Summary
ويصف هذا البروتوكول تلفيق كاسيت صغير، وجاهزة للاستخدام التي يمكن تطبيقها للكشف البصري للأحماض النووية متعددة في اختبار واحد، التي من السهل أن تعمل. واستخدمت مجموعة شعرية في هذا النهج، للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا أهداف متعددة وذات كفاءة عالية.
Abstract
متعدد الأهداف ووقت قصير، ومنهجيات الموارد معقولة للكشف عن الأحماض النووية متعددة في واحد، سهلة لتشغيل الاختبار مطلوبة على وجه السرعة في تشخيص الأمراض، ورصد العوامل الجرثومية، الكشف عن الكائنات الحية المعدلة وراثيا (جينياً)، و تحليل الطب الشرعي. التي وصفناها سابقا منهاج تسمى الهدوء (جأبيلاري أعلى أساس ررأى Lصافية بوساطة متحاور التضخيم مأولتيبليكس البصرية الكشف عن الأحماض النووية). وهنا، يصف لنا تلفيق محسنة وعمليات الأداء لهذا النظام الأساسي. وهنا نطبق كاسيت صغير، وجاهزة للاستخدام يجمعها الصفيف الشعرية للكشف البصري متعدد من الأحماض النووية. الصفيف الشعرية ما قبل المعالجة في نمط مسعور وماء قبل تحديد مجموعات التمهيدي بوساطة حلقة التضخيم متحاور (المصباح) في الشعيرات الدموية. بعد التجميع محول التحميل، تحميل خليط رد مصباح ومعزولة في كل شعري، بسبب القوة الشعرية بخطوة واحدة بيبيتينج. مصباح ردود أفعال تتم بالتوازي في الشعيرات الدموية. النتائج بصريا تلا بالإضاءة مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد. باستخدام هذا البرنامج، علينا أن نبرهن على رصد 8 كثيرا ما تظهر العناصر والجينات في عينات الكائنات المعدلة وراثيا بخصوصية عالية وحساسية. وباختصار، يهدف منهاج العمل الموضحة هنا تيسير الكشف عن الأحماض النووية متعددة. ونحن نعتقد أنه سيكون التطبيق على نطاق واسع في المجالات التي يكون مطلوباً فيها تحليل الحمض النووي الفائق.
Introduction
نظم منخفضة التكلفة وسريعة وسهلة الاستخدام للكشف عن الأحماض النووية متعددة متزامنة هناك حاجة ماسة في طائفة واسعة من المجالات، مثل التشخيص السريري1،2،3، الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا4، 5،6، الميكروبية رصد7،،من89وتحليل الطب الشرعي10،11، واختبارات خاصة نقطة من الرعاية (بوكتس)، حيث الموارد هي عادة ما تكون محدودة12،،من1314.
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بما في ذلك أساليب مشتقة PCR الوقت الحقيقي وبكر متعدد، هو أسلوب المطبقة على نطاق واسع للكشف في هذه الميادين. ومع ذلك، هذه الأساليب عادة سوى الكشف عن هدف واحد في اختبار واحد15 وأنها تتطلب الكهرباء والمعدات الفنية المتطورة.
هو آخر تكنولوجيا واعدة للكشف عن الأحماض النووية بوساطة حلقة متحاور التضخيم (المصباح)، الذي كان أول من وصف في عام 200016. مصباح كفاءة عالية طريقة الكشف عن الحمض النووي. نظرياً، تضخيم من النسخة 1 إلى 109 نسخ من أمبليكونس في غضون ساعة واحدة، كل إجراء في درجة حرارة ثابتة، (أيبين 60-65 درجة مئوية). التضخيم ناجحة سوف تنتج كمية كبيرة من بيروفوسفات ثانوي غير قابلة للذوبان وتسبب تغييرا في تعكر17، الذي يمكن ملاحظته مباشرة بالعين المجردة. ويمكن أيضا ملاحظة تغيير لون بإضافة أيونات معدنية أو صبغات الفلورسنت مثل18و صبغ الحمض النووي19هيدروكسيل نافثول الأزرق20كالسين. بسبب مزايا عالية الحساسية، وتسهيلا للعملية، ويجري تطبيق مصباح على نطاق واسع في الكشف عن الحمض النووي.
حاليا، هناك أساسا استراتيجيتين لفحوصات مصباح متعدد. واحد لإجراء فحوصات مصباح متعددة بوجود مصباح متعددة تعيين التمهيدي في أنبوب واحد21،،من2223. ومع ذلك، ستكون محدودة التعدد وكفاءة التضخيم تدخل الذاتية والمنافسة بين مجموعات مختلفة من التمهيدي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون من الصعب تحديد منتجات مصباح مختلفة في نفس رد الفعل. استراتيجية أخرى يستند إلى العزلة المادية. مجموعات مختلفة من التمهيدي كانت معزولة في المقصورات المنمنمة الفردية، وردود الفعل مصباح متعددة ثم تتم في وقت واحد24،25. هذه الطرق، التي تستند بوجه عام إلى رقائق موائع جزيئية، توفر حلاً محتملة لردود فعل مصباح الفائق. تصنيع الرقائق وطلاء متعدد قبل مجموعات التمهيدي غير المعقدة، التي قد تزيد من التكاليف وتقليل إمكانية تكرار نتائج.
في الآونة الأخيرة، عدد قليل من الدراسات قد وصف ردود الفعل مصباح المنفذ في الشعيرات الدموية لتجاوز تصنيع رقائق موائع جزيئية معقدة وقد حققت الكشف منخفضة التكلفة26،27. فيما يتعلق بالتحليل الفائق، وهذه الشعيرات الدموية غير مشابهة لإصدارات مصغرة من أنابيب قطاع بكر، نظراً للعينات ورد فعل الكواشف (بما في ذلك مجموعات مختلفة التمهيدي) يجب إعداد فردياً وتسليمها إلى مختلف رد فعل الوحدات داخل الشعيرات الدموية. لتحقيق تحليل متعدد ومتوازية، معدات إضافية، على سبيل المثال مضخة الحقن متعددة القنوات، مطلوب لتحميل موازية للعينات أو المواد الكاشفة.
للتغلب على القيود المرتبطة بالأساليب الحالية للكشف عن تعدد الإرسال من الأحماض النووية، قمنا بتطوير منصة المنمنمة الذي يجمع بين التكنولوجيا البصرية ومصباح مع مجموعة شعرية. هذا البرنامج متعدد الأهداف، مدمجة الحجم، منخفضة التكلفة، وسهلة لتشغيل28. هنا، نحن تصف تفاصيل كيفية اختﻻق الصفيف الشعرية والقيام بردود فعل مصباح في الصفيف. وقد تم توحيد البروتوكول الموصوفة هنا استخدام الكشف عن الكائنات الحية المعدلة وراثيا (جينياً) كنموذج. الأهم من ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول في الكشف عن الفائق لأهداف أخرى الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أن العفن الفولاذ المقاوم للصدأ مع الشكل المطلوب الصغرى-القنوات وتحميل محول قد أحرز بالفعل (يتم توفير الملفات الثلاثية الأبعاد ك 1 ملفات تكميلية و 2. ). ويفترض هذا البروتوكول أيضا قد أجريت فعلا محطة عزل الحمض النووي-
1-تلفيق الكاسيت المستندة إلى "مجموعة شعرية" جاهزة للاستخدام
- تنظيف العفن الفولاذ المقاوم للصدأ.
- الغسيل العفن الفولاذ المقاوم للصدأ بالمنظفات الصناعية، الإيثانول والمياه لإزالة الملوثات المحتملة. جاف العفن بالنيتروجين.
- تنظيف الشعيرات الدموية
- السلامة ارتداء نظارات واقية، مختبر موحدة، والكيميائية قفازات واقية.
- مكان الشعيرات الدموية في كوب. تنظيف الشعيرات الدموية مع الأسيتون 30 مل لمدة 5 دقائق لإزالة المواد العضوية ومن ثم يغسل الشعيرات الدموية مع المياه..
تنبيه: تعامل مع الأسيتون في غطاء دخان. - صب 10 مل ح 2 س 2 في الكأس ثم قم بإضافة 30 مل ح 2 حتى 4 في 2 س ح 2 مع بطء تهتز لمنع الانهاك. تأكد من أن الحل (حل البيرانا) يغطي تماما الشعيرات الدموية لمالا يقل عن 30 دقيقة
تنبيه: كن حذراً أثناء التعامل مع الحل البيرانا (ح 2 هكذا 4/H 2 س 2 = 3:1، v/v) . إذا كان هو الحل البيرانا المسكوب، يغسل الحل بسرعة مع كمية كبيرة من الماء ومسح السطح مع مناشف ورقية.
ملاحظة: تنظيف شامل من الشعيرات الدموية واحدة من النقاط الرئيسية ضمان النجاح لرد فعل مصباح. من الضروري أن يهز الاسطوانة حمض أثناء عملية تنظيف لإزالة الفقاعات في الشعيرات الدموية، ويمكن أيضا تمديد الوقت نظيفة عند الحاجة. - يغسل الحل البيرانا مع كمية كبيرة من الماء. أغسل الشعيرات الدموية مع الإيثانول والمياه لمدة 5 دقائق. الجاف الشعيرات الدموية في فرن تجفيف.
- من أجل بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)
- الوزن من الكواشف PDMS قاعدة وعلاج بنسبة 1:1 في أنبوب 50 مل. عادة ما تخلط 5 غ من قاعدة إلى 5 غ الاستومر علاج عامل الاستومر.
- يحرك الخليط جيدا لمدة 5 دقائق تقريبا بقضيب زجاج. ضع الأنبوب مع PDMS في جرة الجرس فراغ لمدة 30 دقيقة لفصل الغاز-
- صب PDMS بطء في الاسطوانات من الفولاذ المقاوم للصدأ العفن. السماح PDMS علاج ح 3 في فرن تجفيف عند 60 درجة مئوية
ملاحظة: يجب الحرص على تجنب فقاعات الهواء عند سكب PDMS. بعد صب PDMS، السماح لها الوقوف لمدة 5 دقائق لإزالة الطبيعية لفقاعات خارج PDMS.
- إزالة العفن من PDMS
- بعد علاج في PDMS، إزالة العفن بسحب القالب مع اسطوانة. إزالة PDMS من الاسطوانة عن طريق خفض هامش العفن مع مشرط.
- PDMS يغسل ثلاث مرات مع الإيثانول والمياه. الجافة PDMS دعم مع النيتروجين.
- علاج السطح السفلي لدعم PDMS أن يكون عمود المصباح. نقع PDMS دعم في مسعور فائقة معطف الجاف س. 1 عليه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة- تضاف الشعرية إلى دعم PDMS
- إدراج الشعيرات الدموية تنظيفها 4 مم في الثقوب لدعم PDMS وترك 0.5 مم من الشعيرات الدموية خارج السطح العلوي لدعم PDMS. تأكد من نهايات الشعيرات الدموية في نفس المستوى-
- علاج السطح الخارجي الشعيرات الدموية والسطح العلوي لدعم PDMS أن يكون عمود المصباح.
دعم
- إضافة 15 ميليلتر معطف فائقة مسعور على السطح العلوي PDMS. لاحظ أنه الطلاء ينتشر فورا في جميع أنحاء السطح العلوي (بما في ذلك السطح العلوي لدعم PDMS والأسطح الخارجية للجزء الظاهر من الشعيرات الدموية) بالقوة الشعرية.
- الهواء الجاف الصفيف الشعرية معدلة فائقة مسعور.
- إصلاح التمهيدي إلى صفيف الشعرية
- إعداد الحل التمهيدي. الوزن من الشيتوزان ز 0.65 (الصيغة الجزيئية: (ج 6 ح 11 رقم 4) n) وتذوب في الماء 50 مل منزوع بضبط درجة الحموضة إلى 4.5 5.5 مع حمض الخليك لتحقيق تركيز الشيتوزان 1.3 في المائة. إعداد التمهيدي مزيج المكونات وفقا الجدول 1. انظر التكميلية الجدول 1 للإشعال
- ميليلتر إضافة 1.6 من خليط مجموعة واحدة من كبسولة تفجير لملء شعري المقابلة واحدة من الصفيف الشعرية تبعاً لترتيب مصممة مسبقاً.
ملاحظة: تم تعيين الشعيرات الدموية فارغة اثنين المتبقية كعناصر سلبية. - مرساة الصفيف في بئر شفافة من صفيحة 96-كذلك قاع مسطح القياسية وجاف الصفيف عند 60 درجة مئوية على الأقل 2 حاء
| التمهيدي مصباح تحديد مكونات مزيج (تركيز أولى) | "وحدة التخزين" (ميكروليتر) |
| ddH 2 س | 17.0 |
| الشيتوزان (1.3%) | 1.0 |
| FIP/المقاضاة التمهيدي (20 ميكرومتر) | 2.0/2.0 |
| لووبف/لووبب التمهيدي (20 ميكرومتر) | < td > 1.0/1.0|
| F3/B3 التمهيدي (20 ميكرومتر) | 0.5/0.5 |
| الحجم الإجمالي | 25.0 |
الجدول 1: مكونات مصباح الدليل التمهيدي لتحديد الكواشف. يتم سرد عناصر التمهيدي مصباح تحديد المزيج في العمود الأيمن من الجدول، ويتم سرد وحدة التخزين لكل عنصر في العمود الأيمن.
- تجميع الكاسيت على النحو التالي. وضع محول تحميل على الجزء العلوي من المصفوفة الرأسية. تأكد من أن يغطي طبق المحول فقط الأجزاء المكشوفة من كل عشرة الشعيرات الدموية (انظر الشكل 1).
الرقم 1: تصنيع كاسيت والجمعية- () المقاوم للصدأ العفن و PDMS الدعم. العفن ويتكون من 3 أجزاء: اسطوانة والمجلس السد، ودعامة لوحة. (ب) تخطيطي PDMS دعم التصنيع والجمعية للكاسيت الشعرية. العملية برمتها ويتضمن 5 خطوات: 1. PDMS صب، 2. العفن إزالة، 3-إدراج الشعرية وطلاء السطح، 4. تحديد التمهيدي و 5. ترسيخ كاسيت. 1-صب PDMS في اسطوانة العفن؛ 2-دفع خارج المجلس السد لإزالة العفن من PDMS الدعم؛ 3-معطف أسفل سطح PDMS دعم ثم قم بإدراج الشعيرات الدموية في PDMS دعم وأخيراً معطف السطح العلوي لدعم PDMS وتعرض الشعيرات الدموية. ويشير الخط الأزرق السميك إلى معطف مسعور فائقة؛ 4-تحميل أول كتاب تعيين إلى الشعيرات الدموية الفردية؛ 5-ربط الصفيف الشعرية في صفيحة 96-بئر واحدة وتثبيت عينة تحميل محول على ذلك. وقد وصف التفاصيل في البروتوكول خطوات 1.1-1.9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. رد فعل "الأداء من مصباح" في "صفيف الشعرية"
- تحضير مزيج رد فعل
- إعداد مزيج رد فعل مصباح حسب تي 2 قادرة على.
- الكواشف إضافة إلى الخليط وفقا للترتيب الذي تم اختياره، كما هو الحال في الجدول 2، ودوامه الخليط رد فعل ل 5 s بعد إضافة كالسين. برفق فيعمودي إضافة أنبوب 20 مرة بعد بوليميراز Bst.
| مكونات مصباح (الأولى تركيز) | "وحدة التخزين" (ميكروليتر) |
| ddH 2 س | 11.6 |
| مجسو 4 (100 ملم) | 2.0 |
| دنتبس (25 مم) | 1.4 |
| بروبيل بتائين (م 5) | 4.0 |
| المخزن المؤقت (10 x) | 2.5 |
| كالسين (1.25 مم) | 0.5 |
| 0.5 | منالحركة 2 (25 مم) |
| بتوقيت جنوب بريطانيا < /em > بوليميراز (يو 8/ميكروليتر) | 1.5 |
| زرع الحمض النووي (10 نانوغرام/ميكروليتر) | 1.0 |
| الحجم الإجمالي | 25.0 |
الجدول 2: النظام رد فعل شعري الصفيف-مصباح. مكونات نظام رد الفعل لمكونات مصباح الصفيف الشعرية المذكورة في العمود الأيسر، وحجم كل عنصر مسرود في العمود الأيمن.
- تحميل الكواشف وختم الكاسيت
- نصيحة ميليلتر
- ماصة 20 ميليلتر مصباح رد فعل خليط مع 100 قياسية. إدراج التلميح إلى المدخل لتحميل محول تأمينه. بلطف بحقن الخليط رد فعل طبق محول؛ الخليط رد فعل سيتم ملء الطبق بسرعة ثم قم بتحميل الشعيرات الدموية تلقائياً من خلال القوة الشعرية.
- إزالة المحول مع طرف مؤمن وختم البئر بفيلم ختم شفافة متوافقة مع بكر.
ملاحظة: يمكن شغل سوى الشعيرات الدموية لمس الخليط رد فعل في طبق ماء. لذا تأكد من الجانب العلوي من جميع الشعيرات الدموية من نفس الارتفاع (انظر الشكل 2).
رقم 2: رسم تخطيطي لتحميل نموذج لاستخدام محول التحميل. توضح الصورة عملية تحميل توظيف الحل الأزرق كمثال. إدراج التلميح إلى المدخل وحقن العينة في المحول ببطء، ومن ثم قم بإزالة المحول مع نصيحة مؤمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إينكوباتي الصفيف الشعرية في حاضنة في 63 درجة مئوية حاء – 1
3-قراءات النتائج وتحليل البيانات
- الحصول على صور انبعاث fluorescence.
- إصلاح فلتر الأشعة فوق البنفسجية على السطح العلوي لمصباح LED الأشعة فوق البنفسجية باليد الصغيرة لتصفية الضوء المرئي.
- تثير كالسين منفصلان تنبعث منها الأسفار مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية. التقاط الصور من الجزء العلوي من المصفوفة الشعرية بكاميرا رقمية أو هاتف ذكي.
- عند أخذ صورة، التأكد من أن الكاميرا هو التكبير على المنطقة من الشعيرات الدموية إلى أقصى حد ممكن الحصول على جودة عالية، ومسح الصور.
- تحليل النتائج
- فتح برنامج تحليل الصور بالصور ومن ثم حدد " الصورة > العفن > الرمادي > نعم " و " الصورة > العفن > 16 بت > نعم ". حدد " ملف > حفظ > تنسيق > TIFF " لتحويل الصورة إلى تنسيق TIFF 16 بت.
- استخراج قيمة كثافة الأسفار
- فتح البرنامج تحليل ميكرواري. اسحب الصورة تنسيق TIFF 16 بت إلى واجهة البرنامج ثم قم بتحديد الطول الموجي ل " 532 نانومتر " ولون من " الأخضر " لعرض الصورة.
- إنشاء كتلة جديدة لتحديد موقع إشارة الأسفار من الشعيرات الدموية. حدد " أدوات > كتل جديدة " وإدخال عدد الأعمدة والصفوف كما " 1; 1 " و " 2؛ 5 " في ' كتل ' و ' ميزات ' واجهات بشكل منفصل.
- حق انقر فوق وحدد " ميزات " نموذج ثم قم بضبط موقع وقطر لتلائم المساحة الأسفار من الشعيرات الدموية. حدد " تحليل " لاستخراج قيمة كثافة fluorescence.
- تحديد " ملف > حفظ الإعدادات باسم " حفظ المستندات كتل وحدد " ملف > حفظ النتائج ك " لإنقاذ الأسفار كثافة النتائج. حساب دائرة الاستخبارات الوطنية لتحديد ما إذا كان مصباح تتم بنجاح في الشعيرات الدموية.
ملاحظة: تم الحصول على إشارات من الشعيرات الدموية بتسجيل تم تعريف قيم الرمادي البقع وإشارة إلى نسب الضوضاء (سنرس) كنسب قيم المتوسط الحسابي من إشارات المقدمة من الأهداف إلى متوسط القيم الوسطية الأمامية الإشارات السلبية اثنين عناصر التحكم. تم تعيين قطع لتحديد إشارات إيجابية كدائرة الاستخبارات الوطنية > 2-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا الأسلوب، من المهم منع التلوث المتبادل بين الشعيرات الدموية المختلفة أثناء تحميل النموذج. لهذا الغرض، قدم الشيتوزان، التي يمكن أن تحتفظ الإشعال في الشعيرات الدموية الفردية. لاختبار ما إذا كان يعمل أو لا، أننا قبل ثابتة التمهيدي (الجينات المرجعية الذاتية من الذرة) ADH1 في الكاسيت الشعرية مع نمط "T" و "U"، كما هو موضح في الشكل 3a. كما هو متوقع، التمهيدي الشعيرات الدموية الواردة فقط تعيين إظهار إشارات إيجابية (الشكل 3b).
رقم 3: أمثلة للنتيجة الشعرية. () تخطيط الصفيف الشعرية. البقع الخضراء تشير إلى أن مجموعات التمهيدي ADH-1 قبل ثابتة في الشعيرات الدموية. (ب) الفلورسنت الصور الفوتوغرافية الصفيفين الشعرية بعد مصباح. وقدم اللون الأخضر التضخيم مصباح إيجابية. وأجرى الاختبار في مكررة. نجاح التضخيم فقط قدمت في الشعيرات الدموية التمهيدي ثابتة ودون تلوث بين الشعيرات الدموية فارغة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
لمواصلة تقييم القدرة على رصد الكائنات المعدلة وراثيا، اخترنا العناصر المعدلة وراثيا السبعة المستخدمة بشكل متكرر تغطية ~ 75% الأحداث المعدلة وراثيا تجارياً (أي، ف-CaMV35S، شريط، cp4 ابسبس، ف-FMV35S، بات، غ ر ونبتيي) (الشكل 4، تخطيط) التي تقابل عدد الشعيرات الدموية 1-7، وواحد من الجينات المرجعية الذاتية للذرة (ADH1). لإظهار الطابع الخاص لهذا الأسلوب، والآلية العالمية ثلاثة أحداث مختارة (MON863 و MON89034 و 59122) وتطبيقها على الهدوء. لتحليل النتائج، اتخذتها كاميرا الصور الفلورية وتحليلها كما هو موضح في الخطوات البروتوكول. تم الحصول على النتائج المتوقعة لكافة الاختبارات (الشكل 4). على سبيل المثال، ل MON863 الذرة المعدلة وراثيا، تحققت إشارات إيجابية الشعيرات الدموية 1، 6 و 7، و 8، التي تتوافق مع أهداف CaMV35S ف، غ ر ونبتيي والجينات المرجعية الذاتية ADH1، على التوالي.
الشكل 4: الخصوصية لرصد الكائنات المحورة وراثيا- الكشف عن عينات مختلفة من الحمض النووي، أي، MON863، MON89034، 59122، مزيج من جميع الثلاثة أعلاه الأحداث المعدلة وراثيا (ميكس الكائنات المعدلة وراثيا)، والذرة المعدلة وراثيا عدم والمياه النقية (لا قالب التحكم، المجلس الوطني الانتقالي). 1-8: الشعيرات الدموية قبل الثابتة مع مجموعات التمهيدي مصباح ف-CaMV35S، بار، cp4 ابسبس، ف-FMV35S، بات، تي-غ، نبتيي، و ADH-1، على حدة. 9-10، هما التمهيدي لا ضوابط. وأجرى الاختبار في التكرارات ووجدنا أن جميع نتائج تتسق مع التوقعات. انظر التكميلية الجدول 2 لتحليل البيانات الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
لاختبار أداء أسلوبنا في أحد تطبيقات عالم حقيقي، اختيرت عينتين الذرة العملي للتحليل بالهدوء. ثم قورنت النتائج PCR الوقت الحقيقي والنتائج كانت متسقة (الشكل 5، التكميلية الجدول 2)
الرقم 5: نتائج اختبار عينتين الذرة. 1-8: الشعيرات الدموية قبل الثابتة مع مجموعة التمهيدي مصباح ف-CaMV35S، بار، cp4 ابسبس، ف-FMV35S، بات، تي-غ، نبتيي، و ADH-1، على حدة. 9-10، هما التمهيدي لا ضوابط. وأجرى الاختبار في التكرارات ثم تم مقارنة النتائج مع PCR الوقت الحقيقي وكانت النتائج متسقة. راجع التكميلية الجدول 3 مقارنة النتائج. انظر التكميلية الجدول 2 لتحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الجدول 1: "قائمة مصباح" التمهيدي تسلسلات. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الجدول 2: تحليل البيانات مصباح صفيف التجارب. الخلايا مرمزة اللون الأخضر في الجدول تشير إلى نتيجة إيجابية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية جدول 3: نتائج PCR الوقت الحقيقي نموذج الإبلاغ. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أظهر منهاج الهدوء هنا، الذي يجمع بين التكنولوجيا مصباح مع مجموعة شعرية، تمكن من كشف المتزامن لأهداف متعددة الجينات المتعلقة بالكائنات المعدلة وراثيا في واحدة والفعالة للغاية وسهلة لتشغيل الاختبار.
لنجاح تنفيذ ردود فعل مصباح متعدد في الكاسيت، ثلاث نقاط حرجة بحاجة إلى أن يكون لاحظت. أولاً، تحقيق نفس الارتفاع للجانب العلوي من الشعيرات الدموية وماء ومسعور نمط المصفوفة الشعرية حاسمة بالنسبة لتحميل الكواشف في وقت واحد في جميع الشعيرات الدموية. ينبغي أن تكون محاذاة الشعيرات الدموية بلوحة بعد إدراج الأولى في دعم PDMS لضمان كل منهم يمكن لمس الخليط رد فعل محملة في طبق تحميل محول. عند معالجة الصفيف الشعرية مع معطف مسعور فائقة، لا تسمح بمعطف نقع في السطح الداخلي الشعيرات الدموية. علاج السطح الخارجي الشعيرات الدموية بمجرد تحميل معطف على السطح العلوي لأعلى دعم PDMS، مما يسمح للطلاء تنتشر على الأسطح الخارجية للأجزاء العليا من الشعيرات الدموية. إذا كان يحدث أحياناً أن ليس جميع الشعيرات الدموية تمتلئ الكاشفات، قد يكون من الحكمة لتحميل كاشف مباشرة إلى شعري محددة.
ثانيا، أن تكون حذراً مع إعداد الكواشف مصباح. العملية برمتها بلطف وسرعان ما ينبغي على الجليد، نظراً لدرجة حرارة منخفضة نسبيا من رد فعل من مصباح وهشاشة بوليميريز بتوقيت جنوب بريطانيا . فمن المستحسن أن يهز أنبوب تفاعل مع خليط مصباح برفق بدلاً من فورتيكسينج الأنبوبة عنف بعد إضافة بوليميريز بتوقيت جنوب بريطانيا . تناول بصورة غير مناسبة قد تسبب فشل من رد فعل. في هذه التجربة، ADH1 (الجينات المرجعية الذاتية من الذرة) يتم تعيين كعنصر إيجابي ويتم تعيين اثنين من الشعيرات الدموية دون كبسولة تفجير كعناصر تحكم فارغ. بذلك، إذا كان المخلوط مصباح تتم معالجة بشكل صحيح، سوف تظهر مراقبة إيجابية الخضراء وستظل دون تغيير عنصر التحكم فارغاً بعد إجراء الاختبار.
ثالثا، نظراً لكفاءة عالية من رد فعل مصباح، قد يحدث تلوث كاذبة إيجابية أو ترحيل إذا لم يكن هناك تتبع كمية amplicon الحمض النووي في البيئة. ولذلك، دائماً نضع في اعتبارنا أنه ينبغي فصل عمليات التشغيل لرد فعل ما قبل وما بعد رد فعل صارما في مجالات مختلفة وينبغي أحكام مختومة المنتجات مصباح وتجاهل بعد التحليل. وعلاوة على ذلك، يجب تعيين عنصر تحكم فارغ لمما يدل على أداء الملائم للمصباح.
جوهريا، الهدوء أسلوب الكشف عن حمض النووي متعدد الأهداف عالمية بمرونة جيدة والقابلية للتوسعة. يمكن أن يكون محل المصباح ردود الفعل المنجز في الشعيرات الدموية بسهولة بأنواع أخرى من أساليب التضخيم متحاور، مثل المتداول دائرة التضخيم (RCA)29، و recombinase بوليميريز التضخيم (الجيش الوطني الرواندي)30. يمكن أيضا تطبيقها في الكشف عن ميادين أخرى مثل الممرض الكشف عن27 والمرض تشخيص31.
على الرغم من أن مجموعات التمهيدي قبل ثابتة مع الشيتوزان، في النموذج الحالي لهذا الأسلوب، يزال يلزم عند إجراء الاختبار، مما يقلل من بساطة الأسلوب عملية إعداد خليط مصباح. لمعالجة هذه المسألة، سوف نحاول في التحميل المسبق لجميع المواد الكاشفة لمصباح في شعري وثم "الماصة؛" العينة في الكاسيت. قد يكون قيد آخر لأسلوب لدينا عدم استخراج الحمض النووي، ولكن نحن نعمل الآن على تطوير جهاز موبايل على أساس يجمع بين استخراج الأحماض النووية، أخذ صورة تلقائية، وتحليل البيانات لتحقيق حقيقية "عينة في نتائج السحب "الأسلوب.
في ملخص، قمنا بتطوير منصة هادئة بإدماج مصباح متعدد مع مجموعة شعرية. كطريقة للكشف عن حمض النووي عام، قد الهدوء أيضا إمكانات في طائفة واسعة من التطبيقات الأخرى تحليل الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة في الجزء "الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة الصين الإعانات" (31370813، 3147670، 31670831، و 31600672،)، "المعدلة وراثيا النباتية الخاصة الصندوق الوطني" (2016ZX08012-003، 2016ZX08012-005)، وبرنامج "المواهب الممتازة القرن الجديدة" في جامعة، والبحوث الأساسية الوطنية ومشروع تنمية في الصين (2016YFA0500601) ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (2016 م 591667).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
