Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56624
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Summary

Lav-feltet (L-band, 1,2 GHz) elektron spinn resonans med løselig nitroxyl og trityl sonder er demonstrert for vurdering av fysiologisk viktige parametere i svulst microenvironment i musen modeller av brystkreft.

Abstract

Denne protokollen demonstrerer evnen til lav-feltet elektron spinn resonans (EPR)-basert teknikker i kombinasjon med funksjonell spinn sonder å gi kvantitativ informasjon om kjemisk svulst microenvironment (TME), inkludert p O2, pH, redox status, konsentrasjoner av interstitiell uorganiske fosfat (Pi) og intracellulær glutathione (GSH). Spesielt en anvendelse av en nylig utviklet løselig multifunksjonelle trityl sonde gir uovertruffen mulighet for i vivo samtidige målinger av pH, pO2 og Pi E xtracellular plass (håper sonde). Målinger av tre parametere ved hjelp av en enkelt sonde tillate deres sammenheng analyser uavhengig sonde distribusjon og av målinger.

Introduction

En nøkkelrolle i TME i kreft progresjon og terapi er stadig mer verdsatt1. Blant viktige fysiologiske parametere av TME i solide svulster, vev hypoksi2, acidosis3,4, høy redusert kapasitet5, forhøyede konsentrasjoner intracellulær GSH6,7, og interstitiell Pi8 er godt dokumentert. Noninvasiv i vivo pO2, pH, Pi, GSH og redoks vurderinger gir unik innsikt i biologiske prosesser i TME og hjelpe forhånd verktøy for pre-klinisk screening av anti-kreft narkotika og TME-målrettet strategier. En rimelig radiofrekvens gjennomtrenging dyp vev av magnetisk resonans imaging (MRI) og lav-feltet EPR-baserte teknikker gjør dem de mest aktuelle tilnærmingene noninvasive vurdering av parameterne TME. Mr avhenger i stor grad på tenkelig vann protoner og er mye brukt i klinisk innstillinger for å gi anatomiske løsning, men mangler funksjonelle oppløsning. Fosfor-31 kjernefysiske magnetisk resonans (31P-NMR) målinger av ekstracellulære Pi konsentrasjon og pH basert på et signal fra endogene fosfat er potensielt attraktiv for TME karakterisering, men er vanligvis maskert av flere ganger høyere intracellulær Pi konsentrasjoner9,10. I motsetning til dette, EPR målinger er avhengige av spektroskopi og imaging av spesielt utformet spinn sonder å gi funksjonell løsning. Merk at eksogene EPR sonder har en fordel over eksogene NMR sonder mye høyere iboende følsomheten til EPR og fravær av endogene bakgrunn EPR signaler. Den siste utviklingen av en dobbel funksjon pH og redoks nitroxyl sondere11 og multifunksjonelle trityl sonde12 gir uovertruffen muligheter for i vivo samtidige målinger av flere TME parametere og deres korrelasjon analyser uavhengig sonde distribusjon og tidspunktet for måling. Vi vet finnes det ingen andre metoder tilgjengelig for samtidig vurdere i vivo fysiologisk viktig kjemiske TME parametere i levende emner, for eksempel pO2, pHe, Pi, redox og GSH.

Sonder for I Vivo Funksjonelle målinger:

Figur 1 viser kjemiske strukturer av spinn sonder pleide adgang TME parametere, som inkluderer partikler og løselig sonder. Høy funksjonell følsomhet, stabilitet i levende vev og minimal toksisitet er noen fordeler som gjør partikler sonder foretrukket over løselig sonder for i vivo EPR oximetry. For eksempel har partikler sonder økt tid på stedet av vev implantat sammenlignet løselig sonder gir langsgående måling av vev pO2 over flere uker. På den annen side, løselig sonder utkonkurrere partikler sonder ved å gi romlig-løst mål med EPR-baserte imaging teknikker så vel som tillater samtidig analysene fra flere funksjoner (pO2, pH, Pi, redoks og GSH).

Figure 1
Figur 1. Kjemiske strukturer av spinn sonder som samle TME vurdering analysen. Dette inkluderer partikler pO2 sonden, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3lm3), og løselig sonder: dobbel funksjon pH og redoks sonde, NR; GSH-sensitive sonde, RSSR; og multifunksjonelle pO2, pH og Pi probe av den ekstracellulære microenvironment, håp sonden. Syntese av disse sonder har blitt beskrevet i de angitte referanser 11,12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført i samsvar med WVU IACUC godkjent protokollen.

1. sonde syntese og kalibrering

  1. Partikler pO2-sensitive LiNc-BuO sonde
    Merk: LiNc-BuO microcrystals syntetisert og forberedt som beskrevet i referanse13. De er meget stabil og kan oppbevares i romtemperatur i år. EPR linewidth av LiNc-BuO partikler sonden er en pO2-sensitive parameteren. LiNc-BuO microcrystals vise ideelle lineær avhengighet av linewidth på oksygen konsentrasjon i området fra anoksisk forhold til 760 mmHg pO2 delvis press13, med verdiene i indre linewidth i fravær varierer for ulike grupper av microcrystal utarbeidelse av oksygen og skråningen av oksygen avhengigheten (målt i mG/mmHg) litt. Derfor er kalibrering nødvendig for hver detalj bakst.
    1. Veie 60 mg av LiNc-BuO microcrystals.
    2. Oksygen følsomhet kalibrering, suspendere microcrystals i 3 mL Dulbeccos endret Eagle Media (DMEM) medium (i en konsentrasjon på 20 mg/mL) og sonicate for 5 min på isen med en sonde sonicator ved 20 kHz bruke 7 W strøm i 5-mL runde bunn røret.
    3. Sted 1 mL av sonicated microcrystals i et glass rør i overflaten coil resonator av L-band (1,2 GHz) EPR spectrometer og skaffe sammenhengende bølger (CW) EPR spectra på fysiologiske temperaturen på 37 ° C og oksygen konsentrasjoner av 0, 1, 2, 4, 8 , og 20.9%. Opprettholde oksygen konsentrasjon av bobler løsningen av gassblanding levert fra en gass kontroller og opprettholde temperaturen ved hjelp av et vannbad knyttet til en termostat. Bruk følgende EPR spectrometer oppkjøpet parametere: modulering amplitude, 100 mG; modulasjon frekvens 100 kHz; feie bredde, 5 G; feie tid, 60 s.
    4. For å oppnå en bedre signal-til-støy-forhold (SNR), bruker modulering amplituden verdien 60% av linewidth (f.eksbruke en modulering amplituden 0,6 G for linewidth på 1 G).
    5. Alternativ forenklet kalibreringsprosedyren: registrere EPR spectra i luft-boblet og anoksisk14. I sistnevnte tilfelle, opprettholde anoxia i utvalgene av 10 mM glukose og 100 U/mL gluko til 1 mL sonde løsninger referanse14.
    6. Passe til EPR spectra med funksjonen Lorentzian å finne linjebredden, LW. Evaluere følsomheten til microcrystals pO2 som en skråning på avhengigheten av LW på pO2, nemlig som verdien (LWluft−LWanoxia) /pO2air, der LWluft og LWanoxia spectra linewidth i luften og anoxia forhold, henholdsvis; p O2air = 152 mmHg.
  2. Dobbel funksjon pH og redoks sonde, NR
    Merk: NR sonden er syntetisert som beskrevet i referanse11. Det er stabil ved romtemperatur både som en solid og i vandige løsninger. Syntetisk NR sonden holdes på 4 ° C. Nitrogen hyperfine kløyvingen, enNog signal amplituden forfallet rate er de spectral parameterne av sonde NR som pH (sonde pKen = 6.6 ved 37 ° C, utvalg av pH følsomhet fra 5,6 til 7,6) og redusere kapasiteten på sonden microenvironment, henholdsvis.
    1. Fjern feltet NR fra fryseren og la beholderen til varm til romtemperatur (10-15 min). Veie ut 6.34 mg feltet NR oppløse den i 1 mL av saltvann og justere pH til 7.2 med små dele HCl eller NaOH med en pH-meter. Bruke NR løsningen (10 mM) som en lagerløsning.
    2. Utføre pH kalibrering av NR sonden som følger (se referanse11). Først legge til 0,1 mL NR lager løsningen 0.9 mL av 2 mM Na-fosfat buffer, 150 mM NaCl. Sjarmere fått 1 mM NR løsningen med dele HCl eller NaOH til nødvendige pH bruker en pH-meter. Kontrollere temperaturen ved hjelp av et vannbad knyttet til en termostat.
    3. Registrere EPR spektra av prøvene i 1,5-mL microcentrifuge rør med L-band EPR spectrometer. Bruk følgende EPR spectrometer oppkjøpet parametere: modulering amplitude, 2.5 G; modulasjon frekvens 100 kHz; feie bredde, 60 G; feie tid, 20 s.
    4. Måle hyperfine dele konstant (enN) som halvparten av avstanden mellom lav - og høy-feltet komponenter over EPR spectra og tegne det versus pH, å gi kalibreringskurven for L-band EPR målinger av pH.
  3. GSH-sensitive RSSR sonde
    Merk: RSSR sonden er syntetisert som beskrevet i referanse15. Lagre syntetisert NR sonden på 4 ° C. Lipofile RSSR disulfide biradical sammensatte diffunderer lett over cellemembranen reagere med intracellulære GSH og gir en pålitelig tilnærming for å bestemme GSH i vivo med EPR16,17. Denne metoden er basert på høy reaksjon priser av dominerende intracellulær bassenget til GSH thiols med RSSR sonden. Reaksjonen av RSSR biradical med GSH deler sin disulfide obligasjonslån (se ordningen 1) fører til sletting av spin utveksling mellom de to radikale fragmenter og manifestere i en reduksjon av biradical spectral komponenter og tilsvarende økning av monoradical komponenter. For biradical RSSR proben, veksten av amplituden til komponenten monoradical er proporsjonal med GSH konsentrasjonen og er en praktisk GSH-sensitive EPR spectral parameter. For å evaluere GSH konsentrasjonen fra i vivo EPR målingene, har den forrige kalibreringen av frekvensen av RSSR reaksjon med GSH tilsvarende temperatur og pH utføres slik.
    1. Fjerne RSSR fra fryseren og la beholderen til varm til romtemperatur (10-15 min). Veie ut 4.05 mg feltet NR og oppløse den i 1 mL av DMSO løsning. Bruke RSSR løsningen (10 mM) som en lagerløsning.
    2. Bestemme verdien av den prisen konstant, kobs, av reaksjonen til RSSR med GSH ønskelig temperatur og pH som følger.
    3. Først legger 20 µL av RSSR lager løsningen (10 mM) til 0.98 mL 1 mM Na-fosfat bufferen, pH 7.2, 150 mM NaCl, å få en 0.2 mM RSSR undersøke løsning.
    4. Utarbeide løsninger av 1, 2 og 5 mM konsentrasjoner av GSH inne 0.1 M Na-fosfat buffer ved pH 7.2. For å nøyaktig evaluere GSH konsentrasjon i cellene av målrettet orgelet fra målingene i vivo , må i vitro kalibreringen utføres på en pH nær verdien av intracellulær pH.
    5. Bland like mengder 0.2 mM RSSR løsning og en av de GSH løsningene i trinn 1.3.4. for en siste konsentrasjon av sonden på 0,1 mM og GSH på 0,5, 1 eller 2,5.
    6. Umiddelbart etter RSSR og GSH løsning miksing, plasser prøven i EPR resonator og spill til EPR spectra hver 12 sekunder i 10 minutter. Deretter beregne the kinetics av økningen av monoradical spectral amplituden. Bruk følgende EPR spectrometer oppkjøpet parametere: modulering amplitude, 1 G; modulasjon frekvens 100 kHz; feie bredde, 60 G; feie tid, 10-60 s.
    7. Passer den målte EPR kinetics å monoexponents og beregne tiden konstant av den eksponentielle kinetikk, τ. Den lineære regresjonen (1/τ = kobs × [GSH]) gir de observerte rate konstante verdi av reaksjonen GSH og RSSR (f.ekspå 34 ° C og pH 7.2, kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1)11.
  4. Multifunksjonelle håp undersøke for pO2, pH og Pi vurdering
    Merk: Monophosphonated trityl håp sonde er syntetisert som beskrevet i referanse12 og holdes på 4 ° C. CW EPR spektra av håp på pH << pKen (en - syre form) og pH >> pKen (B - grunnleggende form) representeres av doublets på grunn av fosfor hyperfine deling, enP. Typisk instrument-innstillingene er som følger: modulering amplitude, 37,5 mG; modulasjon frekvens 100 kHz; feie bredde, 0.9 G; feie tid, 20-60 s. Ved middels pH (5 < pH < 8) EPR spekteret av håp sonde er preget av en kvartett når både A og B er tilstede. Den personlige EPR linewidth av håp er en pO2 (nøyaktighet, ≈ 1 mmHg; p O2 spenner, 1-100 mmHg). Brøkdelen av protonerte håp (en form) er en pH mellom 6 8.0 (nøyaktighet, ± 0,05). Verdien av proton valutakursen (uttrykt i mG) med Pi utdraget av spectra simulering er en Pi markør (nøyaktighet, ± 0,1 mM, rekkevidde, 0.1-20 mM). Kalibrering prosedyrer er utført på fysiologiske temperatur (37 ° C), løsning ioniske styrke (NaCl, 150 mM) og håper sonde konsentrasjon av 0.2 mM, som tidligere beskrevet i referanser12,18, og nedenfor.
    1. Fjerne håp sonden fra fryseren og la beholderen til varm til romtemperatur (10-15 min).
    2. Veie ut 10.7 mg av håp sonden oppløse den i 1 mL av saltvann og justere pH 7,4. Legge til 20 µL av lager løsningen av håp (10 mM) til 0.98 mL av saltvann å få en 0.2 mM håp sonde løsning.
    3. For sonden kalibrering av pH, sjarmere 0.2 mM håp sonde løsningen med tillegg av en liten mengde NaOH eller HCl, med den siste fortynning av prøve mindre enn 1%. Måle pH-verdien med en pH elektrode kalibrert på 37 ° C ved hjelp av pH-verdiene for referanse løsningen anbefales av National Bureau av standarder (USA). Bruk en jacketed reaksjonen kanne knyttet til en Sirkulator å nøye opprettholde temperaturen i referansen og titrerte løsninger under pH-målinger. Opprettholde anoksisk forhold med tillegg av 10 mM glukose og 100 U/mL gluko til den sonde løsninger.
    4. Erverve EPR spektra av skjemaene A og B pH ≤ 5 og pH ≥ 8, henholdsvis i anoksisk forhold i fravær av fosfat.
    5. Bruke de tilsvarende spectra for å få iboende spectral parametere. Nemlig, simulere spectral linjen som convolution Lorentzian funksjonen med Gaussian funksjonen som tilnærmet uløste super hyperfine strukturen av håp sonden. Montering av de beregnede EPR spectra til de eksperimentelle spectra gir verdiene avP og Lorentzian linewidth (ΔLpp), bestemmes av tverrgående avslapning ofte, 1/T2 (der 1/T2 = (√3/2) Lpp for den målte deriverte av RF absorpsjon linjen i CW EPR), og linewidth av gauss-fordeling, G.
      Merk: Følgende er parameterne fra spectra målt på betingelsene som angis i trinn 1.4.2: enP(A) = 3.63 G, enP(B) = 3,37 G; 1/T2(A) = 23,6 mG; 1/T2(B) = 9 mG; G(A) = 40 mG; G(B) = 45 mG (se referanse8).
    6. Erverve EPR spektra av håp ved middels pH (5 < pH < 8). Simulere høy-arkivert komponenten til ervervet EPR spectra med teorien om utveksling mellom flere områder i ikke-kombinert eller løst sammenkoblede systemer tilpasset referanse19 som beskrevet tidligere18. Bruk parameterne iboende innhentet for A og B stater (se trinn 1.4.5) å redusere antall variabler. Passer til beregnede spectra til de eksperimentelle til å finne verdien i brøken en (pA), og plotte avhengigheten av pA -verdien på pH. Bruke avhengigheten av pA på pH i videre studier som en pH kalibreringskurven.
      Merk: Passende pH avhengigheten av pA med en standard titrering kurve angir verdien for den dissosiasjon konstant, pKen (HOPE) = 6,98. I i vivo studier er anskaffe de fulle EPR spektra av håp sonden upraktisk på grunn av den ekstra tiden for å tilegne gapet mellom lav - og høy-feltet komponenter av fosfor hyperfine deling i EPR spektrum. Derfor i videre eksemplifisert studier er bare høy-arkivert komponenten av EPR spekteret målt og analysert.
    7. For sonden kalibrering av pO2, erverve EPR spektra av håp sonden i ulike Oksygenkonsentrasjoner.
    8. Kontrollverdiene pO2 løsninger av bobler av gassblanding levert fra en gass-kontroller. Kontrollere løsning temperaturen (37 ° C) ved hjelp av et vannbad knyttet til en termostat.
    9. Simulere EPR spectra og Tilpass dem til de eksperimentelle som beskrevet i trinn 1.4.6 å bestemme verdier i oksygen-indusert avslapning priser.
      Merk: Verdiene av oksygen-indusert avslapning prisen var 0.49 mG/mmHg både for A og B former for håp sonde målt på 37 ° C8.
    10. For sonden kalibrering av [Pi], erverve EPR spektra av håp sonden i ulike fosfat konsentrasjoner. Bruke håp radikale løsningen med en pH-verdi nær pKen (pKen = 6,9 på 37 ° C)18 og sjarmere det med ulike fosfat konsentrasjoner. Opprettholde temperaturen og gass sammensetning som beskrevet i over trinn.
    11. Simulere EPR spectra og Tilpass dem til de eksperimentelle som beskrevet i trinn 1.4.6 å bestemme verdier i Pi-indusert valutakursen.
      Merk: Avhengigheten av valutakursen Pi-indusert [Pi] brukes som kalibrering i videre studier.

2. musen modeller av brystkreft

  1. MMTV-PyMT spontan svulst modell
    1. Bruke 4-8-uke-gamle kvinnelige venn viruset B-type mottakelighet/NIH (FVB/N) musen mammary svulst virus selskapet (MMTV) polyoma midt-T antigen (PyMT +) mus med spontant dannet mammary tumorer for i vivo EPR studier.
    2. Sammenligning av vev microenvironments normal brystkjertlene og svulster, bruke alder-matchet littermate kvinner mangelfull i de PyMT oncogene (PyMT−, "wild type")20.
    3. Underlagt musene L-band EPR spektroskopi en gang per uke for fire ukens under isoflurane anestesi (se sonde levering nedenfor).
    4. Bedøve musen bruker en luft-isoflurane blanding (3% isoflurane), og plassere musen på en justerbar tabell i svulsten (brystkjertlene) nær overflaten coil resonator rett, lateral stilling.
    5. Etter musen plassering, administrere sonden av intratissual (IT) injeksjon, tune EPR spectrometer og skaffe til EPR spectra i 5-10 min.
    6. Måle 2-3 mammary tumorer (fra MMTV-PyMT + mus) eller ikke-svulst bærer brystkjertlene (fra PyMT− mus) i samme EPR økt.
  2. Orthotopic MET-1 svulst modell
    1. Vokse FVB/N bakgrunn Met-1 murine brystkreft celler på 37 ° C, 5% CO2og 95% relativ fuktighet i DMEM som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 10 µg/mL insulin, 5 ng/mL rhEGF og 1% PSA (penicillin G natrium, streptomycin sulfate og amfotericin B) til ~ 80% samløpet i en T175 bolle.
    2. Sug opp media og skyll tilhenger cellene med 10 mL PBS (1,54 mM KH2PO4, 155 mM NaCl og 2,71 mM Na2HPO4-7 H2O uten veisalt eller magnesiumklorid, pH = 7.4).
    3. Koble cellene ved å legge 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA løsning og rocking kolbe. Når cellene er enebolig, tilsett 10 mL DMEM inneholder 10% FBS til flasken og samle celler.
    4. Sentrifuge celle suspensjon 132 x g i 10 min på 4 ° C. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og resuspend til 1 x 106 celler per 100 µL minimal DMEM.
    5. Bruker en insulinsprøyte (29G 1/2 p), sakte injisere 100 µL av svulst celle suspensjon i nummer 4 mammary fett pads 8-uke-gamle kvinnelige FVB/N wild type mus.
    6. Overvåke svulst innvielse ved palpasjon (vises etter ca 2-3 uker), vekst (visuell) og mus heath (visuell) annenhver dag.
    7. Måler svulst en gang per uke bruker calipers og bestemme svulst volumer ved hjelp av formelen:
      Figure

3. sonde levering i Vivo funksjonelle målinger

  1. Bruk partikler LiNc-BuO sonde (protokoll jeg) for pO2 mål i orthotopic svulst modeller av implanting kreftceller med internalisert LiNc-BuO microcrystals, som tidligere beskrevet14,21 og nedenfor.
    1. I tilfelle av MET-1 svulst modell, for internalization LiNc-BuO microcrystals i MET-1 celler, suspendere LiNc-BuO microcrystals i DMEM i en konsentrasjon på 20 mg/mL og sonicate med en sonde sonicator ved 20 kHz bruke 7 W strøm i 5-mL runde bunn røret etter 5 min på is.
    2. Legge til 100 µL (2 mg av LiNc-BuO) av suspensjon i en MT75 kolbe med 10 mL kultur medier som inneholder MET-1 celler (ca 30% confluent). Alle prosedyrer foregå i et biosikkerhet skap og mediet inneholder penicillin og streptomycin å minimere mulig infeksjon.
    3. Inkuber cellene på 37 ° C i 72 h eller til de når ~ 80% confluency.
    4. Sug opp media. Vask cellene fem ganger med 10 mL PBS. Koble cellene med 5 mL trypsin-EDTA. Samle cellene. Sentrifuger som beskrevet ovenfor i trinn 2.2.4. Stain celler med utelukkelse fargestoff å bestemme cellen levedyktighet og antall.
    5. Suspendere cellene i en konsentrasjon av 1 x 106 per 100 µL minimal DMEM.
    6. Bruker en insulinsprøyte, Injiser sakte 100 µL av cellen suspensjon som inneholder internalisert LiNc-BuO microcrystals i nummer 4 mammary fett pads 8-uke-gamle kvinnelige FVB/N wild type mus som beskrevet i trinn 2.2.5.
    7. Overvåke svulst initiering og vekst som beskrevet i trinn 2.2.6 og 2.2.7.
  2. Bruk partikler LiNc-BuO sonde (protokollen II) enten spontant eller orthotopic modeller. Injisere LiNc-OBu microcrystals på stedet av interesse, f.eksi normal brystkjertlene eller mammary tumorer, ved hjelp av en insulinsprøyte.
  3. Løselig sonder
    1. Bedøve mus ved inhalasjon av en luft-isoflurane blanding (1.0 L/min levering og 2-3% av isoflurane) bruke en bedøvelse maskin og plassere dem inn i gapet over EPR spectrometer.
    2. Justere instrumentet, og deretter injisere den NR (10-30 µL, 10 mM), håper sonden (10−30 µL, 0,5-2 mM) i saltvann, pH 7.2 eller RSSR sonde i DMSO (10 µL, 10 mM) løsninger (IT).

4. i Vivo funksjonelle målinger

  1. For EPR spektroskopiske målinger, bedøve mus ved innånding av luft-isoflurane blanding med en bedøvelse maskin som beskrevet i trinn 3.3.1.
  2. Utføre funksjonelle mål med L-band (1,2 GHz) EPR spectrometer som følger.
    1. Plasser overflaten coil-resonator på en normal melkekjertlene eller en mammary svulst og tune spectrometer.
    2. Tilegne seg til EPR spectra fra implantert partikler sonden i 5−10 min over flere uker etter implantasjon. Når det gjelder oppløselig sonder, erverve EPR spectra umiddelbart etter sonde injeksjon i 5-10 min.
    3. Analysere EPR spektra av NR sonden å finne hyperfine deling, enNog signal amplitude, I(t). Konverter verdien for enN til pH verdien kalibreringskurven fikk i trinn 1.2.4. Analyserer frekvensen av forfallet av signal amplituden I(t) relative endringen fra første amplituden, I(t = 0), beregnet i vilkårlig enheter per sekund (s-1).
    4. Passe økningen av monoradical komponenten av EPR spekteret av GSH-sensitive RSSR sonden å monoexponents å få tiden konstant av den eksponentielle kinetics beregne GSH konsentrasjon.
    5. Passe EPR spektra av høy-komponenten av multifunksjonelle håp sonde med eksperimentelle de som beskrevet i (trinn 1.4.5) å gi verdiene av pH, pO2 og Pi.

5. statistisk analyse

  1. Utfør databehandlingen og statistiske analyser. Bruk en Pearson's r korrelasjon test (for normalfordelt datasett) og Spearmans rang bestille sammenheng (for datasett med avviste normalitet over datadistribusjon) for korrelasjon analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vev p O 2 Vurdering ved hjelp av LiNc-BuO sonder:

Ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet under trinn 1.1, utførte vi kalibreringen av nylagde LiNc-BuO microcrystals suspensjon. Figur 2 viser den typiske oksygen avhengigheten av linewidth av LiNc-BuO sonden, samt dens eksemplifisert EPR spectra målt i bufferen suspensjon og i brystet tumor vev i kvinnelige C57Bl/6 mus vokst etter svulst innvielsen av injeksjon av celler med internalisert partikler (trinn 3.1). Bruker linewidth kalibreringen kan for beregning av vev pO2 verdien (lik 7,5 mmHg spektrum (b) vises i figur 2).

Figure 2
Figur 2 . EPR spectral følsomheten på partikler LiNc-BuO sonden oksygen. Representant avhengighet av linewidth av EPR spekteret av LiNc-BuO sonde suspensjon i DMEM på oksygen delvis press vises. EPR spekteret (Sett inn en) ble målt på 0% pO2, 37 ° C, og representerer en ren Lorentzian linje med linewidth ΔHpp = 113 mG. Linewidth øker lineært pO2 med en skråning på 11,7 mG/mmHg. Spekteret i (Sett inn b) ble målt i mammary tumor vev bedøvet kvinnelige C57Bl/6 mus viser ΔHpp = 204 mG, som tilsvarer vev pO2 av 7,5 mmHg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vurdering av vev ekstracellulære pH og Redox bruke feltet NR sonder:

Ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet under trinn 1.2, utførte vi kalibreringen av pH og redoks sonden, NR. Figur 3 viser den observerte hyperfine dele konstant avhengighet, enN, av NR radikale på pH. Avhengigheten er beskrevet av en standard titrering kurve med den pKen = 6.6 på 37 ° C. Denne avhengigheten av enN(pH) fungerer som kalibreringskurven for tilsvarende i vivo målinger, slik at pH-målinger i området fra 5.6 7.6, med nøyaktighet på 0,05 pH enheter.

Figure 3
Figur 3 . EPR spectral følsomhet av løselig NR sonden å pH L-band EPR spektra av NR sonde løsningen ble kjøpt på 37 ° C på ulike pH og pH-avhengighet av den observerte hyperfine dele konstant, enN, ble tegnet. Den heltrukne linjen er tilpasning av eksperimentelle data med standard titrering kurve, Equation 2 , gir pKen = 6.6, enN(NR-H+) = 14.24 G og enN(R) = sett inn 15.27 G.: eksemplifiseres EPR spekteret av 1 mM NR løsning (pH 6.4) ervervet bruker følgende spectrometer innstillinger: magnetfelt feie, 80 G; modulasjon amplitude, 2.5 G, anskaffet, 20 s. Den målte hyperfine dele konstant er 14.63 G. Reproduced fra referanse23 med tillatelse fra John Wiley & Sons, Inc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 illustrerer pH og redoks målene på brystet tumor musemodell, utført som beskrevet under trinn 3.3 (IT sonde injeksjon) og § 4 (spectra oppkjøp og spectra analyse).

Figure 4
Figur 4 . EPR vurdering av vevet redusert kapasitet i vivo. Sett inn: L-band EPR spekteret av NR sonden målt i vivo etter IT injeksjon (10 µL, 10 mM) i mammary tumor vev bedøvet kvinnelige FVB/N mus. Hyperfine deling, enN, ble funnet for å være lik 14.72 G, som tilsvarer verdien av pHe = 6.52 antar tumor vev temperatur 34 ° C og pKen = 6.6. NR reduksjon hastigheten vurderes etter forfallet av sentral-feltet spectral komponenten. Den eksemplifisert kinetics målt i mammary svulst (■) og brystkjertlene (o) vise høyere redusert kapasitet av tumor vev g. normal melkekjertlene. Analyse av den første delen av kinetics gir priser over EPR signal reduksjon, krød, i ekstracellulære media av vev som 2.5 x 10-3/si svulst vs 0.5 x 10-3/s i normal kjertel. Gjengitt fra referanse11 med tillatelse fra John Wiley & Sons, Inc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 oppsummerer pH-e og redoks målinger utført for den kvinnelige FVB/N MMTV-PyMT mus i svulster og normal brystkjertlene støtte svulst surt ekstracellulære microenvironment og redusere høykapasitets.

Figure 5
Figur 5 . I vivo EPR vurdering av vev Surhet og redusere kapasiteten. Ekstracellulære vev pH (fylte stolper) og reduksjon rate (tom barer) verdier for NR nitroxide i normal brystkjertlene og mammary tumorer kvinnelige FVB/N mus målt i vivo EPR. Feilfelt betegne SE. Reproduced fra referanse11 med tillatelse fra John Wiley & Sons, Inc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Samtidige vev pH e , Benyttet og p O 2 Vurdering ved å kombinere NR og LiNc-BuO sonder:

Partikler LiNc-BuO er sonden valgfrihet når repeterende langsgående målinger av pO2 verdier er planlagt i en forhåndsbestemt vev rundt. Dessverre, en stor begrensning av partikler sonden er at den bare tillater påvisning av oksygen og ingen andre fysiologisk relevante kjemiske parametere i TME, og tillater ikke vev bildebehandling. Dermed bruk av løselig sonder i EPR har fordelen av imaging og påvisning av flere fysiologisk relevante TME parametere. I denne forbindelse, pO2 mål med implantert LiNc-BuO partikler kan kombineres med dobbeltfunksjon pH og redoks NR sonde fordi lav - og høy-feltet spectral komponenter av NR EPR spekteret ikke overlapper med EPR linje av den LiNc-BuO sonde.

Figur 6 illustrerer en typisk EPR spektrum observert av NR sonden umiddelbart etter IT injeksjon i brystet tumor vev av kvinnelige C57Bl/6 mus. Observerte trilling spekteret av NR sonden er kledde med den EPR linjen av LiNc-BuO microcrystals som ha blitt integrert i svulsten (tumorveksten ble initiert av injeksjon av cellene med internalisert partikler som beskrevet i trinn 3.1. PH verdien beregnes ved å måle enN hyperfine deling som avstand mellom lav - og høy-feltet komponenter og bruke kalibreringen vises i Figur 3 (lik 6,88) spektrum vist i figur 6. Merk at pO2 vurdering er utført basert på målinger av linewidth av LiNc-BuO før injeksjon av NR sonden. Forfallet av NR gir verdien av vevet redusert kapasitet som vist i Figur 4.

Figure 6
Figur 6 . Multifunksjonelle TME vurdering LiNc-BuO og NR sonder. EPR spektrum målt i vivo i brystet tumor vev av kvinnelige C57Bl/6 mus umiddelbart etter IT injeksjon av NR sonden. Observerte trilling spekteret av feltet NR er lagt med en enkelt EPR linje av LiNc-BuO sonder i svulst. PH verdien beregnet deles mellom lav - og høy-feltet komponenter er 6,88. Forfallet av NR gir verdien av vevet redusert kapasitet. p O2 vurdering utføres basert på målinger av linewidth av LiNc-BuO før injeksjon av NR sonden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I Vivo Vurdering av intracellulær GSH:

Reaksjonen av thiol-disulfide utveksling mellom RSSR sonde og GSH deler disulfide obligasjon av sonden som resulterer i dannelsen av to monoradicals22 og Avbryting av intramolekylære spinn utveksling mellom monoradical fragmenter. Figur 7A illustrerer effekten av reaksjonen av RSSR sonde med GSH på EPR spectra forsvinningen av "biradical" spectral komponentene og tilsvarende økning av intensiteten av monoradical komponenter. Observerte rate konstanten av reaksjonen GSH og RSSR er: kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1 (T = 34 ° C, pH 7.2)11. Figur 7B eksemplifiserer kinetics av den monoradical spectral peak intensitet målt i mammary svulst (●) og vanlig melkekjertlene (o) med L-band EPR. Solid linjene er passer i den første delen av kinetics av monoexponent bruker kobs = 2,8 M-1s-1 og gir [GSH] = 10.7 mM og 3.3 mM for svulst og normal mammary kjertel, henholdsvis.

Figure 7
Figur 7 . I vivo EPR vurdering av intracellulær vev glutation konsentrasjoner. (A) X-bandet EPR spektra av 100 µM RSSR målt på ulike tidspunkt etter inkubasjon med 2,5 mM GSH inne 0.1 M Na-fosfat buffer pH 7.2 og 1 mM DTPA på 34 ° C. Kinetics analysen gir de observerte rate konstante verdi av reaksjonen GSH og RSSR, kobs (pH 7.2, 34 ° C) = (2,8 ± 0,2) M-1 s-1. (B) The kinetics av den monoradical spectral peak intensitet målt ved L-band EPR mammary svulst (●) og vanlig melkekjertlene (o) FVB/N mus straks IT injeksjon av RSSR sonde (se trinn 3.3.2). Solid linjene er passer i den første delen av kinetics av monoexponent, antok kobs (pH 7.2, 34 ° C) = 2,8 M-1s-1 og gir [GSH] = 10.7 mM og 3.3 mM for svulst og normal mammary kjertel, henholdsvis. Gjengitt fra referanse11 med tillatelse fra John Wiley & Sons, Inc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Multifunksjonelle vurdering av vev ekstracellulære pH, p O 2 , og Pi bruke multifunksjonelle håp sonden:

Figur 8 viser følsomheten til spectral parametere av håp sonden får kalibrering prosedyrene som er beskrevet under delen 1.4.

Figure 8
Figur 8 . Multifunksjonelle vurdering av den kjemiske microenvironment med håp sonde. (en) ordningen med pH-avhengig likevekt mellom to ionisering av sonden. (b) L-band EPR spekteret av håp. (c) The EPR linewidth av håp er en pO2 (nøyaktighet, ≈ 1 mmHg; p O2 spenner, 1-100 mmHg). (d) delen av protonerte håp er en pH mellom 6 8.0 (nøyaktighet, ± 0,05). (e) avhengighet av proton valutakurs (uttrykt i mG) av håp med uorganiske fosfat (Pi) konsentrasjon utdraget av spectra simulering (nøyaktighet, ± 0,1 mM, rekkevidde, 0.1-20 mM) 12,18. Gjengitt fra referanse8 med tillatelse fra naturen Publishing Group. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9 illustrerer multifunksjonelle målinger utført i FVB/N wild type mammary kjortelen og i TME av MMTV-PyMT transgene mus, som spontant utvikle brystkreft og etterligne menneskelige svulst staging20. Mener verdiene av pO2 (50 ± 3 mmHg i TME vs 58 ± 3 mmHg i normalt vev) og pHe (6.99 ± 0.03 i TME vs 7.1 ± 0.03 i normalt vev) støtter en opptreden av hypoxic og sure svulsten. De mest dramatiske endringene ble observert i konsentrasjonen av interstitiell Pi (1,8 ± 0.2 mM i TME vs 0.84 ± 0,07 mM i normalt vev) som indikerer en mulig rolle interstitiell Pi konsentrasjon som en TME markør av svulst progresjon. Individuelle målingene viser betydelige variasjoner rundt mener verdiene. En viktig fordel med en multifunksjonell sonde er at alle parametere er målt bruk en enkelt sonde, derfor tillater for korrelasjon analyser uavhengig av sonde distribusjon og tid av målinger som vist i figur 9b- e. De observerte positiv korrelasjonen mellom pO2 og pHe i normal melkekjertlene versus fravær av sammenhengen i svulster støtter svulst avhengigheten Glykolysen uavhengig av oksygen konsentrasjon. etter vår mening er dette en eksemplifisert i vivo demonstrasjon av Warburg effekten. Igjen, er det observerte negativ korrelasjonen mellom interstitiell [Pi] og pO2 både normal og tumor vev med foreningen av høy [Pi] (og lav ATP/Pi ratio) med endringer i bioenergi status lavere oksygen Angi.

Figure 9
Figur 9 . I vivo vev p O 2 pH e , og Pi vurdering ved hjelp av håp sonde og EPR. (en) fotografi av opplegget for i vivo L-band EPR målinger viser bedøvet musen mellom magnetene over EPR spektrometer, med innsatsen til høyre viser plasseringen og plassering av løkke-resonator på den målt vev. Merk den interstitielle ekstracellulære lokaliseringen av håp sonden: det ikke trenge inn i cellene på grunn av store ladet strukturer og håper signalet fra blodet ikke oppdages av EPR på grunn av signal utvidelse av håp complexation med plasma albumin24 . (b--e) Sammenheng mellom interstitiell pO2, pHeog Pi verdier målt i normal brystkjertlene av FVB/N wild type mus og TME av brystkreft i MMTV-PyMT transgene mus (n = 23). For å utvide rekkevidden av oksygen, ble anoksisk forhold i interstitielle rommet etablert av IT injeksjon av oksygen tidkrevende enzymatisk systemet av glukose/gluko (røde symboler). Blå linjene representerer en lineær plass for totalt datasettene. (b) en positiv korrelasjon mellom pO2 og pHe i normalt vev (r = 0,5, p = 0.014 for svart symboler, r = 0.64, p = 1,8 × 10-4 for totalt datasettet) vs (c) nei betydelig sammenheng mellom pO2 og pHe i TME (r = 0,01, p = 0,97 for svart symboler, r = 0,23, p = 0,3 for totalt datasettet) ble funnet. (d) en negativ korrelasjon mellom pO2 og Pi både i normalt vev (r = −0.51, p = 0.013 for svart symboler, r = −0.7, p = 2.3 × 10-5 for totalt datasettet) og (e) i TME (b, bunn: r = −0.4, p = 0.079 svart symboler; r = −0.62, p = 0.001 totale datasett) ble funnet. Tilpasset fra referanse8 med tillatelsen av natur Publishing Group. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene presentert tillate noninvasive i vivo vurdering av kritiske parametere av den kjemiske TME, nemlig pO2, pH, redox status og konsentrasjoner av interstitiell Pi og intracellulær GSH. Magnetisk resonans teknikker, som Mr og lav-feltet EPR, er metoder valgfrihet for noninvasive i vivo profilering av parameterne TME. Mr visualiserer anatomiske strukturer, men mangler funksjonelle følsomhet. I motsetning til Mr gi EPR teknikker funksjonelle følsomhet av lokale parameterne for microenvironment når den brukes i kombinasjon med funksjonell spinn sonder. Vi vet finnes det ingen andre metoder tilgjengelig for samtidig vurdere i vivo fysiologisk viktig kjemiske TME parametere i levende emner, for eksempel pO2, pHe, Pi, redox og GSH.

Beskrevet protokollene er basert på bruk av lav-feltet L-band EPR og spesialdesignet spinn sonder. Et sett med fire sonder i figur 1 kan betraktes som effektive i vivo TME vurdering analysen. Tilgjengeligheten av sonder er en viktig forutsetning for beskrevet i vivo EPR målingene. Syntese av sonder ifølge publiserte prosedyrer11,12,13,15 krever kompetanse i syntetisk organisk kjemi og kan bli et kritisk punkt for metodeimplementering .

Gjentatte målinger av vev pO2 for opptil uker etter implantasjon14,21gjør programmet av partikler sonden. Løselig sonder demonstrere følsomhet for et utvidet antall parameterne utover oksygen konsentrasjon25 og gi en mulighet for romlig-løst målinger26. Spesielt, gir et program av multifunksjonelle håp sonden uovertruffen mulighet for i vivo samtidige målinger av pH, pO2og Pi ekstracellulære plass. Målinger av tre parametere bruke en enkelt sonde tillater sine korrelasjon analyser uavhengig sonde distribusjon og av målinger8.

Sonder kan ikke brukes samtidig, unntatt implantert LiNc-BuO partikler sonden, som kan brukes i kombinasjon med noen av løselig sonder som vist i figur 6. Derfor bør eksperimentell design være basert på egne målinger av personlige injeksjoner av bestemte funksjonelle løselig sonder. Hydrofile ekstracellulære pH og redoks NR proben kan leveres via IT injeksjon11,14,26 og systemisk levering27, mens to andre løselig sonder, RSSR og håp, tillate IT levering bare 8 , 11 , 12 , 16. Vær oppmerksom på at de strukturelle modifikasjonene av RSSR og håper sonder kan overvinne sistnevnte begrensning av sonden levering av utvikling av mer hydrofile og mindre giftige sonde analogs for systemisk levering25.

Merk at spektroskopiske EPR modalitet gir gjennomsnittlige verdiene for parameterne målt i TME, som er ofte preget av sin høye heterogenitet. Dette delvis masker potensielle forskjellen parameterne eller reduserer betydning i sammenheng analyse. Bruk av beskrevet sonder i imaging modaliteter tillater å skaffe romlig løst funksjonelle informasjon26. Vi tror at fremtiden for Flerfunksjonell EPR imaging avhengig videreutviklingen av relativt nye metoder som rask skanning EPR bildebehandling og Overhauser forbedret MRI (OMRI, også kalt proton-elektron dobbel-resonans imaging, PEDRI). De nye retningene i utviklingen av funksjonelle EPR prober og avanserte imaging teknikker har nylig blitt diskutert i tilsvarende funksjonen artikkel25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH gir CA194013, CA192064 og U54GM104942. WVCTSI er anerkjent for oppstart VVK, AB, og TDE. Forfatterne takker Dr. M. Gencheva og K. Steinberger for hjelp med den illustrerende eksperimenter. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-band EPR spectrometer Magnettech, Germany L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller  Noxygen, Germany Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
Sonicator Fisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced) Sigma-Aldrich G4251
MMTV-PyMT  mice In house
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Met-1 murine breast cancer cells In house
C57Bl/6 wild type mice  Jackson Laboratory
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypan Blue Exclusion Dye  Thermo Fisher Scientific T10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo) Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic sigma-Aldrich S07051
Sodium Chloride sigma-Aldrich S7653
Hydrochloric acid sigma-Aldrich 320331
Sodium Hydroxide sigma-Aldrich S8045
Glucose sigma-Aldrich
Glucose oxydase sigma-Aldrich
Lauda Circulator E100 Lauda-Brikmann
pH meter Orion Thermo Scientific 
LiNc-BuO probe In house The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probe In house The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probe In house The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probe In house The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siemann, D. W. Tumor Microenvironment. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Hicks, R. Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. Practical NMR spectroscopy. , Heyden. (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Tags

Kreftforskning problemet 133 elektron spinn resonans nitroxide trityl radikale pH oksygen konsentrasjon redox status glutation uorganisk fosfat svulst microenvironment
<em>I Vivo</em> EPR vurdering av pH, <em>p</em>O<sub>2</sub>, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bobko, A. A., Eubank, T. D.,… More

Bobko, A. A., Eubank, T. D., Driesschaert, B., Khramtsov, V. V. In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (133), e56624, doi:10.3791/56624 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter