Summary
Denne protokollen beskriver fabrikasjon av en liten, klar til bruk kassett som kan brukes for visuell gjenkjenning av flere nukleinsyrer i en enkelt test som er enkel å betjene. I denne tilnærmingen brukte en kapillær matrise multiplex og svært effektiv deteksjon av GMO mål.
Abstract
Flere mottakere, kort tid og ressurs-rimelig metoder for påvisning av flere nukleinsyrer i en enkelt, enkel å betjene test er presserende nødvendig i sykdom diagnose, mikrobielle overvåking, genetisk modifisert organisme (GMO) oppdagelsen, og rettsmedisinske analyser. Vi har tidligere beskrevet plattform kalt ro (Capillary Array-baserte Loop-mediert isotermiske forsterkning for Multiplex visuell gjenkjenning av nukleinsyrer). Her beskriver vi forbedret fabrikasjon og ytelse prosesser for denne plattformen. Her bruker vi en liten, klar til bruk kassett sammen av kapillær matrise for multiplex visuell gjenkjenning av nukleinsyrer. Kapillær matrisen er pre-behandlet i en hydrofobe og hydrofile mønster før fikse loop-mediert isotermiske forsterkning (lampe) primer sett i kapillærer. Etter montering av lasting adapteren, er lampe reaksjonsblandingen lastet og isolert i hver kapillær, på grunn av kapillær kraft av pipettering samtidig. LAMPE reaksjonene utføres parallelt i kapillarer. Resultatene leses visuelt av belysning med en håndholdt UV lommelykt. Bruker denne plattformen, viser vi overvåking av 8 ofte vises elementer og gener i GMO prøver med høy spesifisitet og følsomhet. Oppsummert er plattformen beskrevet her ment å lette oppdagelsen av flere nukleinsyrer. Vi tror det vil være allment gjeldende i felt der det kreves høy gjennomstrømming nukleinsyre analyse.
Introduction
Rimelig, rask og enkel å bruke systemer for samtidige påvisning av flere nukleinsyrer behov inntrengende i en rekke felt, for eksempel klinisk diagnostikk1,2,3, GMO oppdagelsen4, 5,6, mikrobielle overvåking7,8,9, rettsmedisinske analyser10,11og spesielt point-of-care tester (POCTs), der ressurser er vanligvis begrenset12,13,14.
Polymerasekjedereaksjons (PCR), inkluderer dens avledede sanntid PCR og multiplex PCR, er den mest brukte metoden for gjenkjenning i disse feltene. Men disse metodene vanligvis bare merker ett mål i en test15 og de krever strøm og sofistikert profesjonelt utstyr.
En annen lovende teknologi for å oppdage nukleinsyrer er Loop-mediert isotermiske forsterkning (lampe), som ble først beskrevet i 200016. LAMPEN er en høy virkningsgrad DNA gjenkjennings-metoden. Teoretisk sett kan det forsterke fra 1 kopi til 109 kopier av amplicons innen én time, alle på en konstant temperatur (dvs.60-65 ° c). Vellykket forsterkning vil produsere en stor mengde uløselig biprodukt pyrophosphate og forårsake en endring i turbiditet17, som kunne observeres direkte av det blotte øye. Fargeendring kan også observeres med tillegg av metall ioner eller fluorescerende fargestoffer som Calcein18, nukleinsyre fargestoff19og hydroksyl naphthol blå20. På grunn av fordelene med høy følsomhet og praktisk drift, blir lampe mye brukt i nukleinsyre gjenkjenning.
I dag er det hovedsakelig to strategier for multiplex lampe analyser. En er å utføre flere lampe analyser ved å ha flere lampe primer sett i en tube21,22,23. Imidlertid ville mangfoldet og forsterkning effektiviteten være begrenset av den iboende forstyrrelse og konkurranse mellom forskjellige primer sett. Videre kan det være vanskelig å identifisere ulike lampe produkter i samme reaksjon. En annen strategi er basert på fysiske isolasjon. Forskjellige primer sett ble isolert i enkelte miniatyriserte avdelinger, og flere lampe reaksjoner utføres deretter samtidig24,25. Disse tilnærminger, som er vanligvis basert på microfluidic chips, gir en potensiell løsning for høy gjennomstrømming lampe reaksjoner. Men produksjon av chips og multiplex før belegget på primer sett er komplisert, som kan øke kostnadene og redusere reproduserbarhet.
Noen studier har nylig beskrevet resultater lampe reaksjoner i kapillærer å omkjøringsvei komplisert fabrikasjon microfluidic sjetonger og har oppnådd lavpris oppdaging26,27. Imidlertid med hensyn til høy gjennomstrømming analyse er disse kapillærene lik Miniutgaver av PCR stripe rør, prøver og reaksjon reagenser (inkludert ulike primer sett) må være individuelt forberedt og levert til ulike reaksjon enheter i kapillærer. For å oppnå parallelle og multiplex analyse, kreves ekstra utstyr, for eksempel en flerkanals sprøytepumpe, for parallell lasting av prøver eller reagenser.
For å overvinne begrensningene knyttet til gjeldende metoder for multiplex påvisning av nukleinsyrer, har vi utviklet en miniatyriserte plattform som kombinerer visuelle LAMP-teknologi med en kapillær matrise. Denne plattformen er flere mottakere, kompakt i størrelse, lave kostnader og enkel å betjene28. Her beskriver vi detaljer om hvordan du dikte kapillær matrisen og utfører lampe reaksjonene i matrisen. Protokollen beskrevet her blitt standardisert med genetisk modifisert organisme (GMO) oppdagelsen som modell. Viktigere, kan denne protokollen også brukes i høy gjennomstrømming påvisning av andre nukleinsyre mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: denne protokollen forutsetter at stål mold bærer formen til ønsket mikro-kanaler og lasting adapteren allerede er gjort (3D-filer leveres som ekstra filer 1 og 2. ). Denne protokollen forutsetter at anlegget DNA isolasjon er allerede utført.
1. fabrikasjon av kapillær matrise-basert klar-å-bruke kassetten
- ren rustfritt stål mold.
- Vask rustfritt stål mold av vaskemiddel, etanol og deionisert vann fjerne potensielle forurensninger. Tørr mold av nitrogen.
- Ren kapillærene
- bruke lab uniform og kjemiske vernehansker, vernebriller.
- Sted kapillærene i et beaker. Rengjøre kapillærene med 30 mL aceton i 5 min fjerne organisk materiale, og deretter vaske kapillærene med deionisert vann.
Forsiktig: Håndtere aceton i avtrekksvifte. - Hell 10 mL av H 2 O 2 i begeret og deretter legge til 30 mL av H 2 så 4 i H 2 O 2 med langsom risting for å forhindre overoppheting. Kontroller at løsningen (piranha løsning) dekker helt kapillærene i minst 30 min.
Forsiktig: Vær forsiktig ved håndtering piranha løsning (H 2 SO 4 h 2 O 2 = 3: 1, v/v) . Hvis piranha løsningen er sølt, vaske bort løsningen raskt med en stor mengde vann og tørk av overflaten med papirhåndklær.
Merk: Grundig rensing av kapillærene er en av de viktigste punktene å lykkes med lampe reaksjonen. Er det nødvendig å riste syre sylinderen under renseprosessen for å fjerne bobler i kapillærer, og ren tiden kan også utvides når det kreves. - Vask bort piranha løsningen med store mengder vann. Vask kapillærene med etanol og deionisert vann i 5 min. Tørr kapillærene i tørking ovn.
- Hell polydimethylsiloxane (PDMS)
- vekt ut PDMS base og herding reagenser med forholdet 1:1 i en 50 mL tube. Vanligvis blande 5 g av elastomer base til 5 g av elastomer herding agent.
- Rør blandingen grundig i ca 5 min med glass stang. Sett røret med PDMS i et vakuum bell jar i 30 min for de gassing.
- Hell i PDMS sakte inn i sylinderen av rustfritt stål mold. Tillate PDMS å kurere for 3t i tørking ovn på 60 ° C
Merk: Vær forsiktig å unngå luftbobler når helle PDMS. Etter helle PDMS, la den stå i 5 min naturlige fjerning av bobler av PDMS.
- Fjerne mold fra PDMS
- etter PDMS, fjerne mold ved å trekke ut formen med sylinder. Fjern PDMS fra sylinderen ved å kutte margen av mold med skalpell.
- Vask PDMS tre ganger med etanol og deionisert vann. Tørr på PDMS støtte med nitrogen.
- Behandle lavere overflaten av PDMS støtte skal hydrofobe. Suge PDMS støtte i en super hydrofobe strøk for 1 s. tørr det for 10 min ved romtemperatur.
- Sett av kapillær i PDMS støtte
- renset 4 mm kapillærene inn i hullene av PDMS støtte og la 0,5 mm i kapillarer utenfor overflaten av PDMS støtte. Kontroller at endene av kapillærene er på samme nivå.
- Behandle den ytre overflaten av kapillærene og toppen overflaten av PDMS støtte skal hydrofobe.
- Legge til 15 µL super hydrofobe pels på overflaten av PDMS støtte. Merk at belegget umiddelbart sprer seg over hele overflaten (inkludert toppen overflaten av PDMS støtte og den ytre overflaten av delen av kapillærene) av kapillær force.
- Lufttørke super hydrofobe endret kapillær matrisen.
- Fikse primer i kapillær array
- forberede primer løsning. Vekt ut 0,65 g chitosan (molekylære formel: (C 6 H 11 ingen 4) n) og oppløse den i 50 mL vaskebuffer vann ved å justere pH til 4,5-5,5 med eddiksyre å oppnå en chitosan konsentrasjon på 1,3%. Klargjør primer komponenter blandingen som tabell 1. Se utfyllende tabell 1 primere
- legge til 1.6 µL av blandingen av ett sett med primere å fylle en tilsvarende kapillær av kapillær array en forhåndsutformet rekkefølgen.
Merk: De resterende to tomme kapillærene ble satt som negative kontroller. - Forankre matrisen i en gjennomsiktig godt av en standard flat bunn 96-brønns plate og tørr matrisen ved 60 ° C i minst 2 h.
| lampe primer fikse blanding komponenter (innledende konsentrasjon) | volum (μL) |
| ddH 2 O | 17.0 |
| Chitosan (1,3%) | 1.0 |
| FIP/BIP primer (20 μM) | 2.0/2.0 |
| LoopF/LoopB primer (20 μM) | < td > 1.0/1.0|
| F3/B3 primer (20 μM) | 0,5/0,5 |
| totalvolum | 25.0 |
tabell 1: komponentene av lampe primer fikse reagenser. Komponentene i lampe primer fikse mix vises i venstre kolonne i tabellen, og volumet av hver komponent er oppført i høyre kolonne.
- Monter kassetten som følger. Sette en lasting adapter på toppen av forankret matrise. Kontroller at parabolen av adapteren bare dekker de synlige delene av alle ti kapillærene (se figur 1).
figur 1: kassett fabrikasjon og samlingen. (en) rustfritt mold og PDMS støtte. Mold består av 3 deler: sylinder, dam styret og pilar plate. (b) skjematisk av PDMS støtte fabrikasjon og samlingen av kapillær kassetten. Hele prosessen inneholder 5 trinn: 1. PDMS helle, 2. Mold fjerning, 3. kapillær innsetting og overflate belegg, 4. primer fikse og 5. kassett forankring. 1. hell PDMS i sylinder av mold; 2. Skyv ut dam styret å fjerne mold fra PDMS støtte; 3. frakk ned overflaten av PDMS støtte og deretter sette inn kapillærene i PDMS støtte, endelig strøk den øvre overflaten av PDMS støtte og utsatt kapillærer. Den tykke blå linjen angir super hydrofobe pels; 4. Legg primer til individuelle kapillærene; 5. ankertekst kapillær matrisen i en enkelt 96-brønns plate og installere et utvalg lasting adapter på den. Detaljene har blitt beskrevet i protokollen trinn 1.1-1.9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. ytelse av LAMP reaksjon i kapillær Array
- forberede reaksjonen blanding
- forberede lampe reaksjonen blanding som T dugelig 2.
- Legg til reagenser til blandingen i den valgte rekkefølgen, som tabell 2 og vortex reaksjonsblandingen 5 s etter calcein. Forsiktig iverter røret 20 ganger etter Bst polymerase legges.
| LAMP-komponenter (første konsentrasjon) | volum (μL) |
| ddH 2 O | 11,6 |
| MgSO 4 (100 mM) | 2.0 |
| dNTPs (25 mM) | 1.4 < /t d > |
| Betaine (5 M) | 4.0 |
| Buffer (10 x) | 2.5 |
| Calcein (1,25 mM) | 0,5 |
| MnCl 2 (25 mM) | 0,5 |
| Bst < /EM > utvalg (8 U/μL) | 1.5 |
| plante DNA (10 ng/μL) | 1.0 |
| totalvolum | 25.0 |
Tabell 2: Reaksjonssystemet av kapillær matrise-lampe. Komponenter i reaksjonssystemet kapillær matrise lampe komponenter vises i venstre kolonne, og volumet av hver komponent er oppført i høyre kolonne.
- laste reagenser og forsegle kassetten
- Pipetter 20 µL lampe reaksjonsblandingen med standard 100 µL tips. Stikk i mengden av lasting adapteren låse den. Forsiktig injisere reaksjonsblandingen i parabolen av adapter; reaksjonsblandingen vil raskt fylle fatet og deretter laste inn kapillærene automatisk gjennom kapillære.
- Fjerne adapteren låst spissen og forsegle brønnen med PCR-kompatible gjennomsiktige tetting filmen.
Merk: Bare kapillærene berøre reaksjonsblandingen i hydrofile parabolen kan fylles. Så sørg for at oversiden av alle kapillærene er av samme høyde (se figur 2).
figur 2: for eksempel lasting bruker lasting adapteren. Bildet viser lasting prosessen ansette blå løsning som et eksempel. Stikk i innløpet injisere prøven i adapteren sakte, og deretter fjerne adapteren med låst spissen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Incubate kapillær matrisen i en inkubator ved 63 ° C i 1 h.
3. resultatene avlesning og dataanalyse
- hente bilder av fluorescens utslipp.
- Fikse en UV-filter på overflaten av en liten håndholdt UV LED lommelykt filtrere synlig lys.
- Excite dissosiert calcein å avgi fluorescens med UV lommelykten. Ta bilder fra toppen av kapillær matrisen ved et digitalt kamera eller en smarttelefon.
- Når du tar et bilde, sikre at kameraet er zoomet inn på området kapillærene som mulig å få høy kvalitet, klare bilder.
- Analysere resultatene
- Åpne bildet av analyseprogramvare og velg " bildet > Mold > gråtone > Ja " og " bilde > Mold > 16 bit > Ja ". Velg " fil > lagre som > formatet > TIFF " å konvertere bildet til 16-biters TIFF-format.
- Trekke ut verdien av fluorescens
- Åpne microarray analyseprogramvare. Dra 16-biters TIFF-format bildet i grensesnittet for programvaren og velg bølgelengden til " 532 nm " og en farge av " grønne " å vise bildet.
- Opprette en ny blokk for å finne fluorescens signalet fra kapillærene. Velg " verktøy > nye blokker " og skriv inn antallet kolonner og rader som " 1; 1 " og " 2, 5 " i den ' blokker ' og ' funksjoner ' grensesnitt separat.
- Rett klikker og velger " funksjoner " modell og justere plasseringen og diameter å passe på fluorescens området kapillærer. Velg " analyser " trekke ut verdien av fluorescens.
- Velg " fil > lagre innstillingene som " lagre blokker dokumentene og velger " fil > lagre resultatene som " lagre fluorescensen intensitet resultater. Beregne SNR for å angi om lampen er utført i kapillarer.
Merk: Signaler på kapillærene ble innhentet av innspillingen gråverdier flekker og signal til støy forhold (SNRs) ble definert som prosenter mener verdier av forgrunnen signaler av målene til mener gjennomsnittsverdiene forgrunnen signaler av to negative Kontroller. Cut-off å finne positive signaler ble angitt som SNR > 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne metoden er det viktig å unngå kryss-smitte blant annet capillaries under eksempel innlasting. For dette formålet, ble chitosan introdusert, som kunne beholde primerne i individuelle kapillærer. For å teste om det fungerte eller ikke, vi pre fast ADH1 (endogene referanse gen av mais) primer i kapillær kassetten med mønsteret av "T" og "U", som vist i figur 3a. Som forventet, bare kapillærene inneholdt primer angir viser positive signaler (figur 3b).
Figur 3: eksempler på kapillære resultatet. (en) utformingen av kapillær matrisen. De grønne prikker indikerer at ADH-1 primer sett er pre løst i kapillærer. (b) lysstoffrør fotografier av de to kapillære matrisene etter lampe. Den grønne fargen presentert positiv lampe forsterkning. Testen ble utført i duplikat. Vellykket forsterkning bare presentert i primer-fast kapillærene og uten smitte blant tom kapillærer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å ytterligere evaluere muligheten til å overvåke GMO, valgte vi syv vanlige transgene elementer som dekker ~ 75% av kommersialiserte GMO hendelsene (dvs., P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos og nptII) (Figur 4, oppsett) som tilsvare kapillærene nummer 1-7, og endogene referanse genet for mais (ADH1). Slik viser spesifisitet av denne metoden, tre GM arrangementer ble (MON863, MON89034 og 59122) valgt og brukt på rolig. For å analysere resultatene, ble fluorescens bilder tatt av kameraet og analysert som beskrevet protokollen. Forventede resultater ble oppnådd for alle tester (Figur 4). For eksempel for GM mais MON863, positive signaler ble innhentet for kapillærene 1, 6, 7 og 8, som tilsvarer mål P-CaMV35S, T-nos, nptII og endogene referanse genet ADH1, henholdsvis.
Figur 4: spesifisitet for overvåking GMO. Påvisning av forskjellige DNA prøver, dvs., MON863, MON89034, 59122, blanding av alle de ovennevnte tre GM arrangementer (GMO mix), ikke-GM-mais og rent vann (ingen mal kontroll, NTC). 1 – 8: kapillærene pre fast med lampe primer sett P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, og ADH-1, individuelt. 9 - 10, to no-primer kontroller. Testen ble utført i duplikat og fant vi at alle resultatene var forenlig med forventninger. Se utfyllende tabell 2 for dataanalyse Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Test ytelsen til vår metode i en virkelig verden søknad ved ble to praktisk mais prøvene valgt for analyse av rolig. Deretter ble resultatene sammenlignet med sanntid PCR og resultatene var konsekvent (figur 5, utfyllende tabell 2)
Figur 5: resultatene av testingen to mais prøvene. 1 – 8: kapillærene pre fast med lampe primer sett av P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, og ADH-1, individuelt. 9 - 10, to no-primer kontroller. Testen ble utført i duplikat resultatene var forhold til sanntid PCR og resultatene var konsekvent. Se utfyllende tabell 3 sammenligning resultater. Se utfyllende tabell 2 for dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende tabell 1: liste av LAMP primer sekvenser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 2: dataanalyse lyselementet array eksperimenter. Grønne fargekodet cellene i tabellen angir et positivt resultat. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 3: sanntid PCR resultater rapporteringsskjema. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ROLIG plattformen vist her, som kombinerer LAMP-teknologi med en kapillær matrise, gjør samtidige påvisning av flere GMO-relaterte genet mål i en enkelt, svært effektiv og enkel å betjene test.
For å utføre multiplex lampe reaksjonene i kassetten, må tre kritiske punkter bli lagt merke til. For det første å oppnå den samme høyden for av kapillærene og hydrofile og hydrofobe mønster av kapillær matrisen er avgjørende for samtidig laste reagenser i alle kapillærene. Kapillærene skal justeres av en plate etter første sette inn i PDMS-støtte for å sikre at alle av dem kan ta lastet reaksjonsblandingen i form av lasting adapteren. Ved behandling av kapillær matrise med super hydrofobe pelsen, Tillat ikke pelsen å suge inn overflatebehandling av kapillærer. Behandle den ytre overflaten av kapillærene av bare lessing pels på overflaten av toppen PDMS støtte, slik at belegget å spre seg til den ytre overflaten av de øvre delene av kapillærer. Hvis det skjer noen ganger at ikke alle kapillærene er fylt med reagenser, kan det være klokt å laste reagens direkte til en bestemt kapillær.
For det andre, være forsiktig med utarbeidelse av lampe reagenser. Hele prosessen bør forsiktig og raskt utføres på is, relativt lav reaksjon temperaturen av lampe og skjørhet Bst -utvalg. Det anbefales å riste reaksjon røret med lampe blandingen forsiktig i stedet for vortexing røret voldsomt etter Bst utvalg. En upassende håndtering kan føre til svikt i reaksjonen. I dette eksperimentet, ADH1 (endogene referanse gen av mais) er angitt som positive kontrollen og to kapillærene uten primere er angitt som tomt kontroller. Så hvis lampen blanding håndteres riktig, positiv kontrollen vil vise grønne og tom kontrollen vil forbli uendret etter testen er utført.
For det tredje, på grunn av høy effektivitet av lampe reaksjon, falske positive eller carryover forurensning kan skje hvis det er ett spor mengde DNA amplicon i miljøet. Derfor alltid huske på at operasjonelle prosesser før reaksjon og etter reaksjon bør skilles strengt på ulike områder og lampe produktene bør være tett forseglet og forkastet etter analyse. Videre settes en tom kontroll for å angi en tilstrekkelig ytelse av lampe.
Egentlig, er rolig en universell flere mottakere nukleinsyre gjenkjennings-metoden med god fleksibilitet og utvidelsesmuligheter. LAMPE reaksjoner i kapillærene kan lett erstattes med andre typer isotermiske forsterkning metoder, for eksempel rulle sirkel forsterkning (RCA)29og recombinase utvalg forsterkning (RPA)30. Det kan også brukes i andre oppdagelsen felt, for eksempel patogen oppdagelsen27 og sykdom diagnose31.
I den nåværende formen av denne metoden, men primer sett er pre fast med chitosan, er prosessen med lampe blanding forberedelse fortsatt behov når testen utføres, som senker enkelheten til metoden. For å løse dette, ville vi prøve å forhåndslaste alle reagenser på lampe i av kapillær og deretter Pipetter prøven i kassetten. En annen begrensning for vår metode kan være mangel på nukleinsyre utvinning, men vi nå utvikler en mobil-basert maskin som ville kombinere utvinning av nukleinsyrer, automatisk bilde tar og dataanalyse å oppnå en virkelig "sample inn og resultater-ut "metoden.
I sammendraget, har vi utviklet rolig plattformen ved å integrere multiplex lampe med en kapillær matrise. Som en generell nukleinsyre oppdagelse metode har også ro potensialet i en rekke andre nukleinsyre analyse programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert delvis av National Natural Science Foundation av Kina tilskudd (31370813, 3147670, 31670831 og 31600672,), National transgene plante spesielle Fund (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programmet for nye tallet utmerket talenter i Universitetet, nasjonale nøkkelen forskning og utviklingsprosjekt i Kina (2016YFA0500601) og Kina postdoktor Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
