Summary
이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.
Abstract
다중 대상, 짧은 시간, 그리고 단일 테스트 운영 하 게 쉬운에서 여러 핵 산의 검출에 대 한 리소스-저렴 한 방법론은 절실히 필요 질병 진단, 미생물 모니터링, 유전자 변형된 생명체 (GMO) 검출, 그리고 법정 분석입니다. 우리는 이전 진정 (Capillary Array 기반 Loop 중재 등온 증폭 핵 산의 Multiplex 비주얼 검색) 라는 플랫폼을 설명 했습니다. 여기, 우리는 향상 된 제조 및 성능 프로세스가이 플랫폼에 대 한 설명. 여기, 우리는 작은, 준비-사용 카세트 핵 산의 다중 영상 검출을 위한 모 세관 배열에 의해 조립 적용. 모 세관 배열 고정 루프 중재 등온 증폭 (램프) 뇌관 세트 모세 혈관에 전에 미리 소수 성 및 친수성 패턴으로 치료 이다. 로드 어댑터의 조립 후 램프 반응 혼합물은 로드 하 고 각 모 세관, 단일 pipetting 단계에 의해 모 세관 힘 때문에 고립. 램프 반응 모세 혈관에서 병렬로 수행 됩니다. 결과 휴대용 자외선 손전등 조명에 의해 밖으로 시각적으로 읽혀집니다. 이 플랫폼을 사용 하 여, 8 자주 높은 특이성 및 감도 요소와 GMO 샘플에서 유전자 표시의 모니터링 설명 합니다. 요약 하면, 여기에 설명 된 플랫폼 여러 핵 산의 탐지를 촉진 하기 위한 것입니다. 우리는 높은 처리량 핵 산 분석 필요 분야에 광범위 하 게 적용 될 것입니다 믿습니다.
Introduction
여러 핵 산의 동시 검출을 위한 저가, 빠르고 사용 하기 쉬운 시스템 분야, 임상 진단1,2,3, GMO 검출4, 넓은 범위에서 긴급 하 게 필요 5,6,7,,89, 정밀 분석10,11, 그리고 특히 포인트의 케어 테스트 (POCTs), 어디 모니터링 미생물 자원 일반적으로 제한12,,1314있습니다.
연쇄 반응 (PCR), 실시간 PCR 및 멀티플렉스 PCR 파생 메서드를 포함 하 여 검출이 분야에 가장 널리 적용된 기술입니다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 검색 한 대상 한 테스트15 및 전기 및 정교한 전문 장비 필요한.
핵 산 탐지 하기 위한 또 다른 유망한 기술이 이다 루프 중재 등온 증폭 (램프)는 처음 200016에 설명 했다. 램프는 고효율 DNA 검출 방식 이다. 이론적으로, 그것은 수 있는 증폭 1 복사본에서 amplicons 109 복사본을 일정 한 온도, (즉, 60-65 ° C 사이)에서 모두 1 시간 이내. 성공적인 증폭 불용 성 부산물 파이 인산의 대량 생산 하 고 탁도17, 맨 눈으로 직접 관찰 될 수 있는 변경 될 것입니다. 색상 변화는 또한 금속 이온 또는 Calcein18, 핵 산 염색19, hydroxyl naphthol 블루20등 형광 염료의 추가 의해 관찰할 수 있습니다. 높은 감도의 장점과 운영의 편의 때문에 램프는 핵 산 탐지에서 넓게 적용 되 고.
현재, 다중 램프 분석 실험을 위한 주로 두 가지 전략이 있다. 하나는 여러 개의 램프를 갖는 다중 램프 분석 수행 하는 뇌관 1 개의 관21,,2223에 설정 합니다. 그러나, 복합성 및 증폭 효율 본질적인 간섭 및 다른 뇌관 세트 간의 경쟁에 의해 제한 될 것 이다. 또한, 그것은 다른 램프 제품 같은 반응에 어려울 수 있습니다. 또 다른 전략은 물리적 격리를 기반으로 합니다. 다른 뇌관 세트 개별 소형된 구획으로 고립 되었다 및 다중 램프 반응을 동시에 수행 됩니다 다음24,25. 미세 칩에 따라 일반적으로, 이러한 접근 높은 처리량 램프 반응에 대 한 잠재적인 솔루션을 제공 합니다. 그러나, 칩의 제조 및 뇌관 세트의 다중 사전 코팅은 복잡, 비용 증가 재현성을 줄일 수 있습니다.
최근, 몇 가지 연구는 미세 칩의 복잡 한 제조를 무시 하 고 저 비 탐지26,27달성에 모 세관에서 수행 램프 반응을 설명 했습니다. 그러나, 높은 처리량 분석에 관해서는 이러한 모세 혈관은 비슷합니다 PCR 스트립 튜브의 미니어처 버전 샘플 및 반응 시 약 (를 포함 하 여 다른 뇌관 세트) 개별적으로 준비 하 고 해야 합니다 다른에 게 전달 하기 때문에 모세 혈관 내에서 반응 단위입니다. 병렬 및 다중 분석을 달성 하기 위해 추가 장비, 예를 들어 멀티 채널 주사기 펌프는 샘플 또는 시 약의 병렬 로드에 대 한 필요 합니다.
핵 산의 다중 검출을 위한 현재 메서드에 연결 된 한계를 극복 하기 위해 우리 모 세관 배열로 시각적 램프 기술을 결합 하는 소형된 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼은 다중 대상, 소형 크기, 낮은 비용, 그리고28를 운영 하 게 쉬운. 여기, 모 세관 배열 조작 배열에 램프 반응을 수행 하는 방법의 세부 사항을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 모델 유전자 변형된 유기 체 (GMO) 검출을 사용 하 여 표준화 되어 있다. 중요 한 것은,이 프로토콜 다른 핵 산 대상의 높은 처리량 검색에도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 베어링 원하는 마이크로 채널 및 로딩 어댑터에 대 한 셰이프 스테인리스 형 되었습니다 이미이 프로토콜 가정 (3D 파일 추가 파일 1로 제공 됩니다과 2. ). 이 프로토콜은 또한 그 식물 DNA 분리 이미 실시 되었습니다 가정 합니다.
1. 모 세관 배열 기반 준비-사용 카세트의 제작
- 스테인리스 스틸 금형 청소.
- 잠재적인 오염 물질을 제거 하 세척 세제, 에탄올, 그리고 이온된 수 스테인리스 형
- . 질소에 의해 금형을 건조.
- 착용 안전 고글, 실험실, 균일 하 고 화학 보호 장갑.
- 비 커에 장소 모 세관입니다. 유기 물질을 제거 하 5 분 30 mL 아세톤으로 모세 혈관을 청소 하 고 다음 씻어 이온된 수와 모세 혈관.
주의: 증기 두건에서 아세톤 처리. - 는 H 2 O 2의 10 mL를 비이 커에 부 어 하 고 4와 H 2 O 2로 느린 과열을 방지 하기 위해 떨고 그래서 H 2의 30 mL를 추가 합니다. 솔루션 (피 솔루션) 완전히 적어도 30 분에 대 한 모세 혈관을 커버 있는지 확인
주의: 피 솔루션을 처리 하는 동안 조심 (H 2 이렇게 4/H 2 O 2 = 3: 1, v/v) . 피 솔루션을 유출 하는 경우 많은 양의 물으로 신속 하 게 솔루션을 씻어 하 고 닦아 종이 타 올으로 표면.
참고: 모 세관의 철저 한 청소 램프 반응의 성공을 위해 핵심 포인트 중 하나입니다. 그것은 모세에 거품을 제거 하는 청소 과정 동안 산 실린더를 흔들 필요가 그리고 깨끗 한 시간 필요할 때 확장할 수도 있습니다. - 피 솔루션 많은 양의 물으로 씻어. 에탄올과 5 분 이온된 수와 모세 혈관을 씻어. 건조 건조 오븐에서 모세 혈관.
- PDMS 기본 및 치료 시 약 50 mL 튜브에 1: 1의 비율으로 무게. 일반적으로, 혼합의 탄성 중합체 고무 경화제의 5 g에 기본 5 g.
- 철저 하 게 유리 막대와 약 5 분을 위한 혼합물을 저 어. PDMS와 튜브 드 가스에 대 일 분 동안 진공 벨 항아리에 배치.
- 스테인리스 스틸 금형의 실린더에는 PDMS를 천천히 부 어. 건조 오븐에서 60 ℃에서 3 h에 대 한 치료 PDMS 허용
참고: PDMS 붓는 때 공기 방울을 피하기 위해 조심. 붓는 PDMS 후 PDMS에서 거품의 자연적인 제거를 위한 5 분 동안 서 서 허용 그것.
- 는 PDMS, 경화 후 제거 형 실린더와 금형 밖으로 당겨. 메스와 금형의 여백 절단 하 여 원통에서 PDMS를 제거.
- 세척 PDMS 세 번와 에탄올 이온된 수. 질소 건조는 PDMS 지원.
- PDMS 지원에 모 세관을 삽입 PDMS 지원 구멍에 청소 4mm 모세 혈관을 삽입 하 고 떠나 PDMS 지원의 위쪽 표면 밖에 모 세관의 0.5 m m. 모 세관의 끝은 동일한 수준에 있는지 확인 하십시오.
- 지원. 코팅 즉시 모 세관 힘에 의해 (를 포함 하 여 PDMS 지원의 위쪽 표면 및 모 세관의 노출된 부분의 외부 표면) 상단 표면 전체 스프레드.
- 뇌관 솔루션을 준비. 0.65 g 키토 산 밖으로 무게 (분자 공식: (C 6 H 11 아무 4) n) 4.5-5.5 1.3%의 키토 산 농도 달성 하기 위해 초 산으로 pH를 조정 하 여 50 mL 이온된 수로 그것을 해산 하 고. 표 1에 의하여 뇌관 구성 믹스를 준비 합니다. 프라이 머에 대 한 보충 표 1을 참조 하십시오
- 집합이 미리 정의 된 순서에 따라 모 세관 배열의 한 해당 모 세관 채우기 위해 뇌관의 혼합물의 추가 1.6 µ L.
참고: 나머지 두 빈 모 세관 부정적인 컨트롤로 설정 했다. - 앵커에 표준 플랫 바닥 96 잘 접시의 투명 한 잘 배열 하 고 적어도 2 h. 60 ° C에서 배열 건조
| 램프 뇌관 믹스 구성 요소 (초기 농도) 고정 | 볼륨 (μ) |
| ddH 2 O | 17.0 |
| 키토 산 (1.3%) | 1.0 |
| FIP/BIP 뇌관 (20 μ M) | 2.0/2.0 |
| LoopF/LoopB 뇌관 (20 μ M) | < td > 1.0/1.0|
| f 3/B3 뇌관 (20 μ M) | 0.5/0.5 |
| 총 볼륨 | 25.0 |
표 1: 램프의 구성 요소 담합 시 약 뇌관. 램프 뇌관 고정 믹스의 구성 요소는 테이블의 왼쪽된 열에 나열 된 및 각 부품의 오른쪽 열에 나열 됩니다.
- 조립 카세트 다음과 같습니다. 고정된 배열 위에 로드 어댑터를 넣어. 어댑터의 접시는 그냥 모든 10 모세 (참조 그림 1)의 노출된 부분을 다루고 있는지 확인 하십시오.
그림 1: 카세트 제조 및 어셈블리. (한) 스테인레스 형과 PDMS를 지원합니다. 금형 3 부분으로 구성 됩니다: 실린더, 댐 보드, 그리고 기둥 판. (b) PDMS의 회로도 지원 제조 그리고 모 세관 카세트의 조립. 5 단계를 포함 하는 전체 과정: 1. PDMS 따르고, 2. 곰 팡이 제거, 3. 모 세관 삽입 및 표면 코팅, 4. 뇌관 및 5. 카세트 정박입니다. 1. 금형;의 실린더 내 PDMS 붓으십시오 2. 댐 보드 밖으로 밀어 PDMS 몰드를 제거 지원; 3. 코트 PDMS의 아래쪽 표면 지원과 다음 모세는 PDMS 삽입 지원, 마지막으로 하 게 PDMS 지원의 상부 표면 코트 하 고 모세 혈관을 노출. 두꺼운 파란색 선이 나타냅니다 슈퍼 소수 코트; 4. 로드 뇌관 개별 모세 혈관;로 설정 5. 앵커 단일 96 잘 접시에 모 세관 배열 및 그것에 어댑터를 로드 하는 예제를 설치 합니다. 세부는 프로토콜 단계 1.1-1.9에에서 설명 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 모 세관 배열에서 램프의 성능 반응
- 준비 반응 혼합
- T 수 2에 의하여 램프 반응 혼합 준비.
- 선택한 순서 대로, 표 2, 그리고 소용돌이 반응 혼합물 5 혼합물에 추가 시 약 s calcein를 추가한 후. 부드럽게에버텍스 Bst 중 합 효소 후 20 번 튜브 추가 됩니다.
| 램프 구성 요소 (초기 농도) | 볼륨 (μ) |
| ddH 2 O | 11.6 |
| MgSO 4 (100mm) | 2.0 |
| dNTPs (25 mM) | 1.4 < /t d > |
| Betaine (5m) | 4.0 |
| 버퍼 (10 배) | 2.5 |
| Calcein (1.25 m m) | 0.5 |
| MnCl 2 (25 mM) | 0.5 |
| Bst < /em > 중 합 효소 (8 U/μ) | 1.5 |
| DNA를 식물 (10 ng/μ) | 1.0 |
| 총 볼륨 | 25.0 |
표 2: 모 세관 배열 램프의 반응 시스템. 모 세관 배열 램프 구성 요소 반응 시스템의 구성 요소 왼쪽된 열에 나열 되 고 각 구성의 오른쪽 열에 나열 됩니다.
- 는 시 약을 로드 하 고 카세트 인감
- 피 펫 20 µ L 램프 반응 혼합물 표준 100 µ L 팁. 에 그것을 잠글 수 로드 어댑터의 끝을 삽입 합니다. 부드럽게 어댑터;의 접시에 반응 혼합물을 주사 반응 혼합물 것입니다 신속 하 게 요리를 모 세관 힘을 통해 자동으로 모 세관 로드.
- 잠긴된 팁과 어댑터를 제거 하 고 PCR 호환 투명 봉인 영화도 잘 봉인.
참고: 친수성 접시에 반응 혼합물을 만지고 모세 혈관만 가득 수 있습니다. 그래서 같은 높이 (참조 그림 2)의 모든 모세 혈관의 상부는 다는 것을 확인.
그림 2: 샘플 로딩 로딩 어댑터를 사용 하 여 다이어그램. 그림 예를 들어 블루 솔루션을 채용 하는 로드 프로세스를 보여 줍니다. 에 팁을 삽입 하 고 주입 샘플 어댑터 천천히, 잠긴된 팁과 어댑터를 제거 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 품 1 h. 63 ° C에서 인큐베이터에서 모 세관 배열
3. 결과 판독 및 데이터 분석
- 형광 방출의 이미지.
- 가시 광선을 필터링 하는 작은 휴대용 UV LED 손전등의 위쪽 표면에 UV 필터를 수정.
- 는 자외선 손전등과 형광을 방출 하는 해리 calcein를 자극 합니다. 디지털 카메라 또는 스마트폰으로 모 세관 배열 위에서 이미지를 캡처.
- 이미지를 찍을 때 카메라는 모세 혈관을 높은 품질, 이미지 취소 가능한 만큼의 영역 확대 된 확인 하십시오.
- 분석 결과
- 이미지에 의해 이미지 분석 소프트웨어를 열고 다음 선택 " 이미지 > 형 > 회색조 > 예 "와 " 이미지 > 형 > 16 비트 > 네 ". 선택 " 파일 >로 저장 > 형식 > TIFF " 16 비트 TIFF 형식으로 이미지 변환 하.
- 는 Microarray 분석 소프트웨어
- 오픈 형광 강도의 값을 추출합니다. 소프트웨어의 인터페이스에 16 비트 TIFF 형식 이미지를 끌어서 다음의 파장을 선택 " 532 nm "의 색과 " 녹색 " 이미지를 표시 하.
- 만들기 새로운 블록을 모세 혈관에서 형광 신호를 찾습니다. 선택 " 도구 > 새로운 블록 "로 행과 열 수를 입력 하 고 " 1; 1 " 및 " 2; 5 "에 ' 블록 ' 및 ' 기능 ' 별도로 인터페이스.
- 오른쪽 클릭 하 고 선택 " 기능 " 모델 및 위치와 직경 모 세관의 형광 영역에 맞게 조정 합니다. 선택 " 분석 " 형광 강도의 값을 추출 하.
- 선택 " 파일 >로 설정을 저장 " 블록 문서 저장을 선택 " 파일 >으로 결과 저장 " 형광 강도 결과 저장 하려면. 램프는 모 세관에서 성공적으로 수행 되는지 여부를 정의 하는 SNR 계산.
참고:은 모세 혈관의 신호 기록 관광 명소 및 신호 잡음 비율 (SNRs)를의 회색 값 두 부정적인 전경 신호의 평균 평균값을 대상의 전경 신호의 평균값의 비율으로 정의 된에 의해 가져온 제어 합니다. 긍정적인 신호를 확인 하기 위해 컷오프 SNR로 설정 된 > 2.
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Representative Results
이 방법에서는, 그것은 샘플 로드 하는 동안 다른 모세 혈관 간의 교차 오염을 방지 하는 것이 중요입니다. 이 개별 모 세관에 뇌관을 유지 수 있는 키토 산 도입 되었다. 그것은 일 또는 하지 여부를 테스트 하려면 우리 미리 고정 ADH1 (옥수수의 유전자 생 참조) 뇌관 "T"와 "U"의 패턴으로 모 세관 카세트에 설정에서 볼 수 있듯이 그림 3a. 예상 대로 포함 된 모세 혈관 뇌관만 설정 보여주는 긍정적인 신호 (그림 3b).
그림 3: 모 세관 결과의 예. (한) 모 세관 배열의 레이아웃. 녹색 관광 명소 ADH-1 뇌관 세트 모 세관에 미리 고정 됩니다 나타냅니다. (b) 형광 램프 후 두 모 세관 배열의 사진. 녹색 색상 긍정적인 램프 확대 발표. 시험 중복 수행 했습니다. 만 빈 모 세관 중 오염 없이 뇌관 고정 모 세관에 제시 하는 성공적인 증폭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
더 GMO를 모니터 하는 능력을 평가, 우리 7 자주 사용 유전자 변형 요소 상용화 GMO 이벤트 ~ 75%를 커버 선택 (즉, P-CaMV35S 바, cp4 epsps, P-FMV35S, 팻, T-nos 및 nptII) (그림 4, 레이아웃)는 모 세관 번호 1-7, 그리고 옥수수 (ADH1)에 대 한 하나의 내 생 참조 유전자에 해당 합니다. 이 방법, 3 GM 이벤트의 특이성을 표시 (MON863, MON89034, 및 59122) 선정 되었고 진정에 적용. 분석 결과, 형광 이미지는 카메라에 의해 촬영 되었고 분석 프로토콜 단계에 설명 된 대로. 예상된 결과 모든 테스트 (그림 4)에 대 한 획득 했다. 예를 들어 GM 옥수수 MON863에 대 한 긍정적인 신호 가져온 1, 6, 7, 및 8, 대상 P-CaMV35S에 해당 하는, 모세 혈관에 대 한 T-nos, nptII, 그리고 생 참조 유전자 ADH1, 각각.
그림 4: 모니터링 GMOs에 대 한 특이성. 다른 DNA 샘플, 즉의 탐지 MON863, MON89034, 59122, 모든 위의 3의 혼합 GM 이벤트 (GMO 믹스), 비-GM 옥수수 및 순수한 물 (서식 파일 통제, NTC). 1-8: 모세 미리 바, cp4 epsps, P-FMV35S, 팻, T-nos nptII, P-CaMV35S 및 ADH-1, 램프 뇌관 세트와 함께 개별적으로 고정. 9-10, 두 아니 뇌관 컨트롤입니다. 시험 중복에서 수행 하 고 우리가 발견 하는 모든 결과 기대와 일치 했다. 데이터 분석에 대 한 보충 표 2 를 참조 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
우리의 방법의 성능을 현실 세계 응용 프로그램에서을 테스트 하려면 두 개의 실용적인 옥수수 샘플 분석을 위해 진정 선정 됐다. 다음 결과 비교 되었다 실시간 PCR 및 결과 일관성 (그림 5, 표 2 보충) 했다
그림 5: 두 개의 옥수수 샘플 테스트 결과. 1-8: 모세 혈관 중 램프 뇌관 세트의 바, cp4 epsps, P-FMV35S, 팻, T-nos nptII, P-CaMV35S 와 ADH-1, 개별적으로 고정. 9-10, 두 아니 뇌관 컨트롤입니다. 중복에서 테스트 수행 및 결과 실시간 PCR의 비교 되었다 그리고 결과 일관 했다. 비교 결과 대 한 보충 표 3 을 참조 하십시오. 데이터 분석에 대 한 보충 표 2 를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 1: 목록의 램프 뇌관 시퀀스. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 2: 램프의 데이터 분석 실험 배열. 테이블에 녹색 색상 코드 셀 긍정적인 결과 나타냅니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 3: 실시간 PCR 결과 보고 양식. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
진정 플랫폼 시연, 여기는 모 세관 배열 램프 기술을 결합, 단일, 매우 효과적이 고 테스트를 운영 하 게 쉬운에서 여러 유전자 GMO 관련 목표의 동시 탐지를 가능 하 게.
카세트에서 다중 램프 반응을 성공적으로 수행 하려면 세 가지 중요 한 포인트 주의 될 필요가 있다. 첫째, 모세 혈관의 상부 및 모 세관 배열의 친수성 및 소수 성 패턴에 대 한 동일한 높이 달성가 동시에 모든 모세 혈관에 시 약을 로드 합니다. 모 세관 로드 어댑터의 접시에 로드 반응 혼합물을 만질 수 있는 초기 PDMS 지원을 그들의 모든 삽입 후 접시에 의해 정렬 되어야 한다. 슈퍼 소수 코트와 모 세관 배열을 대우 할 때 모세 혈관의 안쪽 표면에 담가 외 투를 허용 하지 않습니다. 그냥 코트 PDMS 지원, 모 세관의 상단 부분의 외부 표면에 확산 코팅 수 탑의 위쪽 표면에 로드 하 여 모세 혈관의 외부 표면을 취급 합니다. 경우 그것은 때때로 모든 모세는 시 약으로 가득 차 있습니다, 그것은 특정 모 세관에 직접 약을 로드 하 수 있습니다.
둘째, 램프 시 약의 준비와 주의 해야 합니다. 전체 프로세스는 실행 되어야 한다 빠르고 부드럽게 밖으로 얼음 램프의 상대적으로 낮은 반응 온도 Bst 중 합 효소의 취약성 때문에. 영국 서머 타임 중 합 효소를 추가한 후 vortexing 튜브 대신 부드럽게 램프 혼합 반응 관을 뒤흔들 적당 하다. 부적 절 한 처리는 반응의 실패를 일으킬 수 있습니다. 이 실험에서 ADH1 (옥수수의 유전자 생 참조) 긍정적인 컨트롤로 설정 되 고 프라이 머 없이 두 모 세관 빈 컨트롤로 설정 됩니다. 그래서, 램프 혼합물 올바르게 처리 하는 경우 긍정적인 제어 녹색 표시 하 고 테스트 수행 후 빈 컨트롤 변경 되지 것입니다.
셋째, 램프 반응의 높은 효율으로 인해 거짓 긍정 또는 carryover 오염 환경에서 DNA amplicon의 양을 추적 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 항상 명심을 사전 반응 및 반응 후의 운영 프로세스를 엄격 하 게 다른 지역에서 분리 되어야 한다 램프 제품을 단단히 밀봉 하 고 분석 후 삭제 한다. 또한, 램프의 적절 한 성능을 나타내는 대 한 빈 제어를 설정 해야 합니다.
본질적으로, 진정 좋은 유연성과 확장성 범용 다중 대상 핵 산 탐지 방법입니다. 모세 혈관에서 램프 반응 recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)30원 증폭 (RCA)29, 롤링 등 등온 증폭 방법의 다른 유형에 의해 쉽게 교체하실 수 있습니다. 그것은 또한 병원 체 검출27 및 질병 진단31등의 다른 검색 분야에 적용할 수 있습니다.
이 방법의 현재 형태로 뇌관 세트는 키토 산, 미리 고정 있지만 램프 혼합물 준비 과정 아직도 필요 하다 때 테스트 수행 방법의 단순을 절감 하. 이 해결 하기 위해 우리 것 하려고 모 세관에 있는 램프의 모든 시 약을 미리 로드 하 고 다음 샘플 카세트에 플라스틱. 우리의 방법에 대 한 또 다른 한계는 핵 산 추출의 부족 있을 수 있습니다 하지만 우리는 지금 것 결합 핵 산, 자동 이미지 및 데이터 분석 "샘플 및 결과-아웃 진짜 달성을 추출 하는 모바일 기반 기계 개발 "방법입니다.
요약 하자면, 우리 모 세관 배열과 다중 램프를 통합 하 여 진정 플랫폼을 개발 했습니다. 일반적인 핵 산 탐지 방법으로 진정 다른 핵 산 분석 응용 프로그램의 넓은 범위에서 잠재력을 있을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구에서 새로운 세기 뛰어난 재능에 대 한 국가 자연 과학 재단의 중국 보조금 (31370813, 3147670, 31670831 및 31600672,), 국립 유전자 변형 식물 특별 기금 (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), 프로그램 부분에 투자 되었다 대학, 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 (2016YFA0500601) 중국과 중국 박사 후 과학 재단 (2016 M 591667).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
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