Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56624
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Summary

ويتجلى الحقل منخفضة (النطاق L، 1.2 جيجاهرتز) الإلكترون الرنين باراماجنيتيك استخدام المسابير نيتروكسيل وتريتيل للذوبان لتقييم البارامترات فسيولوجيا هاما في ورم المكروية في نماذج الماوس لسرطان الثدي.

Abstract

هذا البروتوكول يوضح قدرة إلكترون منخفضة-حقل باراماجنيتيك الرنين (EPR)-على أساس تقنيات في تركيبة مع تحقيقات باراماجنيتيك الوظيفية لتوفير معلومات كمية عن المواد الكيميائية وورم المكروية (TME)، بما في ذلك ف O2، الرقم الهيدروجيني، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات غير العضوية المتداخلة (Pi)، وداخل الخلايا الجلوتاثيون (المدفع جريازيف). على وجه الخصوص، يقدم طلبا للتحقيق مؤخرا نمواً ترتيل متعدد الوظائف القابلة للذوبان فرصة غير مسبوقة في فيفو قياسات متزامنة من فحو فس2 ففي ه إكستراسيلولار الفضائية (تحقيق الأمل). قياسات المعلمات الثلاث باستخدام مجس واحد تسمح بتحليلاتها العلاقة مستقلة عن توزيع المسبار والوقت للقياسات.

Introduction

دور رئيسي ل TME في تطور السرطان والعلاج هو تقدير متزايد1. بين المعلمات الفسيولوجية الهامة من TME في الأورام الصلبة، نقص الأنسجة2، الحماض3،4، عالية مما يقلل قدرة5، وتركيزات مرتفعة من داخل الخلايا المدفع جريازيف6،7، ومن خلالي Pi8 موثقة توثيقاً جيدا. تقييمات موسع المجراة في فس2ودرجة الحموضة وبي، والمدفع جريازيف والأكسدة والاختزال تقديم رؤى فريدة من نوعها في العمليات البيولوجية في TME، وتساعد أدوات مسبقة لفحص ما قبل السريرية للأدوية المضادة للسرطان، واستهدفت TME الاستراتيجيات العلاجية. عمق اختراق معقولة الترددات الراديوية في الأنسجة بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والتقنيات المستندة إلى الجيش الشعبي الثوري منخفضة-ميدان يجعلها أنسب النهج لتقييم موسع لهذه المعلمات TME. التصوير بالرنين المغناطيسي تعتمد إلى حد كبير على تصوير المياه البروتونات ويستخدم على نطاق واسع في ظروف سريرية لتوفير دقة التشريحية لكنه يفتقر إلى قرار الفنية. يحتمل أن تكون جذابة لتوصيف TME قياسات الرنين المغناطيسي النووي الفوسفور-31 (31فالرنين المغناطيسي النووي) تركيز Pi خارج الخلية، ودرجة الحموضة استناداً إلى إشارة من الفوسفات الذاتية، ولكن يتم حجب عادة قبل عدة مرات أعلى داخل الخلايا Pi تركيزات9،10. على النقيض من هذا، الجيش الشعبي الثوري القياسات تعتمد على التحليل الطيفي والتصوير خصيصا لتصميم المجسات باراماجنيتيك لتوفير دقة الوظيفية. علما بأن تحقيقات الجيش الشعبي الثوري خارجية تتمتع بميزة خارجية يسبر الرنين المغناطيسي النووي نظراً لحساسية الجوهرية أعلى كثيرا من المنتجين وغياب إشارات الجيش الشعبي الثوري الخلفية الذاتية. وضع مؤخرا وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة والاختزال نيتروكسيل التحقيق11 وترتيل متعدد الوظائف مسبار12 يوفر فرصاً غير مسبوقة في فيفو القياسات المتزامنة من عدة TME المعلمات وبهم علاقة تحليلات مستقلة في توزيع المسبار والوقت لقياس. على حد علمنا، هناك لا أساليب أخرى متاحة لتقييم في فيفو الناحية الفسيولوجية الكيميائية TME المعالم الهامة في المواضيع المعيشية، مثل فس2، الرقم الهيدروجينيهوبي، والأكسدة والاختزال والمدفع جريازيف في نفس الوقت.

تحقيقات عن في فيفو القياسات الوظيفية:

ويبين الشكل 1 التركيبات الكيميائية لتحقيقات باراماجنيتيك المستخدمة للوصول المعلمات TME، التي تشمل تحقيقات الجسيمات وقابل للذوبان. حساسية فنية عالية، والاستقرار في الأنسجة الحية، والحد الأدنى من السمية هي بعض الفوائد التي تجعل الجسيمات المسابير المفضل عبر المسابير القابلة للذوبان في فيفو oximetry الجيش الشعبي الثوري. على سبيل المثال، زادت المسابير الجسيمات مرات الاحتفاظ في موقع زرع الأنسجة القابلة للذوبان المسابير السماح للقياس الطولي للنسيج فس2 على مدى عدة أسابيع بالمقارنة. من ناحية أخرى، يتفوق المسابير القابلة للذوبان المسابير الجسيمات بتوفير القياسات المكانية حلها باستخدام الجيش الشعبي الثوري على أساس تقنيات التصوير فضلا عن السماح بتحليل ما يصاحب ذلك من وظائف متعددة (فس2، ودرجة الحموضة، Pi، الأكسدة والاختزال، و المدفع جريازيف).

Figure 1
الشكل 1. التركيبات الكيميائية لتحقيقات باراماجنيتيك أن تجميع TME تقييم مقايسة. وهذا يشمل الجسيمات فس2 التحقيق اللغوي-المعلومات (R =-O (الفصل2)3CH3)، والمسابير القابلة للذوبان: وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة المسبار، المجلة؛ مسبار المراعية للمدفع جريازيف، رسر؛ ومتعددة الوظائف فس2ودرجة الحموضة والتحقيق Pi المكروية خارج الخلية، المسبار الأمل. قد وصفت توليف هذه المسابر في المراجع المتوفرة 11،12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الأعمال الحيوانية قد أنجزت وفقا لبروتوكول IACUC WVU المعتمدة.

1-التحقيق في التوليف والمعايرة

  1. جسيمات فس2-التحقيق اللغوي--المعلومات الحساسة
    ملاحظة: توليف ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات وإعداد كما هو موضح في مرجع13. فهي مستقرة جداً ويمكن أن تحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة سنوات. لينيويدث الجيش الشعبي الثوري المسبار الجسيمات المعلومات اللغوي هو فس2-المعلمة حساسة. ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات تثبت الاعتماد الخطي المثالي من لينيويدث على تركيز الأكسجين في النطاق من ظروف وصول ما يصل إلى 760 مم زئبق فس2 الضغط الجزئي13، مع قيم لينيويدث الذاتية في غياب الأكسجين والمنحدر من الاعتماد الأوكسجين (مقيسا بملغ/مم زئبق) قليلاً مختلفة لمجموعات مختلفة من إعداد ميكروكريستال. ولذلك، مطلوب المعايرة لكل دفعة معينة.
    1. تزن 60 ملغ ميكروكريستالس المعلومات اللغوي.
    2. لمعايرة حساسية الأكسجين، تعليق ميكروكريستالس في 3 مل من وسائل الإعلام النسر تعديل (دميم) المتوسطة دولبيكو (بتركيز 20 ملغ/مل) و sonicate لمدة 5 دقائق على الجليد مع سونيكاتور تحقيق في 20 كيلوهرتز استخدام 7 ث السلطة في أنبوب جولة-أسفل زجاج 5 مل.
    3. مكان 1 مل من ميكروكريستالس سونيكاتيد في زجاج الأنبوبة في جهاز رنان لفائف السطحية من مطياف النطاق L (1.2 جيجاهرتز) الجيش الشعبي الثوري والحصول على موجات مستمرة (CW) الجيش الشعبي الثوري الأطياف عند درجة حرارة 37 درجة مئوية والأكسجين تركيزات 0، 1، 2، 4، 8 الفسيولوجية ، و 20.9 في المائة. الحفاظ على تركيز الأكسجين بالسطح الحل مع الغاز خليط من وحدة تحكم غاز والحفاظ على درجة الحرارة باستخدام حمام مائي يعلق على الحرارة. استخدم الجيش الشعبي الثوري مطياف اكتساب المعلمات التالية: السعة التحوير، 100 ملغ؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، 5 ز؛ اكتساح الوقت، 60 ثانية.
    4. لتحقيق أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دائرة الاستخبارات الوطنية)، استخدم قيمة سعة تحوير من 60% لينيويدث (مثلاً، استخدام سعة تحوير غ 0.6 لينيويدث ز 1).
    5. البديل تبسيط إجراء المعايرة: تسجيل الأطياف الجيش الشعبي الثوري في حلول bubbled الهواء ووصول14. وفي الحالة الأخيرة، الحفاظ على أكسجين في العينات بإضافة الجلوكوز 10 ملم واوكسيديز الجلوكوز يو/مليلتر 100 إلى 1 مل مسبار الحلول وفقا لمرجعية14.
    6. تناسب الأطياف الجيش الشعبي الثوري مع الدالة لورينتزيان للعثور على عرض الخط، بوزن المادة الدهنية. تقييم حساسية ميكروكريستالس إلى فس2 كمنحدر من اعتماد بوزن المادة الدهنية على فس2، أي كقيمة (بوزن المادة الدهنيةالهواء−LWأكسجين)/فس2air، حيث بوزن المادة الدهنيةالهواء بوزن المادة الدهنيةأكسجين لينيويدث الأطياف في الأحوال الجوية واكسجين، على التوالي؛ ف O2air = 152 ملم زئبق.
  2. وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة المسبار، NR
    ملاحظة: يتم تصنيعه المسبار رقم كما هو موضح في مرجع11. أنها مستقرة في درجة حرارة الغرفة صلبة وفي المحاليل. يتم الاحتفاظ بالمسبار رقم التوليفية في 4 درجات مئوية. تقسيم هايبرفيني النيتروجين،ن، ومعدل تسوس مطال إشارة هي معلمات الطيفية المسبار NR حساسة لدرجة الحموضة (التحقيق pK = 6.6 في 37 درجة مئوية، مجموعة من حساسية درجة الحموضة من 5.6 إلى 7.6) وإلى تخفيض قدرة التحقيق المكروية، على التوالي.
    1. إزالة NR من الثلاجة وتسمح للحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة). تزن بملغ 6.34 من NR، حله في 1 مل المحلول الملحي، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع مختبرين الصغيرة من HCl أو هيدروكسيد الصوديوم باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدام الحل NR استعداد (10 ملم) كحل أسهم.
    2. إجراء المعايرة pH المسبار NR كما يلي (انظر المرجع11). أولاً، إضافة 0.1 مل الحل NR الأسهم إلى 0.9 مل مم 2 غ-الفوسفات المخزن المؤقت، 150 مم كلوريد الصوديوم. تيتراتي الحل NR حصل على 1 مم مع مختبرين HCl أو هيدروكسيد الصوديوم إلى درجة الحموضة المطلوبة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. التحكم درجة الحرارة باستخدام حمام مائي يعلق على الحرارة.
    3. تسجيل الأطياف الجيش الشعبي الثوري من العينات في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل استخدام مطياف النطاق L الجيش الشعبي الثوري. استخدم الجيش الشعبي الثوري مطياف اكتساب المعلمات التالية: السعة التحوير، 2.5 G؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، ز 60؛ اكتساح الوقت، 20 ثانية.
    4. قياس هايبرفيني تقسيم ثابت (ن) كنصف المسافة بين مكونات الحقل المنخفضة والعالية من أطياف الجيش الشعبي الثوري والأرض أنه مقابل الرقم الهيدروجيني، تقديم منحنى المعايرة لقياس الرقم الهيدروجيني النطاق L الجيش الشعبي الثوري.
  3. مسبار رسر المراعية للمدفع جريازيف
    ملاحظة: يتم تصنيعه المسبار رسر كما هو موضح في مرجع15. تخزين رقم التوليفية التحقيق في 4 درجات مئوية. مركب بيراديكال ثنائي كبريتيد رسر محبتين ينشر بسهولة عبر غشاء الخلية تتفاعل مع المدفع جريازيف داخل الخلايا، وتوفير نهج موثوق بها لتحديد المدفع جريازيف في فيفو استخدام الجيش الشعبي الثوري16،17. يستند هذا الأسلوب على معدلات عالية من رد فعل تجمع داخل الخلايا الغالبة للمدفع جريازيف ثيولس مع المسبار رسر. رد فعل بيراديكال رسر مع تقسيمات المدفع جريازيف ثنائي كبريتيد السندات (انظر المخطط 1) أسفر عن إلغاء التبادل تدور بين اثنين من شظايا الراديكالية ويظهر في انخفاض المكونات الطيفية بيراديكال والمقابلة زيادة مكونات مونوراديكال. للمسبار رسر بيراديكال، بمعدل زيادة السعة للمكون مونوراديكال يتناسب مع تركيز المدفع جريازيف ومعلمة طيفية حساسة للمدفع جريازيف الجيش الشعبي الثوري مريحة. لتقييم تركيز المدفع جريازيف من القياسات الجيش الشعبي الثوري في فيفو ، قد المعايرة السابقة المعدل لرد فعل رسر مع المدفع جريازيف في درجة الحرارة ودرجة الحموضة المقابلة النحو التالي.
    1. إزالة رسر من الثلاجة وتسمح للحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة). تزن بملغ 4.05 من NR وتذوب في 1 مل من محلول [دمس]. استخدم الحل رسر استعداد (10 ملم) كحل أسهم.
    2. تحديد قيمة معدل ثابت، كobs، من رد فعل رسر مع المدفع جريازيف المرغوب فيه درجة الحرارة ودرجة الحموضة كما يلي.
    3. أولاً، إضافة 20 ميليلتر من الحل رسر الأسهم (10 مم) إلى 0.98 مل من المخزن المؤقت 1 مم نا-الفوسفات، الرقم الهيدروجيني 7.2، 150 مم كلوريد الصوديوم، للحصول على 0.2 مم رسر التحقيق الحل.
    4. إعداد حلول لتركيزات المدفع جريازيف 1 و 2 و 5 مم في المخزن المؤقت للفوسفات نا م 0.1 في الرقم الهيدروجيني 7.2. وقد المعايرة في المختبر لتقييم دقة تركيز المدفع جريازيف في الخلايا الجهاز المستهدف من القياسات في فيفو ، يجب القيام بها في الرقم الهيدروجيني القريبة من قيمة pH داخل الخلايا.
    5. مزيج من كميات متساوية من 0.2 مم رسر الحل وواحد من الحلول المدفع جريازيف إعدادها في الخطوة 1.3.4. لنهائي تركيز التحقيق على 0.1 ملم والمدفع جريازيف في 0.5 أو 1 أو 2.5 ملم.
    6. فور حل رسر والمدفع جريازيف خلط، وضع العينة في جهاز رنان الجيش الشعبي الثوري وتسجيل الأطياف الجيش الشعبي الثوري كل 12 ثانية لمدة 10 دقائق. ثم حساب الحركية لزيادة السعة الطيفية مونوراديكال. استخدم الجيش الشعبي الثوري مطياف اكتساب المعلمات التالية: السعة التحوير، ز 1؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، ز 60؛ وقت الاجتياح، 10-60 ثانية.
    7. وتناسب حركية الجيش الشعبي الثوري المقاسة إلى مونوكسبونينتس حساب وقت ثابت لحركية الأسى، τ. الانحدار الخطي (1/τ = ك ×obs [المدفع جريازيف]) يوفر قيمة ثابتة لوحظ معدل رد الفعل بين المدفع جريازيف ورسر (مثلاً، في 34 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7-2، كobs = 2.8 ± 0.2 M-1ق-1)11.
  4. متعدد الوظائف مسبار الأمل فس2ودرجة الحموضة، وتقييم Pi
    ملاحظة: ترتيل مونوفوسفوناتيد يتم تصنيعه مسبار الأمل كما هو موضح في مراجع12 ، ويحتفظ بها في 4 درجات مئوية. وتمثل دوبليتس بسبب هايبرفيني الفوسفور تقسيم،فالأطياف الجيش الشعبي الثوري CW من الأمل في الأس الهيدروجيني << pK (-شكل حمض) ودرجة الحموضة >> pK (ب-النموذج الأساسي). إعدادات أداة نموذجية كما يلي: السعة التحوير، 37.5 ملغ؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، 0.9 ز؛ وقت الاجتياح، 20-60 ثانية. في متوسط درجة الحموضة (5 < الأس الهيدروجيني < 8) تتميز الطيف الجيش الشعبي الثوري لتحقيق الأمل باللجنة الرباعية عند كلا A وب الدول موجودة. لينيويدث الجيش الشعبي الثوري الفردية من الأمل علامة2 فس (الدقة، ≈ 1 مم زئبق؛ ف س2 النطاق، 1-100 ملم زئبق). جزء صغير البروتونية الأمل (نموذج) علامة الرقم الهيدروجيني في النطاق من 6 إلى 8.0 (الدقة، ± 0.05). قيمة سعر الصرف بروتون (معبراً عنها بملغ) مع Pi المنتزعة عن طريق محاكاة الأطياف علامة Pi (الدقة، ± 0.1 ملم، النطاق، 0.1-20 ملم). يتم تنفيذ إجراءات المعايرة في درجة الحرارة الفسيولوجية (37 درجة مئوية) وحل القوة الأيونية (كلوريد الصوديوم، 150 مم) وتركيز التحقيق الأمل من 0.2 مم، كما هو موضح سابقا في مراجع12،18، والمفصلة أدناه.
    1. إزالة المسبار الأمل من الثلاجة وتسمح للحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة).
    2. تزن بملغ 10.7 المسبار الأمل، حله في 1 مل المحلول الملحي، وضبط ال pH إلى 7.4. إضافة 20 ميليلتر الحل الأسهم المعدة للأمل (10 مم) إلى 0.98 مل المحلول الملحي للحصول على 0.2 مم أمل التحقيق الحل.
    3. لمعايرة مسبار درجة الحموضة، تيتراتي 0.2 مم الحل مسبار الأمل بإضافة كمية صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم أو HCl، مع التخفيف النهائي للعينة أقل من 1%. قياس درجة الحموضة مع قطب الأس الهيدروجيني معايرة في 37 درجة مئوية باستخدام قيم الأس الهيدروجيني لحل المرجع وأوصى بالوطنية المكتب من المعايير (الولايات المتحدة). استخدم كوب رد فعل تغلف يعلق على مدوار للحفاظ على درجة الحرارة المرجعية وحلول معاير بعناية أثناء قياس درجة الحموضة. المحافظة على شروط وصول بإضافة الجلوكوز 10 ملم واوكسيديز الجلوكوز يو/مليلتر 100 من الحلول التحقيق.
    4. الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري من النماذج ألف وباء على درجة الحموضة ≤ 5 ودرجة الحموضة ≥ 8، على التوالي، في ظروف وصول في الغياب للفوسفات.
    5. استخدام الأطياف المقابلة للحصول على المعلمات الطيفية الجوهرية. إلا وهي محاكاة الخط الطيفية كالالتواء الدالة لورينتزيان مع وظيفة غاوسي يقارب هيكل المسبار الأمل هايبرفيني سوبر التي لم تحل بعد. تركيب الأطياف الجيش الشعبي الثوري المحسوب للاطياف تجريبي ينتج قيمف ولينيويدث لورينتزيان (ΔLpp)، تحدد معدل استرخاء عرضية، 1/T2 (حيث 1/T2 = pp (√3/2) ل المشتقة يقاس من خط امتصاص الترددات اللاسلكية في الجيش الشعبي الثوري الأسلحة الكيميائية)، ولينيويدث لتوزيع غاوسي، غ.
      ملاحظة: وفيما يلي المعلمات التي تم الحصول عليها من الأطياف مقاسة في الشروط المحددة في الخطوة 1.4.2:P(A) = 3.63 ز،ف(ب) = ز 3.37؛ 1/T2(أ) = 23.6 ملغ؛ 1/T2(ب) = 9 ملغ؛ G(A) = 40 ملغ؛ G(B) = 45 ملغ (انظر المرجع8).
    6. الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري أمل على درجة الحموضة الوسيطة (5 < الرقم الهيدروجيني < 8). محاكاة عنصر أطياف الجيش الشعبي الثوري المكتسبة باستخدام نظرية التبادل بين مواقع عدة في النظم غير مقترنة أو المتباعدة مقتبس من مرجع19 كما هو موضح سابقا18قدم عالية. استخدام المعلمات الجوهرية التي تم الحصول عليها ألف وب الدول (راجع الخطوة 1.4.5) إنقاص العدد من المتغيرات. تناسب الأطياف المحسوبة لتلك التجريبية البحث عن قيم كسر (pA)، وارسم اعتمادقيمة p على درجة الحموضة. استخدام الاعتماد فأ على درجة الحموضة في إجراء المزيد من الدراسات كمنحنى معايرة الأس الهيدروجيني.
      ملاحظة: من المناسب اعتماد درجة الحموضة pA مع منحنى معايرة قياسية توفر قيمة الانفصال المستمر، pK (الأمل) = 6.98. في دراسات في فيفو ، الحصول على كامل الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار الأمل أمر غير عملي بسبب الوقت الإضافي اللازم للحصول على الفجوة القائمة بين مكونات الحقل المنخفضة والعالية من هايبرفيني الفوسفور تقسيم في الطيف الجيش الشعبي الثوري. ولذلك، في إجراء المزيد من الدراسات يتضح قدم عالية مكون فقط من الطيف الجيش الشعبي الثوري تم قياس وتحليل.
    7. لمعايرة مسبار فس2، الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار الأمل تركيزات الأكسجين مختلف.
    8. سلم قيم عنصر التحكم فس2 من الحلول بالسطح مع خليط الغاز من وحدة تحكم غاز. التحكم في درجة الحرارة الحل باستخدام حمام مائي يعلق على الحرارة (37 درجة مئوية).
    9. محاكاة الأطياف الجيش الشعبي الثوري وتلائم تلك التجريبية كما هو موضح في الخطوة 1.4.6 لتحديد قيم معدلات الأوكسجين المستحثة الاسترخاء.
      ملاحظة: قيم معدلات الأوكسجين المستحثة الاسترخاء 0.49 مغ/مم زئبق كلا ألف وب أشكال الأمل في التحقيق كما يقاس على 37 درجة مئوية8.
    10. لمعايرة مسبار [بي]، اكتساب الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار الأمل تركيزات الفوسفات المختلفة. استخدام حل جذري الأمل بقيمة pH قرب pK (pK = 6.9 في 37 درجة مئوية)18 وتيتراتي أنه مع تركيزات الفوسفات المختلفة. الحفاظ على درجة الحرارة والغاز التكوين كما هو موضح في الخطوات أعلاه.
    11. محاكاة الأطياف الجيش الشعبي الثوري وتلائم تلك التجريبية كما هو موضح في الخطوة 1.4.6 لتحديد القيم التي يسببها بي سعر الصرف.
      ملاحظة: اعتماد سعر الصرف الناجمة عن Pi على [بي] المعايرة في إجراء المزيد من الدراسات.

2. الماوس نماذج لسرطان الثدي

  1. MMTV-الدفع الورم عفوية النموذجي
    1. استخدم الأسبوع 4-8-فيروس ب-نوع الحساسية/المعاهد الوطنية للصحة (ففب/N) الماوس الأورام الثديية الفيروس المروج (ممتف) polyoma الأوسط-تي صديق الإناث القديمة مستضد (الدفع +) الفئران مع الأورام الثديية شكلت عفويا في فيفو دراسات الجيش الشعبي الثوري.
    2. لمقارنة ميكرونفيرونمينتس أنسجة الغدد الثديية العادية والأورام، استخدام الإناث ليتيرماتي مطابقة سن القصور في الدفع السرطاني (PyMT−، "نوع البرية")20.
    3. إخضاع الفئران للتحليل الطيفي المنتجين النطاق L مرة واحدة في الأسبوع لمدة أربعة أسابيع خلال التخدير إيسوفلوراني (انظر مسبار التسليم أدناه).
    4. تخدير الماوس باستخدام خليط هواء-إيسوفلوراني مادة (إيسوفلوراني 3%)، وضع الماوس على جدول قابل لتعديل في موقف الحق، والأفقي مع الورم (الغدد الثديية) قريبة من جهاز رنان لفائف السطحية.
    5. بعد وضع الماوس، إدارة التحقيق بحقن إينتراتيسوال (تكنولوجيا المعلومات) ولحن مطياف الجيش الشعبي الثوري، والحصول على الأطياف التي تكفي لمدة 5-10 دقائق.
    6. قياس 2-3 الأورام الثديية (من ممتف-الدفع + الفئران) أو حمل غير ورم الغدد الثديية (من الفئران PyMT−) خلال نفس الدورة الجيش الشعبي الثوري.
  2. نموذج الورم MET أورثوتوبيك-1
    1. تنمو خلايا سرطان الثدي مورين الخلفية Met-1 ففب/N في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% رطوبة نسبية في دميم التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 10 ميكروغرام/مل الأنسولين، رهيجف 5 نانوغرام/مل، و 1% PSA (البنسلين G الصوديوم وسلفات ستربتوميسين الامفوتريسين ب) إلى ~ التقاء 80% في قارورة T175.
    2. نضح وسائط الإعلام وشطف الخلايا ملتصقة مع 10 مل برنامج تلفزيوني (1.54 مم خ2ص4، 155 كلوريد الصوديوم، و 2.71 ملم نا2هبو4ح-72س دون كلوريد الكالسيوم أو كلوريد المغنيسيوم، الأس الهيدروجيني = 7.4).
    3. فصل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من محلول يدتا التربسين 0.25% وتعصف قارورة. عندما يتم فصل الخلايا، أضف 10 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS لقارورة وجمع الخلايا.
    4. الطرد المركزي من تعليق خلية في 132 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وريسوسبيند إلى 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر دميم ضئيل.
    5. استخدام حقنه الأنسولين (إبرة 29 1/2)، ببطء حقن 100 ميليلتر من تعليق خلية ورم في عدد 4 منصات الدهون الثديية من الفئران البرية نوع ففب/N أنثى عمرها 8 الأسبوع.
    6. رصد بدء الورم عن طريق الجس (يظهر بعد حوالي 2-3 أسابيع) والنمو (مرئي)، والماوس هيث (البصرية) كل يوم.
    7. قياس أبعاد الورم مرة واحدة في الأسبوع باستخدام الفرجار، وتحديد حجم الورم باستخدام المعادلة:
      Figure

3-التحقيق في التسليم للقياسات الوظيفية في فيفو

  1. استخدام مسبار المعلومات اللغوي الجسيمات (البروتوكول الأول) لقياسات2 بو في نماذج الورم أورثوتوبيك بزرع الخلايا السرطانية مع اللغوي-المعلومات المدخلة ميكروكريستالس كما سبق وصف14،21 والمفصلة أدناه.
    1. في حالة نموذج الورم MET-1، لاستيعاب المعلومات اللغوي ميكروكريستالس في خلايا MET-1، تعليق ميكروكريستالس المعلومات اللغوي في دميم بتركيز 20 ملغ/مل و sonicate مع سونيكاتور تحقيق في 20 كيلوهرتز استخدام 7 ث السلطة في أنبوب أسفل المائدة مستديرة 5 مل زجاج لمدة 5 دقائق على الجليد.
    2. إضافة 100 ميليلتر (2 مغ المعلومات اللغوي) من التعليق إلى قارورة T75 مع 10 مل ثقافة الوسائط التي تحتوي على خلايا MET-1 (حوالي 30% روافد). تتم جميع الإجراءات في خزانة السلامة الأحيائية ووسائط الإعلام يحتوي على البنسلين ووالستربتوميسين للتقليل من الإصابة المحتملة.
    3. الخلايا في 37 درجة مئوية ح 72، أو حتى تصل إلى احتضان ~ كونفلوينسي 80%.
    4. نضح وسائط الإعلام. تغسل الخلايا خمس مرات مع 10 مل برنامج تلفزيوني. فصل الخلايا مع 5 مل التربسين-يدتا. جمع الخلايا. أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.2.4. وصمة عار عينة خلايا ذات صبغة الاستبعاد لتحديد جدوى الخلية والكمية.
    5. تعليق الخلايا بتركيز 1 × 106 لكل 100 ميليلتر دميم ضئيل.
    6. باستخدام الحقن الأنسولين، ببطء حقن 100 ميليلتر من تعليق خلية تحتوي على ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات المدخلة في منصات الدهون الثديية رقم 4 من عمرها 8 الأسبوع الإناث الفئران البرية نوع ففب/N كما هو موضح في الخطوة 2.2.5.
    7. رصد بدء الورم والنمو كما هو موضح في الخطوات 2.2.6 و 2.2.7.
  2. استخدام الجسيمات التحقيق اللغوي-المعلومات (البروتوكول الثاني) أما عفوية أو نماذج أورثوتوبيك. حقن ميكروكريستالس اللغوي-OBu في الموقع للفائدة، مثلاً، في الغدد الثديية العادية أو الأورام الثديية، استخدام الحقن الأنسولين.
  3. المسابر القابلة للذوبان
    1. تخدير الفئران بالاستنشاق لأن خليط الهواء-إيسوفلوراني (التسليم 1.0 لتر في الدقيقة و 2-3% من إيسوفلوراني) باستخدام تخدير الجهاز ووضعها في فجوة مطياف الجيش الشعبي الثوري.
    2. لحن الصك، ثم حقن NR (10-30 ميليلتر، 10 ملم)، مسبار الأمل (10−30 ميليلتر، 0.5-2 مم) في المحلول الملحي أو الرقم الهيدروجيني 7.2 رسر التحقيق بحلول [دمس] (10 ميليلتر، 10 ملم) (تكنولوجيا المعلومات).

4-القياسات الوظيفية في فيفو

  1. للجيش الشعبي الثوري القياسات الطيفية، تخدير الفئران باستنشاق خليط الهواء-إيسوفلوراني باستخدام جهاز تخدير كما هو موضح في الخطوة 3.3.1.
  2. إجراء القياسات الوظيفية باستخدام مطياف المنتجين النطاق L (1.2 جيجاهرتز) كما يلي.
    1. ضع مرنان لفائف السطحية على غدة الثديية عادية أو الأورام الثديية ولحن والمطياف.
    2. الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري من المسبار مزروع جسيمات دقيقة 5−10 على مدى عدة أسابيع بعد زرع. في حالة المسابير القابلة للذوبان، الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري فورا بعد الحقن المسبار لمدة 5-10 دقائق.
    3. تحليل الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار NR للعثور على هايبرفيني تقسيم،N، وإشارة السعة، I(t). تحويل قيمةن إلى قيمة الرقم الهيدروجيني باستخدام منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.4. تحليل معدل انحلال السعة إشارة I(t) كالتغير النسبي من السعة الأولية، I(t = 0)، والمحسوبة في وحدات التعسفي في الثانية (s-1).
    4. احتواء الزيادة في عنصر مونوراديكال في طيف مسبار رسر المراعية للمدفع جريازيف إلى مونوكسبونينتس للحصول على وقت ثابت لحركية الأسية لحساب تركيز المدفع جريازيف الجيش الشعبي الثوري.
    5. تناسب الأطياف الجيش الشعبي الثوري عنصر الحقل السامي المسبار الأمل متعدد الوظائف لتلك التجريبية كما هو موضح في (الخطوة 1.4.5) تعطي قيم الأس الهيدروجيني، فس2 وبي.

5-إحصائية تحليل

  1. القيام بتجهيز البيانات والتحليلات الإحصائية. استخدام اختبار بيرسون الارتباط r (لمجموعات البيانات الموزعة عادة) و "مرتبة ترتيب الارتباط" في سبيرمان (لمجموعات البيانات بطبيعتها المرفوضة لتوزيع البيانات) لتحليل الارتباط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الأنسجة ف O 2 يسبر تقييم استخدام اللغوي-المعلومات:

باستخدام الإجراء الموضح في الخطوة 1، 1، نحن إجراء المعايرة لتعليق ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات الطازجة. ويبين الشكل 2 الاعتماد على الأوكسجين نموذجية من لينيويدث التحقيق اللغوي-المعلومات، فضلا عن به أطياف الجيش الشعبي الثوري مثال ذلك قياس في تعليق المخزن المؤقت وفي أنسجة الورم الثدي في الفئران C57Bl/6 الإناث زادت بعد بدء الورم بحقن الخلايا مع جزيئات المدخلة (الخطوة 3.1). يسمح استخدام معايرة لينيويدث لحساب قيمة2 فس الأنسجة (ما يعادل 7.5 ملم زئبق على الطيف، هو مبين في الشكل 2(ب)).

Figure 2
الشكل 2 . الجيش الشعبي الثوري الحساسية الطيفية المسبار المعلومات اللغوي الجسيمات للأكسجين. ويرد الاعتماد على الممثل من لينيويدث الطيف الجيش الشعبي الثوري لتعليق التحقيق اللغوي-المعلومات في دميم على ضغط الأكسجين الجزئي. طيف الجيش الشعبي الثوري (إدراج ) وتم قياس نسبة 0% من فس2، 37 درجة مئوية، ويمثل خط لورينتزيان نقي مع Δ لينيويدثحص = 113 ملغ. لينيويدث يزيد خطيا مع فس2 مع منحدر من 11.7 mG/مم زئبق. وتم قياس الطيف المبين في (إدراج ب) في أنسجة الأورام الثديية تخديره من الإناث C57Bl/6 فئران عرض Δحص = 204 ملغ، الذي يتوافق مع النسيج فس2 من 7.5 ملم زئبق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تقييم درجة الحموضة في "الأنسجة خارج الخلية" والمجسات "باستخدام الأكسدة" NR:

باستخدام الإجراء الموضح في الخطوة 1، 2، أجرينا معايرة مسبار درجة الحموضة والأكسدة والاختزال، NR. ويبين الشكل 3 هايبرفيني لاحظ تقسيم الاعتماد المستمر،ن، رقم جذرية على درجة الحموضة. وقد وصف منحنى معايرة قياسية مع pK الاعتماد على = 6.6 في 37 درجة مئوية. هذا الاعتماد منN(pH) بمثابة منحنى المعايرة للمقابلة في فيفو القياسات، مما يسمح لقياس درجة الحموضة في النطاق من 5.6 إلى 7.6، مع دقة 0.05 وحدات الأس الهيدروجيني.

Figure 3
الشكل 3 . الجيش الثوري الشعبي الحساسية الطيفية المسبار NR القابلة للذوبان للأستاذ النطاق L الجيش الشعبي الثوري الأطياف الحل مسبار NR اقتنيت في 37 درجة مئوية في درجة الحموضة المختلفة، والاعتماد على درجة الحموضة من هايبرفيني لاحظ تقسيم ثابت،ن، تم رسمها. خط متصل هو صالح البيانات التجريبية مع منحنى المعايرة القياسية، Equation 2 ، الغلة pK = 6.6،N(NR-ح+) = 14.24 ز، ونون(R) = 15.27 زاي إدراج: الطيف "الجيش الشعبي الثوري يتمثل" الحل 1 مم NR (pH 6.4) المكتسبة باستخدام إعدادات مطياف التالية: اكتساح المجال المغناطيسي، 80 ز؛ تعديل السعة، 2.5 G، شراء الوقت، 20 ثانية. هايبرفيني قياس تقسيم المستمر هو 14.63 زاي ريبرودوسيد من مرجع23 بإذن من جون وايلي وأولاده، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 تجسد القياسات الأس الهيدروجيني والأكسدة والاختزال في طراز ماوس ورم الثدي، يؤديها كما هو موضح تحت الخطوة 3.3 (حقن مسبار تكنولوجيا المعلومات) والقسم 4 (اقتناء الأطياف وتحليل الأطياف).

Figure 4
الشكل 4 . تقييم الجيش الشعبي الثوري للحد من قدرة الأنسجة في فيفو. إدراج: قياس الطيف المنتجين النطاق L المسبار NR في فيفو بعد حقن تكنولوجيا المعلومات (10 ميليلتر، 10 مم) في أنسجة الأورام الثديية تخديره من الفئران ففب/ن الإناث. تم العثور على هايبرفيني تقسيم،ن، لتكون مساوية ل 14.72 ز، الذي يتوافق مع قيمة الرقم الهيدروجينيه = 6.52 افتراض ورم الأنسجة درجة حرارة 34 درجة مئوية و pK = 6.6. يتم تقييم معدل التخفيض NR باتباع انحلال المكون وسط حقل الطيفي. قياس حركية يتجلى في الأورام الثديية (■) والغدد الثديية (س) تثبت قدرة الحد أعلى من الأنسجة الورم مقابل الغدة الثديية العادية. تحليل الجزء الأول من الحركية تعطي معدلات تخفيض إشارة الجيش الشعبي الثوري، كأحمر، في وسائل الإعلام خارج الخلية في الأنسجة ك 2.5 × 10-3/قفي ورم مقابل 0.5 × 10/ق-3في الغدة طبيعية. مستنسخة من مرجع11 بإذن من جون وايلي وأولاده، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويلخص الشكل 5 الأس الهيدروجينيه والأكسدة والاختزال قياسات أداء لمجموعة الفئران ففب/N ممتف-الدفع الإناث في الأورام والغدد الثديية العادية الداعمة وورم المكروية خارج الخلية الحمضية وعالية السعة مما يقلل.

Figure 5
الشكل 5 . في فيفو تقييم حموضة الأنسجة، والحد من قدرة الجيش الشعبي الثوري- نسيج خارج الخلية الأس الهيدروجيني (تملأ القضبان)، والتخفيض معدل القيم (أشرطة فارغة) من نيتروكسيدي NR في الغدد الثديية العادية والأورام الثديية من الإناث من الفئران ففب/N تقاس في فيفو الجيش الشعبي الثوري. أشرطة الخطأ الدلالة ذاتها ريبرودوسيد من مرجع11 بإذن من جون وايلي وأولاده، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

درجة الحموضة في "الأنسجة المتزامنة" ه ، الأكسدة والاختزال، و ف O 2 التقييم عن طريق الجمع بين المجلة والمسابير اللغوي-المعلومات:

المعلومات اللغوي الجسيمات هو المسبار الاختيار عند التخطيط لقياسات طولية متكررة فس2 القيم في نسيج محددة سلفا من مصلحة. ولسوء الحظ، قيداً رئيسيا من المسبار الجسيمات هو أنه فقط يسمح بالكشف عن الأوكسجين وأية معلمات المواد الكيميائية ذات الصلة بالناحية الفسيولوجية داخل TME، ولا تسمح بتصوير الأنسجة. وهكذا، يكون استخدام المسابير القابلة للذوبان في الجيش الثوري الشعبي ميزة التصوير والكشف عن معلمات TME متعددة ذات صلة بالناحية الفسيولوجية. وفي هذا الصدد، يمكن الجمع بين القياسات2 فس مزروع اللغوي-المعلومات الجسيمات باستخدام مع درجة الحموضة وظيفة مزدوجة والأكسدة NR التحقيق نظراً لعدم التداخل بين مكونات الحقل المنخفضة والعالية الطيفية من الطيف NR الجيش الشعبي الثوري مع خط الجيش الشعبي الثوري التحقيق اللغوي-المعلومات.

يبين الشكل 6 طائفة المنتجين نموذجي لاحظها المسبار NR فورا بعد الحقن تكنولوجيا المعلومات في نسيج الورم الثدي للإناث C57Bl/6 الفئران. يتم تراكب الطيف الملاحظ الثلاثي المسبار NR مع خط الجيش الشعبي الثوري واحد من ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات التي قد تم تضمينها داخل الورم (نمو الورم بدأت بحقن الخلايا مع جزيئات المدخلة كما هو موضح في الخطوة 3، 1. يتم حساب قيمة pH بقياس هايبرفينين تقسيم كمسافة بين مكونات الحقل المنخفضة والعالية واستخدام المعايرة هو مبين في الشكل 3 (تساوي 6.88) على الطيف هو موضح في الشكل 6. علما بأن يتم إجراء تقييم2 فس استناداً إلى قياسات لينيويدث إشارة المعلومات اللغوي قبل الحقن المسبار NR. انحلال إشارة تقرير وطني يوفر قيمة الأنسجة خفض القدرات كما هو موضح في الشكل 4.

Figure 6
الرقم 6 . يسبر التقييم TME متعدد الوظائف يجمع بين المعلومات اللغوي و NR. قياس الطيف الجيش الشعبي الثوري في فيفو في الثدي ورم الأنسجة من الإناث C57Bl/6 الماوس فورا بعد الحقن تكنولوجيا المعلومات من مسبار NR. يتم فرضه الطيف الثلاثي الملاحظة رقم مع خط الجيش الشعبي الثوري واحد من المسابر اللغوي-المعلومات المضمنة داخل الورم. قيمة الرقم الهيدروجيني محسوبة من انقسام بين مكونات الحقل المنخفضة والعالية من 6.88. انحلال إشارة تقرير وطني يوفر قيمة الحد من قدرة الأنسجة. ف O هو إجراء تقييم2 استناداً إلى قياسات لينيويدث من اللغوي-المعلومات قبل الحقن المسبار NR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في فيفو التقييم للمدفع جريازيف داخل الخلايا:

رد فعل تبادل ثنائي كبريتيد ثيول بين مسبار رسر والمدفع جريازيف انشقاقات بوند ثنائي كبريتيد المسبار مما أدى إلى تشكيل مونوراديكالس اثنين22 والإلغاء لتبادل إينتراموليكولار تدور بين شظايا مونوراديكال. يوضح الشكل 7A أثر رد فعل التحقيق رسر مع المدفع جريازيف على الأطياف المنتجين مما أدى إلى اختفاء المكونات الطيفية "بيراديكال" والزيادة المقابلة لكثافة مكونات مونوراديكال. ثابت لوحظ معدل رد الفعل بين المدفع جريازيف ورسر: كobs = 2.8 ± 0.2 M-1ق-1 (T = 34 درجة مئوية، الرقم الهيدروجيني 7.2)11. 7B الشكل تجسد حركية بتغيير كثافة الطيفي الذروة مونوراديكال تقاس بالأورام الثديية (●) والغدة الثديية العادية (س) باستخدام النطاق L الجيش الشعبي الثوري. خطوط صلبة هي نوبات الجزء الأولى من الحركية من مونوكسبونينت استخدام كobs = 2.8 M s-1-1 ، وتسفر عن [المدفع جريازيف] = 10.7 و 3.3 ملم للورم والغدة الثديية العادية، على التوالي.

Figure 7
الشكل 7 . في فيفو الجيش الشعبي الثوري تقييم تركيزات الأنسجة داخل الخلايا الجلوتاثيون. (أ) X-الفرقة الجيش الشعبي الثوري الأطياف من 100 ميكرومتر رسر تقاس في نقاط زمنية مختلفة بعد الحضانة مع 2.5 ملم المدفع جريازيف في 0.1 م نا-الفوسفات المخزن المؤقت pH 7.2 و 1 مم دتبا في 34 درجة مئوية. يوفر تحليل حركية لوحظ معدل القيمة الثابتة لرد فعل بين المدفع جريازيف ورسر، كobs (pH 7.2، 34 درجة مئوية) = (2.8 ± 0.2) M s-1 -1. (ب) حركية تغير كثافة الطيفي الذروة مونوراديكال تقاس بالنطاق L الجيش الشعبي الثوري في الأورام الثديية (●) والغدة الثديية العادية (س) من الفئران ففب/N مباشرة بعد حقن تكنولوجيا المعلومات من رسر التحقيق (راجع الخطوة 3.3.2). خطوط صلبة هي نوبات الجزء الأولى من الحركية من مونوكسبونينت، لنفترض كobs (pH 7.2، 34 درجة مئوية) = 2.8 M s-1-1 ، وتسفر عن [المدفع جريازيف] = 10.7 و 3.3 ملم للورم والغدة الثديية العادية، على التوالي. مستنسخة من مرجع11 بإذن من جون وايلي وأولاده، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم الهيدروجيني "التقييم متعدد الوظائف للنسيج خارج الخلية"، ف O 2 ، وبي باستخدام مسبار الأمل متعددة الوظائف:

ويوضح الشكل 8 حساسية المعلمات الطيفية للمجس الأمل في الحصول عليها باستخدام معايرة الإجراءات الموضحة تحت الفرع 1-4.

Figure 8
الشكل 8 . تقييم متعدد الوظائف المكروية الكيميائية باستخدام مسبار الأمل- () مخطط التوازن يعتمد على درجة الحموضة بين دولتين التأين للتحقيق. (ب) الجيش الشعبي الثوري في النطاق L طيف الأمل. (ج) "الجيش الشعبي الثوري" لينيويدث للأمل علامة2 فس (الدقة، ≈ 1 مم زئبق؛ ف س2 النطاق، 1-100 ملم زئبق). (د) جزء صغير البروتونية الأمل علامة الرقم الهيدروجيني في النطاق من 6 إلى 8.0 (الدقة، ± 0.05). (ﻫ) اعتماد سعر الصرف بروتون (معبراً عنها بملغ) من الأمل مع تركيز الفوسفات غير العضوية (Pi) المستخرجة بواسطة أطياف المحاكاة (الدقة، ± 0.1 ملم، النطاق، 0.1-20 ملم) 12،18. مستنسخة من مرجع8 بإذن من مجموعة الطبيعة للنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويوضح الشكل 9 قياسات متعددة الوظائف يؤديها في الغدد الثديية البرية نوع ففب/ن وفي الفئران المعدلة وراثيا TME MMTV-الدفع، عفويا الإصابة بسرطان الثدي وتحاكي الإنسان ورم التدريج20. دعم قيم يعني فس2 (50 ± 3 مم زئبق في TME مقابل 58 ± 3 زئبقي في أنسجة طبيعية) والأس الهيدروجينيه (6.99 ± 0.03 في TME مقابل 7.1 ± 0.03 في أنسجة طبيعية) مظهر مناطق التاكسج والحمضية في الورم. ولوحظت التغييرات الأكثر دراماتيكية في تركيز بي الخلالي (± 1.8 0.2 مم في TME مقابل 0.84 ± 0.07 ملم في أنسجة طبيعية) التي تشير إلى دور محتمل لتركيز Pi المتداخلة كعلامة TME تطور الورم. القياسات الفردية تظهر اختلافات كبيرة حول القيم الوسطية. ميزة هامة لمجس متعدد الوظائف أن جميع المعلمات يتم قياس باستخدام مجس واحد، وبالتالي السماح لتحليل الارتباط مستقلة للتحقيق في التوزيع والوقت من القياسات كما هو موضح في الشكل 9b- ه. يدعم الارتباط الإيجابي الملحوظ بين فس2 والاس الهيدروجينيه في الغدة الثديية العادية مقابل عدم وجود ترابط في أورام ورم الاعتماد على تحلل مستقلة عن تركيز الأكسجين؛ وهذا في رأينا مظاهرة المتمثلة في فيفو أثر واربورغ. بدوره، لوحظ الارتباط السلبي بين خلالي [بي] و فس2 كلا في أنسجة طبيعية والورم الاتفاق مع رابطة عالية [بي] (وانخفاض نسبة ATP/Pi) مع التغييرات في حالة الاستقلاب عند انخفاض الأكسجين الإمداد.

Figure 9
الرقم 9 . في فيفو الأنسجة ف O 2 ، درجة الحموضة ه ، وتقييم بي باستخدام مسبار الأمل والجيش الثوري الشعبي- () صورة فوتوغرافية للإعداد للقياسات الجيش الشعبي الثوري في فيفو النطاق L يظهر الماوس أنيسثيتيزيد بين مغناطيس مطياف الجيش الشعبي الثوري، مع إدراج على الحق في عرض التوظيف وتحديد المواقع لجهاز رنان حلقة أعلى الأنسجة المقاسة. ملاحظة التعريب خارج الخلية فراغي المسبار الأمل: لم تخترق الخلايا بسبب هياكل مشحونة ضخمة، ولم يتم الكشف عن إشارة أمل من الدم من الجيش الثوري الشعبي بسبب إشارة توسيع طريق complexation الأمل مع ألبومين البلازما24 . (ب–ه) الارتباط بين بو الخلالي2والرقم الهيدروجينيهوالقيم Pi مقاسة بالغدد الثديية العادية من الفئران البرية نوع ففب/N TME سرطان الثدي في الفئران المعدلة وراثيا MMTV الدفع (n = 23). لتوسيع نطاق الاختلافات الأكسجين، وضعت شروط وصول في الفضاء فراغي حقن تكنولوجيا المعلومات من نظام الانزيمية المستهلكة للأكسجين الجلوكوز/الجلوكوز أوكسيديز (رموز حمراء). وتمثل الخطوط الزرقاء نوبة خطي لمجموعات البيانات الإجمالية. (ب) علاقة إيجابية بين فس2 والرقم الهيدروجينيه في أنسجة طبيعية (r = 0.5، ف = 0.014 للأسود الرموز؛ والبحث والتطوير = 0.64، ف = 1.8 × 10-4 لمجموعة البيانات الإجمالية) مقابل (ج) لا كبيرة الارتباط بين فس2 والاس الهيدروجينيه في TME (r = 0.01، ف = 0.97 للأسود الرموز؛ والبحث والتطوير = 0.23، ف = 0.3 لمجموعة البيانات الإجمالية) تم العثور على. (د) سلبية متبادلة بين فس2 وبي على حد سواء في أنسجة طبيعية (r = −0.51، ف = 0.013 للأسود الرموز؛ والبحث والتطوير = −0.7، ف = 2.3 × 10-5 لمجموعة البيانات الإجمالية) و (ه) في TME (ب، أسفل: r = −0.4، p = 0.079 لرموز سوداء؛ r = −0.62، p = 0.001 لمجموعة البيانات الإجمالية) تم العثور على. مقتبس من مرجع8 مع إذن مع طبيعة فريق النشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تسمح أساليب عرض موسع في فيفو التقييم للمعلمات حرجة من TME الكيميائية، أي فس2، ودرجة الحموضة، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات بي الخلالي والمدفع جريازيف داخل الخلايا. تقنيات الرنين المغناطيسي، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ومنخفضة-ميدان الجيش الشعبي الثوري، هي أساليب الاختيار موسع في فيفو التنميط هذه المعلمات TME. التصوير بالرنين المغناطيسي يتصور الهياكل التشريحية ولكنها تفتقر إلى الحساسية الفنية. وعلى النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي، توفر تقنيات الجيش الشعبي الثوري الحساسية الوظيفية لمعلمات المكروية عندما تستخدم بالاقتران مع تحقيقات تدور الفنية المحلية. على حد علمنا، هناك لا أساليب أخرى متاحة لتقييم في فيفو الناحية الفسيولوجية الكيميائية TME المعالم الهامة في المواضيع المعيشية، مثل فس2، الرقم الهيدروجينيهوبي، والأكسدة والاختزال والمدفع جريازيف في نفس الوقت.

البروتوكولات وصف تستند إلى استخدام حقل منخفض النطاق L الجيش الشعبي الثوري، والمصممة خصيصا المسابير باراماجنيتيك. ويمكن اعتبار مجموعة من المجسات الأربعة المعروضة في الشكل 1 فعالية في فيفو TME تقييم مقايسة. توافر التحقيقات شرط أساسي هام للقياسات الجيش الشعبي الثوري الموصوفة في فيفو . توليف المسابير وفقا لإجراءات نشر11،12،،من1315 يتطلب خبرة في الكيمياء العضوية التركيبية، وقد تصبح خطوة حاسمة لتنفيذ أسلوب .

ويتيح تطبيق المسبار الجسيمات القياسات المتكررة من الأنسجة فس2 لتصل إلى أسابيع بعد زرع14،21. إبداء حساسية لعدد موسع من المعلمات يتجاوز تركيز الأكسجين25 المسابير القابلة للذوبان وإتاحة فرصة للقياسات المكانية وتصميما26. على وجه الخصوص، تطبيق المسبار الأمل متعدد الوظائف فرصة غير مسبوقة في فيفو القياسات المتزامنة للأس الهيدروجيني و فس2Pi في الفضاء خارج الخلية. قياسات المعلمات الثلاث باستخدام مجس واحد يسمح لتحليلاتها علاقة مستقلة عن توزيع المسبار والوقت ل القياسات8.

لا يمكن استخدام التحقيقات في وقت واحد، باستثناء التحقيق اللغوي-المعلومات مزروع الجسيمات، التي يمكن استخدامها بالاقتران مع أي من تحقيقات للذوبان كما هو موضح في الشكل 6. ولذلك، ينبغي أن يستند التصميم التجريبي قياسات منفصلة لحقن الفردية من المسابر القابلة للذوبان وظيفية محددة. سواء عن طريق تكنولوجيا الحقن11،،من1426 يمكن تسليمها بماء الأس الهيدروجيني خارج الخلية ومسبار الأكسدة NR والتسليم الجهازية27، بينما اثنين المجسات الأخرى القابلة للذوبان، رسر والأمل، وتسمح لإيصال تكنولوجيا المعلومات فقط 8 , 11 , 12 , 16-علما بأن يسبر بالتعديلات الهيكلية المستقبلية رسر والأمل قد التغلب على الحد الأخير لإنجاز التحقيق بوضع النظير مسبار ماء أكثر وأقل سمية لإيصال الجهازية25.

ملاحظة هذه الطريقة الطيفية في الجيش الثوري الشعبي يوفر متوسط قيم المعلمات قياس TME، التي غالباً ما تتسم به للتغايرية عالية. وهذا يخفي الاختلافات المحتملة بين المعلمات جزئيا أو يقلل من أهمية في تحليل الارتباط. يسمح استخدام المسابير الموصوفة في التصوير طرائق للحصول على المعلومات الفنية حل مكانياً26. ونحن نعتقد أن مستقبل التصوير متعدد الوظائف بالجيش الشعبي الثوري يعتمد على مواصلة تطوير المنهجيات الجديدة نسبيا مثل تصوير الجيش الشعبي الثوري المسح السريع ومحسن أوفرهوزر الرنين المغناطيسي (عمري، كما وصف صور مزدوجة-الرنين إلكترون بروتون، بدري). تحقيقات الجيش الشعبي الثوري اتجاهات جديدة في تطوير وظيفي وتقنيات التصوير المتقدمة قد نوقشت مؤخرا في المقابلة ميزة المادة25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها جزئيا في المعاهد الوطنية للصحة منح CA194013 و CA192064 و U54GM104942. من المسلم به وفكتسي لبدء ففك، AB، و TDE. يشكر المؤلفون جينشيفا م. د. و. ك. شتاينبرجر للمساعدة مع تجارب توضيحية. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-band EPR spectrometer Magnettech, Germany L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller  Noxygen, Germany Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
Sonicator Fisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced) Sigma-Aldrich G4251
MMTV-PyMT  mice In house
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Met-1 murine breast cancer cells In house
C57Bl/6 wild type mice  Jackson Laboratory
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypan Blue Exclusion Dye  Thermo Fisher Scientific T10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo) Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic sigma-Aldrich S07051
Sodium Chloride sigma-Aldrich S7653
Hydrochloric acid sigma-Aldrich 320331
Sodium Hydroxide sigma-Aldrich S8045
Glucose sigma-Aldrich
Glucose oxydase sigma-Aldrich
Lauda Circulator E100 Lauda-Brikmann
pH meter Orion Thermo Scientific 
LiNc-BuO probe In house The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probe In house The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probe In house The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probe In house The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siemann, D. W. Tumor Microenvironment. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Hicks, R. Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. Practical NMR spectroscopy. , Heyden. (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Tags

أبحاث السرطان، مسألة 133، الإلكترون الرنين باراماجنيتيك، نيتروكسيدي، ترتيل جذرية، الأس الهيدروجيني، تركيز الأكسجين، حالة الأكسدة والاختزال، الجلوتاثيون، الفوسفات غير العضوي، وورم المكروية
<em>في فيفو</em> تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، <em>ف</em>س<sub>2</sub>، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bobko, A. A., Eubank, T. D.,… More

Bobko, A. A., Eubank, T. D., Driesschaert, B., Khramtsov, V. V. In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (133), e56624, doi:10.3791/56624 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter