata di sequestro e latenza alla severità di tempo e sequestro.
L'istopatologia di post-sequestro degli animali chimicamente accesi è stato studiato, soprattutto nell'ippocampo. I sequestri ripetitivi o SE indurre muscosi della fibra spuntano27,28, espansione anormale di neonato granello neuroni25,29, astrogliosis nell'ippocampo30e apoptosi dei neuroni piramidali 31 , 32. questi cambiamenti istologici nel cervello perturbare le funzioni neurologiche in pazienti epilettici. Ad esempio, l'associazione di epilessia con disturbi dello spettro autistico (ASD) e disabilità intellettiva (ID) è ben riconosciuto51,52,53. Se inducono i grippaggi epilettici ASD e ASD o ID e l'ID indurre sintomi epilettici è ancora una questione complicata. Recenti studi hanno dimostrato che i grippaggi PTZ-mediata inducono ASD-come social-cognitivi54 e ID-come imparare i deficit 55,56,57. Questi risultati indicano che l'istopatologia di epilessia-mediata suscita la disfunzione neuronale e disturbi psichiatrici.
I cambiamenti istologici promossi da epilessia prendere tempo per sviluppare dopo induzione di sequestro. A questo proposito, induzione farmacologica sequestro è vantaggioso perché i ricercatori possono controllare la temporizzazione, il numero e la severità dei grippaggi in animali. Tra cui chimica fascine, modelli animali di epilettogenesi continuerà a promuovere l'indagine su entrambi il meccanismo di induzione di epilessia e disturbi correlati neurofisiologici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Quest'opera è stata in parte sostenuta da numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 e 17 K 07086, numeri di sovvenzione MEXT KAKENHI 25110737 e 23110525, AMED Grant numero JP18ek0109311 e SENSHIN Medical Research Foundation e il Giappone Fondamento di ricerca di epilessia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentylenetetrazole | Sigma-Aldrich | P6500 | |
| Sodium chloride | MANAC | 7647-14-5 | |
| Mouse | CLEA Japan | C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male | |
| Syringe (1mL) | Terumo | SS-01T | |
| Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Weighing scale | Mettler | PE2000 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium hydroxide | nacalai tesque | 31511-05 | |
| Peristatic pump | ATTO | SJ1211 | |
| Sucrose | nacalai tesque | 30404-45 | |
| Microtome | Yamato | REM-700 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710 |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| anti-synaptoporin antibody | Synaptic systems | 102 002 | |
| anti-ZnT3 antibody | Synaptic systems | 197 002 | |
| anti-doublecortin | Santa Cruz | sc-8066 | This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390). |
| Contextual fear discrimination test apparatus | O'hara | ||
| Three chamber test apparatus | Muromachi |
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