Summary
Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.
Abstract
Voor meerdere doelen, korte tijd en resource-betaalbare methoden voor de detectie van meerdere nucleic zuren in één, eenvoudig te bedienen test zijn dringend nodig in de diagnose van de ziekte, microbiële monitoring, detectie van genetisch gemodificeerd organisme (GGO), en forensische analyse. Wij hebben eerder het platform genaamd rust (Capillary Array gebaseerde Loop-gemedieerde isotherme amplificatie voor Multiplex visuele detectie van nucleïnezuren) beschreven. Hierin beschrijven we verbeterde fabricage en prestaties processen voor dit platform. Hier, hanteren wij een kleine, kant-en-klare cassette gemonteerd door capillaire matrix voor multiplex visuele detectie van nucleïnezuren. De capillaire array is vooraf behandeld in een hydrofobe en hydrofiele patroon voordat tot vaststelling van de lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) primer sets in de haarvaten. Na montage van de laden-adapter, wordt de LAMP reactiemengsel geladen en geïsoleerd in elke capillair, als gevolg van de capillaire werking door een pipetting Macrostap. De reacties van de LAMP worden uitgevoerd in parallel in de haarvaten. De resultaten zijn visueel voorgelezen door verlichting met een handbediende UV-zaklamp. Met behulp van dit platform, tonen wij monitoring van 8 verschijnen vaak elementen en genen in GGO monsters met hoge specificiteit en de gevoeligheid. Kortom, is de hierin beschreven platform bedoeld om de detectie van meerdere nucleïnezuren. Wij zijn van mening dat zal zij breed toepasbaar is in velden waar high-throughput nucleïnezuur analyse vereist is.
Introduction
Goedkope, snelle en makkelijk te gebruiken systemen voor de simultane detectie van meerdere nucleïnezuren zijn dringend nodig in een breed scala van terreinen, zoals klinische diagnostiek1,2,3, GGO detectie4, 5,6, microbiële toezicht7,8,9, forensische analyse10,11, en met name point-of-care tests (POCTs), waar middelen zijn meestal beperkt12,13,14.
Polymerase-kettingreactie (PCR), met inbegrip van de methoden van ervan afgeleide PCR in real time en multiplex PCR, is de meest toegepaste techniek voor de detectie in deze velden. Echter, deze methoden meestal slechts één doel ontdekken in één test15 en zij vereisen elektriciteit en geavanceerde professionele apparatuur.
Een andere veelbelovende technologie voor het opsporen van nucleïnezuren is lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP), die voor het eerst in 200016 beschreven werd. LAMP is een hoog rendement DNA detectiemethode. Theoretisch, kan het versterken vanaf 1 exemplaar naar 109 exemplaren van waarbij binnen een uur, alle uitgevoerd bij een constante temperatuur, (dat wil zeggen, tussen 60-65 ° C). Succesvolle versterking zal produceren een grote hoeveelheid de onoplosbare bijproduct pyrofosfaat en veroorzaken een verandering in de troebelheid17, die niet rechtstreeks met het blote oog kan worden waargenomen. Een kleurverandering kan ook worden waargenomen door de toevoeging van metaalionen of fluorescente kleurstoffen zoals calceïne18nucleïnezuur kleurstof19en hydroxyl naftol blauw20. Vanwege de voordelen van hoge gevoeligheid en gemak van verrichting, wordt LAMP algemeen toegepast in nucleïnezuur-detectie.
Momenteel zijn er hoofdzakelijk twee strategieën voor multiplex LAMP testen. Een is voor het uitvoeren van meerdere LAMP testen door het hebben van meerdere LAMP primer ingesteld in één buis21,22,23. Echter zou de veelheid en de versterking-efficiëntie worden beperkt door de intrinsieke inmenging en de concurrentie tussen verschillende primer sets. Bovendien kan het lastig zijn te achterhalen van de verschillende producten van de LAMP in de zelfde reactie. Een andere strategie is gebaseerd op fysieke isolement. Verschillende primer sets werden geïsoleerd in individuele verkleinde compartimenten en meerdere LAMP reacties worden vervolgens uitgevoerd gelijktijdig24,25. Deze benaderingen, die over het algemeen zijn gebaseerd op microfluidic chips, bieden een mogelijke oplossing voor high-throughput LAMP reacties. Echter, de vervaardiging van de chips en de multiplex pre coating van primer verzamelingen is gecompliceerd, die kan leiden tot hogere kosten en verminderen van de reproduceerbaarheid.
Onlangs hebben een paar studies beschreven presterende LAMP reacties in haarvaten te omzeilen de ingewikkelde fabricage van microfluidic chips en goedkope detectie26,27hebben bereikt. Echter met betrekking tot de analyse van de high-throughput lijken deze haarvaten op miniatuur versies van PCR strip buizen, omdat de monsters en reactie reagentia (met inbegrip van de verschillende primer-sets) worden afzonderlijk bereid en geleverd aan verschillende reactie-eenheden binnen de haarvaten. Om te bereiken parallelle en multiplex analyse, is extra apparatuur, bijvoorbeeld een meerkanaals-spuitpomp, vereist voor de parallelle laden van monsters of reagentia.
Om te overwinnen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de huidige methoden voor multiplex detectie van nucleïnezuren, hebben we een verkleinde platform dat visuele LAMP-technologie met een capillaire matrix combineert ontwikkeld. Dit platform is voor meerdere doelen, compacte, lage kosten, en eenvoudig te bedienen van28. Hierin beschrijven we de details van hoe te fabriceren van de capillaire matrix en het uitvoeren van de reacties van de LAMP in de matrix. Het protocol hier beschreven is gestandaardiseerd gebruik van genetisch gemodificeerd organisme (GGO) detectie als een model. Nog belangrijker is, kan dit protocol ook worden gebruikt in high-throughput detectie van andere doelstellingen van de nucleïnezuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de mal van de RVS rekening houdend met de shape voor de gewenste micro-kanalen en de laden adapter zijn reeds geboekt (3D-bestanden worden geleverd als aanvullende bestanden 1 en 2. ). Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat plant DNA isolatie heeft reeds verricht.
1. fabricage van de kant-en-klare capillaire arraygebaseerd Cassette
- reinigen van de roestvrij stalen mal.
- Wash de roestvrij stalen mal door wasmiddel, ethanol en gedeïoniseerd water te verwijderen van de potentiële verontreinigingen. Droog de schimmel door stikstof.
- De haarvaten schoon
- slijtage veiligheidsbril, lab uniform, en chemische beschermhandschoenen.
- Plaats haarvaten in een bekerglas. Reinigen van de haarvaten met 30 mL aceton voor 5 min voor het verwijderen van organisch materiaal, en daarna wassen de haarvaten met gedeïoniseerd water.
Let op: Omgaan met aceton in een zuurkast. - Giet 10 mL H 2 O 2 in het bekerglas en voeg vervolgens 30 mL H 2 zodat 4 in de H 2 O 2 met zacht schudden om oververhitting te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossing (piranha) volledig de haarvaten voor ten minste 30 min. bedekt
Let op: Wees voorzichtig tijdens het verwerken van piranha-oplossing (H 2 SO 4 /H 2 O 2 = 3: 1, v/v) . Als de piranha-oplossing is gemorst, wegspoelen van de oplossing snel met een grote hoeveelheid water en veeg het oppervlak met papieren handdoeken.
Opmerking: Grondige reiniging van de haarvaten is één van de belangrijkste punten voor het welslagen van de reactie van de LAMP. Het is noodzakelijk te schudden de zure cilinder tijdens het reinigingsproces aan het verwijderen van de bubbels in de haarvaten en de schone tijd kan ook worden uitgebreid wanneer dit nodig is. - De piranha-oplossing met een grote hoeveelheid water wegspoelen. Wassen haarvaten met ethanol en gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten elk. Droog de haarvaten in een droogstoof.
- Pour Polydimethylsiloxaan (PDMS)
- gewicht uit PDMS basis en genezen reagentia met een verhouding van 1:1 in een tube van 50 mL. Typisch, Meng 5 g van elastomeer basis tot 5 g van elastomeer genezen agent.
- Roer het mengsel grondig voor ongeveer 5 minuten met een roerstaaf. Plaats de buis met PDMS in een vacuüm Stolp voor 30 min. voor de vergassing.
- Giet het PDMS langzaam in de cilinder van de mal van roestvrij staal. Toestaan dat de PDMS te genezen voor 3 uur in een droogstoof bij 60 ° C
Opmerking: Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden wanneer PDMS gieten. Na het gieten PDMS, laat het staan voor 5 min voor natuurlijke verwijdering van bubbels uit PDMS.
- Verwijderen van de mal van PDMS
- na het uitharden van het PDMS, de schimmel te verwijderen door te trekken uit de mal met cilinder. PDMS uit de cilinder te verwijderen door het snijden van de marge van de schimmel met een scalpel.
- Wassen PDMS driemaal met gedeïoniseerd water en ethanol. Droog de PDMS ondersteunen met stikstof.
- Behandelen het onderste oppervlak van het PDMS ondersteuning te hydrophobic. Uitzettijd het PDMS ondersteunen in een super hydrophobic jas voor 1 s. droog het gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Invoegen het capillair in het PDMS steun
- Invoegen de schoongemaakte 4 mm haarvaten in de gaten van de PDMS-steun en laat 0,5 mm van de haarvaten buiten de oppervlaktelaag van de PDMS steun. Zorg ervoor dat de uiteinden van de haarvaten op hetzelfde niveau.
- Behandeling van het buitenoppervlak van de haarvaten en de bovenkant van de steun van de PDMS te hydrophobic.
- Toevoegen 15 µL Super hydrophobic vacht op de bovenkant van het PDMS ondersteuning. Merk op dat de coating onmiddellijk spreads overal de oppervlaktelaag (met inbegrip van de oppervlaktelaag van de PDMS steun en de buitenste oppervlakken van het blootgestelde gedeelte van de haarvaten) door capillaire werking.
- Lucht drogen de Super hydrophobic gemodificeerde capillaire array.
- Fix primer in capillaire array
- bereid primer-oplossing. Gewicht uit 0,65 g chitosan (Molecuulformule: (C 6 H 11 4) n) en los het dan op in 50 mL gedeïoniseerd water door pH 4.5-5.5 met azijnzuur om een chitosan concentratie van 1,3% aan te passen. Bereiden primer onderdelen mix volgens tabel 1. Zie aanvullende tabel 1 voor inleidingen
- toevoegen 1.6 µL van het mengsel van één reeks inleidingen te vullen een overeenkomstige capillair van de capillaire matrix volgens een vooraf ontworpen volgorde.
Opmerking: De resterende twee lege haarvaten werden ingesteld als negatieve controles. - Verankeren van de matrix in een transparante put van een standaard platte bodem 96-wells-plaat en drogen van de array bij 60 ° C gedurende ten minste 2 h.
| LAMP primer mix onderdelen (beginconcentratie) vaststelling | Volume (l) |
| ddH 2 O | 17,0 |
| Chitosan (1,3%) | 1.0 |
| FIP/BIP primer (20 μM) | 2.0/2.0 |
| LoopF/LoopB primer (20 μM) | < td > 1.0/1.0|
| F3/B3 primer (20 μM) | 0,5/0,5 |
| totaalvolume | 25,0 |
tabel 1: de onderdelen van de LAMP primer vaststelling van reagentia. De onderdelen van de LAMP primer mix vaststelling staan vermeld in de linkerkolom van de tabel en het volume van elk onderdeel wordt vermeld in de rechterkolom.
- monteren van de cassette als volgt. Zet een laden-adapter op de top van verankerde matrix. Zorg ervoor dat de schotel van de adapter net omvat de blootgestelde delen van alle tien haarvaten (Zie Figuur 1).
Figuur 1: de cassette fabricage en assemblage. (een) roestvrij schimmel en het PDMS ondersteunen. De mal bestaat uit 3 delen: cilinder, dam bord en pijler plaat. (b) het schema van PDMS ondersteuning fabricage en assemblage van de capillaire cassette. Het hele proces bevat 5 stappen: 1. PDMS gieten, 2. schimmel verwijderen, 3. capillair invoegen en oppervlaktelaag, 4. vaststelling van de primer en 5. verankering van de cassette. 1. Giet PDMS in de cilinder van de schimmel; 2. druk uit het bord dam te verwijderen van de mal van PDMS ondersteunen; 3. de vacht het omlaag oppervlak van PDMS ondersteuning en voeg vervolgens de haarvaten in de PDMS ondersteunen, ten slotte jas het bovenoppervlak voor PDMS support en haarvaten blootgesteld. De dikke blauwe lijn geeft aan Super hydrophobic jas; 4. Laad primer zet in individuele haarvaten; 5. het verankeren van de capillaire array in een enkele 96-wells-plaat en installeer een steekproef adapter op het laden. De details zijn beschreven in het protocol stappen 1,1-1,9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
2. prestaties of LAMP reactie in capillaire matrix
- voorbereiden de reactie mix
- bereiden de LAMP reactie mix per T kunnen 2.
- Toevoegen reagentia aan mengsel volgens de gekozen volgorde, zoals in tabel 2, en vortex het reactiemengsel voor 5 s na het toevoegen van calceïne. Voorzichtig inVert de buis 20 keer na Bst polymerase is toegevoegd.
| LAMP onderdelen (beginconcentratie) | Volume (μL) |
| ddH 2 O | 11,6 |
| MgSO 4 (100 mM) | 2.0 |
| dNTPs (25 mM) | 1.4 < /t d > |
| betaïne (5 M) | 4.0 |
| Buffer (10 x) | 2.5 |
| calceïne (1.25 mM) | 0,5 |
| MnCl 2 (25 mM) | 0,5 |
| Bst < /em > polymerase (8 U/μl) | 1.5 |
| DNA plant (10 ng/μl) | 1.0 |
| totaalvolume | 25,0 |
Tabel 2: De reactie systeem van de capillaire matrix-LAMP. De componenten van het systeem van de reactie van de onderdelen van de LAMP van de capillaire opslagarray staan in de linkerkolom, en het volume van elk onderdeel staat in de rechterkolom.
- het laden van de reagentia en verzegel de cassette
- µL Pipetteer 20 reactiemengsel LAMP met een standaard 100 µL tip. Breng de tip in de inlaat van de adapter van de laden om het te vergrendelen. Het reactiemengsel zachtjes injecteren in de schotel van adapter; het reactiemengsel snel vult de schotel en dan laden de haarvaten automatisch door capillaire werking.
- Verwijderen van de adapter met het vergrendelde topje en verzegel de put door een transparante afdichting film PCR-compatibele.
Opmerking: Alleen de haarvaten aanraken van het reactiemengsel in de hydrofiele schotel kunnen worden gevuld. Dus zorg ervoor dat de bovenzijde van alle de haarvaten zijn van dezelfde hoogte (Zie Figuur 2).
Figuur 2: Diagram van monster-laden met behulp van de adapter laden. De foto toont het laadproces blauwe oplossing in dienst als voorbeeld. Breng de tip in de inlaat en het injecteren van het monster in de adapter langzaam, en verwijder vervolgens de adapter met vergrendelde tip. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Incubate de capillaire array in een incubator bij 63 ° C gedurende 1 h.
3. resultaten uitlezing en Data-analyse
- verwerven van beelden van de emissie van de fluorescentie.
- Fix een UV-filter op de bovenkant van een kleine hand-held UV LED zaklamp voor het filteren van het zichtbare licht.
- Prikkelen de gedissocieerde calceïne te stoten fluorescentie met de UV-zaklamp. Vastleggen van beelden vanaf de bovenkant van de capillaire matrix door een digitale camera of een smartphone.
- Bij het maken van een opname, zorgen ervoor dat de camera is ingezoomd op het gebied van de haarvaten zo veel mogelijk te krijgen van hoge kwaliteit, heldere beelden.
- De resultaten analyseren
- Open het beeld door beeld analysesoftware en selecteer " Image > schimmel > grijswaarden > ja " en " afbeelding > schimmel > 16-bits > ja ". Selecteer " bestand > opslaan als > formaat > TIFF " de installatiekopie converteren naar 16-bits TIFF formaat.
- Pak van de waarde van intensiteit van de fluorescentie
- Open de microarray analysesoftware. Sleep de afbeelding van 16-bits TIFF-indeling in de interface van de software en selecteer vervolgens de golflengte van " 532 nm " en een kleur van " groene " om de afbeelding weer te geven.
- Maken een nieuw blok te vinden van het signaal van de fluorescentie van de haarvaten. Selecteer " Tools > nieuwe blokken " en voer het aantal kolommen en rijen als " 1; 1 " en " 2; 5 " in de ' blokken ' en ' functies ' interfaces afzonderlijk.
- Rechts klik op en selecteer " functies " model en pas vervolgens de locatie en de diameter aan het gebied van de fluorescentie van haarvaten. Selecteer " analyseren " om uit te pakken van de waarde van intensiteit van de fluorescentie.
- Selecteer " bestand > opslaan als " de blokken documenten opslaan en selecteren " bestand > opslaan van resultaten als " aan de resultaten van de intensiteit van de fluorescentie opslaan. Berekenen van de SNR om te definiëren of LAMP met succes wordt uitgevoerd in de haarvaten.
Opmerking: Signalen van de haarvaten werden verkregen door opname die de grijswaarden van de plekken en de signaal ruisverhoudingen (SNRs) werden gedefinieerd als de verhouding van de gemiddelde waarden van voorgrond signalen van de streefcijfers tot het gemiddelde van de gemiddelde waarden van voorgrond signalen van de twee negatieve besturingselementen. De cutoff te bepalen positieve signalen werd ingesteld als SNR > 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze methode is het belangrijk om te voorkomen dat kruisverontreiniging tussen de verschillende haarvaten tijdens het laden van de steekproef. Voor dit doel, de chitosan geïntroduceerd, die de inleidingen in individuele haarvaten kon behouden. Om te testen of het werkte of niet, we vooraf vast de ADH1 (endogene referentie gene van maïs) primer instellen in de capillaire cassette met het patroon van de "T" en "U", zoals geïllustreerd in Figuur 3a. Zoals verwacht, alleen de haarvaten opgenomen primer ingesteld weergegeven: positieve signalen (Figuur 3b).
Figuur 3: voorbeelden van capillaire resultaat. (een) de indeling van de capillaire matrix. De groene vlekken geven aan dat de ADH-1 primer sets vooraf zijn verholpen in de haarvaten. (b) TL foto's van de twee capillaire matrices na LAMP. De groene kleur presenteerde de positieve versterking van de LAMP. De test werd uitgevoerd in tweevoud. Succesvolle versterking alleen gepresenteerd in primer-vaste haarvaten en zonder besmetting onder lege haarvaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Om verder de mogelijkheid om te controleren van GGO, kozen we zeven veelgebruikte transgene elementen die betrekking hebben op ~ 75% van de gecommercialiseerde GGO-gebeurtenissen (d.w.z., P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos en nptII) (Figuur 4, lay-out) die komen overeen met de haarvaten nummer 1-7, en één gen van de endogene referentie voor maïs (ADH1). Als u wilt weergeven van de specificiteit van deze methode, drie GM gebeurtenissen werden (MON863, MON89034 en 59122) geselecteerd en toegepast op rust. Om de resultaten te analyseren, werden fluorescentie beelden genomen door de camera en geanalyseerd zoals beschreven in de stappen van het protocol. Verwachte resultaten werden bekomen voor alle tests (Figuur 4). Bijvoorbeeld, voor de genetisch gemodificeerde maïs MON863, positieve signalen werden verkregen voor haarvaten 1, 6, 7 en 8, die overeenkomen met doelen P-CaMV35S, T-nos, nptII en het endogene referentie gen ADH1, respectievelijk.
Figuur 4: de specificiteit voor het toezicht op GGO's. De detectie van verschillende DNA-monsters, dat wil zeggen, MON863, MON89034, 59122, mix van alle bovenstaande drie GM evenementen (GGO mix), niet-genetisch gemodificeerde maïs en zuiver water (geen sjabloon controle, NTC). 1 - 8: haarvaten vooraf vast met LAMP primer sets van P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, en ADH-1, individueel. 9 - 10, twee neen-primer besturingselementen. De test werd uitgevoerd in tweevoud en we vonden dat alle resultaten consistent met verwachtingen waren. Zie aanvullende tabel 2 voor data-analyse Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Als u wilt testen van de prestaties van onze werkwijze in een echte applicatie, werden twee praktische maïs monsters geselecteerd voor analyse door rust. Vervolgens werden de resultaten vergeleken met die van real-time PCR en resultaten waren consistent (Figuur 5, aanvullende tabel 2)
Figuur 5: de resultaten van de testen van twee maïs monsters. 1 - 8: haarvaten vooraf vast met de LAMP primer set van P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, en ADH-1, individueel. 9 - 10, twee neen-primer besturingselementen. De test werd uitgevoerd in tweevoud en vervolgens de resultaten werden vergeleken met die van PCR in real time en de resultaten waren consistent. Zie aanvullende tabel 3 voor de resultaten van de vergelijking. Zie aanvullende tabel 2 voor data-analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende tabel 1: lijst van LAMP primer sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: analyse van de gegevens van de LAMP array experimenten. De groene kleur gecodeerde cellen in de tabel geven het positieve resultaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 3: de PCR in real time resultaten meldingsformulier. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kalme platform hier gedemonstreerd, die de LAMP-technologie combineert met een capillaire array, laat de simultane detectie van meerdere gene GGO-gerelateerde doelen in een enkele, zeer effectieve en gemakkelijk te bedienen test.
Voor het succesvol uitvoeren de multiplex LAMP reacties in de cassette, moet drie kritieke punten om opgemerkt te worden. Ten eerste het bereiken van dezelfde hoogte voor de bovenzijde van de haarvaten en de hydrofiele en hydrofobe patroon van de capillaire matrix staan kritisch tegenover voor het gelijktijdig laden van reagentia in alle de haarvaten. De haarvaten moeten worden afgestemd door een plaat na eerste invoegen in de PDMS steun om ervoor te zorgen dat ze allemaal de geladen reactiemengsel in de schotel van de laden adapter kunt aanraken. Bij de behandeling van de capillaire array met de Super hydrophobic vacht, de vacht te genieten in de binnenzijde van de haarvaten niet toegestaan. Behandeling van het buitenoppervlak van de haarvaten door gewoon laden jas aan de oppervlaktelaag van de top die PDMS ondersteunen, waardoor de coating te verspreiden naar de buitenste oppervlakken van de bovendelen van de haarvaten. Als het gebeurt soms dat niet alle de haarvaten worden gevuld met de reagentia, is het wellicht verstandig om reagens direct in een specifieke capillair laden.
Ten tweede, wees voorzichtig met de voorbereiding van de LAMP reagentia. Het hele proces moet worden zachtjes en snel uitgevoerd op ijs, als gevolg van de reactie van de relatief lage temperatuur van de LAMP en de kwetsbaarheid van de polymerase van Bst . Het is raadzaam om de reactiebuis met het mengsel van de LAMP voorzichtig in plaats van vortexing de buis heftig schudden na het toevoegen van polymerase van Bst . Een ongepaste behandeling kan leiden tot falen van de reactie. In dit experiment, ADH1 (endogene referentie gene van maïs) is ingesteld als positieve controle en twee haarvaten zonder inleidingen zijn ingesteld als leeg besturingselementen. Dus, als LAMP mengsel is correct behandeld, de positieve controle zou tonen groen en de blanco-controle zou blijven ongewijzigd nadat de test is uitgevoerd.
Ten derde, als gevolg van de hoge efficiency van de reactie van de LAMP, valse positieve of overdracht besmetting kan gebeuren als er een spoor hoeveelheid DNA amplicon in de omgeving. Dus, altijd in gedachten houden dat de operationele processen van pre reactie en na reactie moeten strikt worden gescheiden in verschillende gebieden en de producten van de LAMP moeten strak worden verzegeld en verwijderd na analyse. Bovendien is een blanco-controle moet worden vastgesteld voor het aanduiden van een correcte werking van de LAMP.
Intrinsiek, is rust een universele voor meerdere doelen nucleïnezuur-detectiemethode met goede flexibiliteit en uitbreidbaarheid. LAMP reacties uitgevoerd in haarvaten kunnen gemakkelijk worden vervangen door andere soorten isotherme amplificatie methoden, zoals rolling cirkel versterking (RCA)29en recombinase polymerase versterking (RPA)30. Het kan ook worden toegepast op andere gebieden van detectie, zoals pathogen detectie27 en ziekte diagnose31.
In de huidige vorm van deze methode, hoewel primer sets vooraf met chitosan opgelost worden, is het proces van LAMP mengsel preparaat nog steeds nodig wanneer de test wordt uitgevoerd, die de eenvoud van de methode verlaagt. Om aan te pakken dit, zullen we proberen alle reagentia van LAMP in het capillair voorspanning en Pipetteer vervolgens het monster in de cassette. Een andere beperking voor onze methode kan het ontbreken van nucleïnezuur extractie, maar ontwikkelen we nu een mobiele-gebaseerde machine die een dergelijk scenario de winning van nucleïnezuren, automatische beeld nemen en data-analyse combineert om een echte "monster-in en resultaten-out "methode.
Kortom, hebben we het rustig platform ontwikkeld door de integratie van multiplex LAMP met een capillaire matrix. Als een algemene nucleïnezuur-detectiemethode wellicht rust ook potentieel in een breed scala van andere toepassingen van nucleïnezuur analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door nationale Natural Science Foundation van China subsidies (31370813, 3147670, 31670831 en 31600672,), de nationale transgene Plant speciaal fonds (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), het programma voor de nieuwe eeuw uitstekende talenten in Universiteit, de nationale belangrijkste onderzoeks- en ontwikkelingsproject van China (2016YFA0500601) en China postdoctorale Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
