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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Vivo में पीएच के EPR आकलन, पीओ2, Redox स्थिति, और ट्यूमर में फॉस्फेट और Glutathione की सांद्रता Microenvironment

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56624
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Summary

कम क्षेत्र (एल बैंड, 1.2 GHz) इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद घुलनशील nitroxyl और trityl जांच का उपयोग ट्यूमर microenvironment में स्तन कैंसर के माउस मॉडल में शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण मापदंडों के आकलन के लिए प्रदर्शन किया है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल कम क्षेत्र इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) की क्षमता को दर्शाता है कार्यात्मक paramagnetic जांच के साथ संयोजन में तकनीक आधारित रासायनिक ट्यूमर microenvironment (टीएमई), पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान सहित प ओ2, पीएच, redox स्थिति, मध्य अकार्बनिक फॉस्फेट (Pi) की सांद्रता, और intracellular glutathione (GSH) । विशेष रूप से, एक हाल ही में विकसित घुलनशील बहुआयामी trityl जांच के एक आवेदन vivo समवर्ती माप पीएच, पीओ2 और पीi में ई में के लिए नायाब अवसर प्रदान करता है xtracellular space (आशा जांच) । तीन मापदंडों की माप एक जांच का उपयोग कर अपने सहसंबंध जांच वितरण और माप के समय के स्वतंत्र विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।

Introduction

कैंसर में प्रगति और चिकित्सा में टीएमई की एक महत्वपूर्ण भूमिका तेजी से1की सराहना की है । ठोस ट्यूमर में टीएमई के महत्वपूर्ण शारीरिक मापदंडों के अलावा, ऊतक हाइपोक्सिया2, दाखवते3,4, उच्च कम करने की क्षमता5, ऊंचा सांद्रता के intracellular GSH6,7, और मध्य Pi8 अच्छी तरह से प्रलेखित हैं । vivo pO2, पीएच, Pi, GSH, और redox आकलन में इनवेसिव टीएमई में जैविक प्रक्रियाओं में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, और विरोधी कैंसर दवाओं और टीएमई-लक्षित चिकित्सकीय रणनीतियों के पूर्व नैदानिक स्क्रीनिंग के लिए अग्रिम उपकरणों में मदद । चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और कम क्षेत्र EPR आधारित तकनीक द्वारा ऊतकों में एक उचित रेडियोफ्रीक्वेंसी पैठ गहराई उन्हें इन टीएमई मापदंडों के गैर इनवेसिव आकलन के लिए सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण बनाता है । एमआरआई इमेजिंग पानी प्रोटान पर काफी हद तक निर्भर करता है और व्यापक रूप से संरचनात्मक समाधान प्रदान करने के लिए नैदानिक सेटिंग्स में प्रयोग किया जाता है, लेकिन कार्यात्मक संकल्प का अभाव है । फास्फोरस 31 परमाणु चुंबकीय अनुनाद (31P-एनएमआर) extracellular Pi एकाग्रता और पीएच अंतर्जात फॉस्फेट से एक संकेत के आधार पर की माप टीएमई लक्षण वर्णन के लिए संभावित रूप से आकर्षक हैं, लेकिन आम तौर पर कई बार से नकाबपोश हैं उच्च intracellular Pi सांद्रता9,10. इस के विपरीत, EPR माप कार्यात्मक संकल्प प्रदान करने के लिए विशेष रूप से डिजाइन paramagnetic जांच की स्पेक्ट्रोस्कोपी और इमेजिंग पर भरोसा करते हैं । ध्यान दें कि exogenous EPR जांच EPR के बहुत अधिक आंतरिक संवेदनशीलता और अंतर्जात पृष्ठभूमि EPR संकेतों के अभाव के कारण exogenous एनएमआर जांच पर एक फायदा है । एक दोहरी समारोह पीएच और redox nitroxyl जांच11 और बहुआयामी trityl जांच12 के हाल के विकास के कई टीएमई मानकों के vivo समवर्ती माप में के लिए नायाब अवसर प्रदान करता है और उनके सहसंबंध जांच वितरण और माप के समय पर स्वतंत्र विश्लेषण । हमारे ज्ञान के लिए, वहां कोई अंय तरीकों को समवर्ती vivo में शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण रासायनिक टीएमई मानकों पीओ2, पीएचई, Pi, redox, और GSH के रूप में रहने वाले विषयों में मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध हैं ।

के लिए जांच Vivo में कार्यात्मक माप:

चित्रा 1 टीएमई मापदंडों का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया paramagnetic जांच के रासायनिक संरचनाओं से पता चलता है, जो कण और घुलनशील जांच शामिल हैं । उच्च कार्यात्मक संवेदनशीलता, ऊतक रहने में स्थिरता, और ंयूनतम विषाक्तता कुछ लाभ है कि कण जांच करने के लिए vivo EPR oximetry में घुलनशील जांच पर पसंद कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, कण जांच में घुलनशील जांच की तुलना में ऊतक प्रत्यारोपण की साइट पर प्रतिधारण बार वृद्धि हुई है ऊतक पीओ2 के अनुदैर्ध्य माप के लिए कई हफ्तों से अधिक की अनुमति । दूसरी ओर, घुलनशील जांच को मात EPR आधारित इमेजिंग तकनीकों का उपयोग कर स्थानिक हल माप के रूप में अच्छी तरह से कई कार्यक्षमताओं से सहवर्ती विश्लेषण की अनुमति (पीओ2, पीएच, Pi, redox, और GSH) ।

Figure 1
चित्र 1। paramagnetic जांच की रासायनिक संरचनाओं कि टीएमई मूल्यांकन परख इकट्ठा । इस कण पीओ2 जांच, LiNc-BuO (आर =-o (ch2)3ch3), और घुलनशील जांच शामिल हैं: दोहरी समारोह पीएच और redox जांच, NR; GSH-संवेदी जांच, RSSR; और extracellular microenvironment के कार्यात्मक पीओ2, पीएच, और Pi जांच, आशा जांच। इन जांचों के संश्लेषण में बताए गए सन्दर्भ 11,12का वर्णन किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

सभी पशु कार्य WVU IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था ।

1. जांच संश्लेषण और अंशांकन

  1. कण पीओ2-संवेदनशील LiNc-BuO जांच
    नोट: LiNc-BuO microcrystals को संश्लेषित और तैयार किया जाता है जैसा कि संदर्भ13में वर्णित है । वे बहुत स्थिर है और साल के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है । LiNc-BuO कण जांच के EPR linewidth एक pO2-संवेदी पैरामीटर है । LiNc-BuO microcrystals anoxic शर्तों से रेंज में ऑक्सीजन एकाग्रता पर linewidth के आदर्श रैखिक निर्भरता का प्रदर्शन करने के लिए 760 mmHg के पीओ2 आंशिक दबाव13, अभाव में आंतरिक linewidth के मूल्यों के साथ ऑक्सीजन और ऑक्सीजन निर्भरता की ढलान (मिलीग्राम/mmHg में मापा) थोड़ा microcrystal तैयारी के विभिंन बैचों के लिए अलग । इसलिए, अंशांकन हर विशेष बैच के लिए आवश्यक है ।
    1. वजन 60 मिलीग्राम LiNc-BuO microcrystals.
    2. ऑक्सीजन संवेदनशीलता अंशांकन के लिए, Dulbecco के संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) मध्यम के 3 मिलीलीटर में microcrystals निलंबित (20 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में) और 20 पर एक जांच sonicator के साथ बर्फ पर 5 मिनट के लिए sonicate एक 5 मिलीलीटर गिलास दौर-नीचे ट्यूब में 7 डब्ल्यू शक्ति का उपयोग kHz ।
    3. एक ग्लास ट्यूब में sonicated microcrystals की सतह कुंडल प्रतिध्वनित में एल-बैंड की 1 मिलीलीटर प्लेस (1.2 GHz) EPR स्पेक्ट्रोमीटर और प्राप्त सतत तरंगों (CW) EPR स्पेक्ट्रा के शारीरिक तापमान पर 37 डिग्री सेल्सियस और ऑक्सीजन सांद्रता की 0, 1, 2, 4, 8 , और २०.९% । एक गैस नियंत्रक से दिया गैस मिश्रण के साथ समाधान bubbling द्वारा ऑक्सीजन एकाग्रता बनाए रखने और एक पानी एक थर्मोस्टेट से जुड़ी स्नान का उपयोग कर तापमान बनाए रखने के । निम्नलिखित EPR स्पेक्ट्रोमीटर अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग करें: मॉडुलन आयाम, 100 मिलीग्राम; मॉडुलन आवृत्ति, 100 kHz; स्वीप चौड़ाई, 5 जी; स्वीप टाइम, 60 एस.
    4. एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) को प्राप्त करने के लिए, linewidth के 60% का एक मॉडुलन आयाम मूल्य का उपयोग करें (उदा., 1 जी के linewidth के लिए एक मॉडुलन आयाम 0.6 जी का उपयोग करें) ।
    5. वैकल्पिक सरलीकृत अंशांकन प्रक्रिया: EPR स्पेक्ट्रा हवा में रिकॉर्ड बुलबुला और anoxic समाधान14. उत्तरार्द्ध मामले में, 10 मिमी ग्लूकोज के अलावा द्वारा नमूनों में anoxia बनाए रखने और 100 यू/एमएल ग्लूकोज oxidase संदर्भ के लिए 1 मिलीलीटर जांच समाधान के अनुसार14।
    6. EPR स्पेक्ट्रा लाइन चौड़ाई, LW को ढूँढने के लिए Lorentzian फ़ंक्शन के साथ फ़िट करें । पीओ2पर LW की निर्भरता के एक ढाल के रूप में पीओ2 के लिए microcrystals की संवेदनशीलता का मूल्यांकन, अर्थात् एक मान के रूप में (LWair− LWanoxia)/पीओ2air, जहां LWहवा और LWanoxia क्रमशः वायु और anoxia दशाओं में स्पेक्ट्रा linewidth हैं; प हे2air = १५२ mmHg.
  2. दोहरी समारोह पीएच और redox जांच, NR
    नोट: NR जांच संदर्भ11में वर्णित के रूप में संश्लेषित है । यह कमरे के तापमान पर स्थिर है दोनों के रूप में एक ठोस और जलीय समाधान में । संश्लेषित NR जांच 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है । नाइट्रोजन hyperfine बंटवारे, एकN, और संकेत आयाम क्षय दर NR जांच के वर्णक्रमीय मापदंडों कि पीएच के प्रति संवेदनशील होते हैं (जांच पीकेएक = 6.6 37 डिग्री सेल्सियस पर, पीएच संवेदनशीलता की सीमा 5.6 से 7.6) और कम करने की क्षमता के लिए जांच की microenvironment, क्रमशः ।
    1. NR फ्रीजर से निकालें और कंटेनर कमरे के तापमान (10-15 मिनट) को गर्म करने के लिए अनुमति दें । बाहर ६.३४ मिलीग्राम का वजन NR, खारा समाधान के 1 मिलीलीटर में इसे भंग, और एक पीएच मीटर का उपयोग कर एचसीएल या NaOH के छोटे aliquots के साथ पीएच 7.2 को समायोजित करें । एक स्टॉक समाधान के रूप में तैयार NR समाधान (10 मिमी) का उपयोग करें ।
    2. इस प्रकार के रूप में NR जांच के पीएच अंशांकन निष्पादित करें (संदर्भ11देखें) । सबसे पहले, 2 मिमी Na-फास्फेट बफर, 150 मिमी NaCl के 0.9 मिलीलीटर के लिए NR स्टॉक समाधान के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें । अनुमापन एक पीएच मीटर का उपयोग कर आवश्यक पीएच के लिए एचसीएल या NaOH के aliquots के साथ प्राप्त 1 मिमी NR समाधान. एक पानी एक थर्मोस्टेट से जुड़ी स्नान का उपयोग कर तापमान नियंत्रण ।
    3. एल बैंड EPR स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर 1.5-एमएल microcentrifuge ट्यूबों में नमूनों की EPR स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड । निम्नलिखित EPR स्पेक्ट्रोमीटर अधिग्रहण पैरामीटर का प्रयोग करें: मॉडुलन आयाम, 2.5 G; मॉडुलन आवृत्ति, 100 kHz; झाडू चौड़ाई, 60 ग्राम; स्वीप टाइम, 20 एस.
    4. EPR स्पेक्ट्रा के कम और उच्च क्षेत्र के घटकों के बीच की दूरी के रूप में hyperfine बंटवारे स्थिरांक (एN) को मापने, पीएच के एल बैंड EPR माप के लिए अंशांकन वक्र प्रदान करने के लिए ।
  3. GSH-संवेदी RSSR जांच
    नोट: RSSR जांच संदर्भ15में वर्णित के रूप में संश्लेषित है । 4 डिग्री सेल्सियस पर संश्लेषित NR जांच की दुकान. lipophilic RSSR डाइसल्फ़ाइड biradical यौगिक आसानी से सेल झिल्ली भर में फैलाना intracellular GSH के साथ प्रतिक्रिया और GSH का उपयोग vivo में EPR16,17का निर्धारण करने के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । इस विधि RSSR जांच के साथ GSH thiols के प्रमुख intracellular पूल के उच्च प्रतिक्रिया दरों पर आधारित है । GSH के साथ RSSR biradical की प्रतिक्रिया अपने डाइसल्फ़ाइड बांड विभाजन ( योजना 1देखें) दो कट्टरपंथी टुकड़े के बीच स्पिन विनिमय के रद्द करने में जिसके परिणामस्वरूप और biradical वर्णक्रमीय घटकों और इसी की कमी में प्रकट monoradical घटकों की वृद्धि । biradical RSSR जांच के लिए, monoradical घटक के आयाम की वृद्धि की दर GSH एकाग्रता के लिए आनुपातिक है और एक सुविधाजनक GSH-संवेदी EPR वर्णक्रमीय पैरामीटर है । vivo EPR माप में से GSH एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए, इसी तापमान और पीएच पर GSH के साथ RSSR प्रतिक्रिया की दर के पूर्ववर्ती अंशांकन निम्नानुसार प्रदर्शन किया जाना है ।
    1. फ्रीजर से RSSR निकालें और कंटेनर कमरे के तापमान (10-15 मिनट) को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं । के बाहर 4.05 मिलीग्राम का वजन NR और DMSO समाधान के 1 मिलीलीटर में इसे भंग । एक स्टॉक समाधान के रूप में तैयार RSSR समाधान (10 मिमी) का उपयोग करें ।
    2. दर के मूल्य का निर्धारण लगातार, kobs, वांछनीय तापमान और पीएच पर GSH के साथ RSSR की प्रतिक्रिया के रूप में इस प्रकार है ।
    3. सबसे पहले, RSSR शेयर समाधान के 20 µ एल जोड़ें (10 मिमी) 1 मिमी Na-फास्फेट बफर, पीएच 7.2, 150 mm NaCl के ०.९८ मिलीलीटर, एक 0.2 mm RSSR जांच समाधान प्राप्त करने के लिए ।
    4. 1, 2 के समाधान तैयार है, और GSH के 5 मिमी सांद्रता 0.1 M एनए-फॉस्फेट बफर में पीएच 7.2 में । सही vivo माप में से लक्षित अंग की कोशिकाओं में GSH एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए, इन विट्रो अंशांकन intracellular पीएच के मूल्य के पास एक पीएच पर किया जा करने के लिए है ।
    5. बराबर मात्रा में 0.2 mM RSSR समाधान और चरण 1.3.4 में तैयार GSH समाधानों में से एक को मिलाएं । 0.1 mm पर जांच के अंतिम एकाग्रता के लिए और GSH के 0.5, 1, या 2.5 मिमी ।
    6. RSSR और GSH घोल मिश्रण के तुरंत बाद, नमूना EPR प्रतिध्वनित में जगह और EPR स्पेक्ट्रा हर 12 सेकंड के लिए 10 मिनट के लिए रिकॉर्ड है । फिर monoradical वर्णक्रमीय आयाम की वृद्धि की कैनेटीक्स की गणना । निम्नलिखित EPR स्पेक्ट्रोमीटर अधिग्रहण पैरामीटर का प्रयोग करें: मॉडुलन आयाम, 1 जी; मॉडुलन आवृत्ति, 100 kHz; झाडू चौड़ाई, 60 ग्राम; स्वीप टाइम, 10-60 एस.
    7. monoexponents करने के लिए मापा EPR कैनेटीक्स फिट और घातांक कैनेटीक्स, τ के समय स्थिरांक की गणना करें । रैखिक प्रतिगमन (1/τ = kobs × [GSH]) GSH और RSSR के बीच प्रतिक्रिया का स्वीकार्य दर स्थिर मान प्रदान करता है (उदा., 34 ° c और pH 7.2, kobs = 2.8 ± 0.2 M-1s-1)11.
  4. पीओ2, पीएच, और Pi आकलन के लिए बहुआयामी आशा जांच
    नोट: monophosphonated trityl आशा जांच संदर्भ में वर्णित के रूप में संश्लेषित है12 और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा है । ph < < pka (a-अंल form) और ph > > pka (B-मूल प्रपत्र) में आशा की CW EPR स्पेक्ट्रा को फास्फोरस hyperfine विभाजन के कारण दोहरी द्वारा दर्शाया जाता है, एकपृ. विशिष्ट साधन सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: मॉडुलन आयाम, 37.5 मिलीग्राम; मॉडुलन आवृत्ति, 100 kHz; स्वीप चौड़ाई, 0.9 ग्राम; स्वीप टाइम, 20-60 एस. मध्यवर्ती पीएच (5 < ph < 8) में आशा जांच की EPR स्पेक्ट्रम एक चौकड़ी की विशेषता है जब दोनों a और B राज्य मौजूद हैं । आशा की वैयक्तिक EPR linewidth एक पृO2 मार्कर (शुद्धता, ≈ 1 mmHg; प हे२ रेंज, 1-100 mmHg). protonated आशा (एक फार्म) के अंश 6 से 8.0 (सटीकता, ± 0.05) की सीमा में एक पीएच मार्कर है । प्रोटॉन विनिमय दर का मूल्य (mG में व्यक्त) स्पेक्ट्रा सिमुलेशन द्वारा निकाली गई pi के साथ एक pi मार्कर (सटीकता, ± 0.1 mm, रेंज, 0.1-20 मिमी) है । अंशांकन प्रक्रियाओं शारीरिक तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं (37 डिग्री सेल्सियस), समाधान ईओण ताकत (NaCl, 150 मिमी), और 0.2 mm की आशा जांच एकाग्रता, पहले संदर्भ में वर्णित के रूप में12,18, और नीचे विस्तृत.
    1. फ्रीजर से आशा जांच निकालें और कंटेनर कमरे के तापमान (10-15 मिनट) को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. बाहर वजन 10.7 मिलीग्राम आशा जांच की, यह खारा समाधान के 1 मिलीलीटर में भंग, और 7.4 करने के लिए पीएच समायोजित करें । एक 0.2 mm आशा जांच समाधान प्राप्त करने के लिए खारा समाधान के ०.९८ मिलीलीटर के लिए आशा (10 मिमी) के तैयार स्टॉक समाधान के 20 µ एल जोड़ें ।
    3. पीएच की जांच अंशांकन के लिए, अनुमापन NaOH या एचसीएल की एक छोटी मात्रा के अलावा द्वारा आशा जांच समाधान के 0.2 mM, नमूना कम से 1% के अंतिम कमजोर पड़ने के साथ । एक पीएच इलेक्ट्रोड के साथ पीएच उपाय 37 डिग्री सेल्सियस पर तुले संदर्भ समाधान के लिए पीएच मान का उपयोग कर राष्ट्रीय मानक ब्यूरो (यू. एस.) द्वारा अनुशंसित । ध्यान से पीएच माप के दौरान संदर्भ और titrated समाधान के तापमान को बनाए रखने के लिए एक परिसंचारी से जुड़ी एक जैकेट प्रतिक्रिया चोंच का प्रयोग करें । जांच समाधान के लिए 10 मिमी ग्लूकोज और 100 यू/एमएल ग्लूकोज oxidase के अलावा द्वारा anoxic शर्तों को बनाए रखने ।
    4. एक और बी रूपों के EPR स्पेक्ट्रा पीएच ≤ 5 और पीएच ≥ 8, में क्रमशः anoxic परिस्थितियों में फॉस्फेट के अभाव में मोल ।
    5. आंतरिक वर्णक्रमीय मापदंडों को प्राप्त करने के लिए इसी स्पेक्ट्रा का प्रयोग करें । अर्थात्, गाऊसी समारोह के साथ Lorentzian समारोह के कनवल्शनफ़िल्टर्स के रूप में वर्णक्रमीय लाइन अनुकरण कि आशा की जांच के अनसुलझे सुपर hyperfine संरचना । प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रा की गणना EPR स्पेक्ट्रा की फिटिंग एकपी और Lorentzian linewidth (ΔLपीपी) के मूल्यों, अनुप्रस्थ छूट दर, 1/टी2 (जहां 1/t2 = (√ 3/2) एलपीपी द्वारा निर्धारित की पैदावार CW EPR में आरएफ अवशोषण लाइन के मापा व्युत्पंन के लिए), और गाऊसी वितरण के linewidth, जी ।
      नोट: निम्नलिखित चरण 1.4.2 में निर्दिष्ट शर्तों पर स्पेक्ट्रा से मापा से प्राप्त मापदंडों हैं: ap(a) = # # # # # 3.37 g, ap(B) 1/टी2(A) = २३.६ mG; 1/टी2(बी) = 9 मिलीग्राम; छ (क) = 40 मिलीग्राम; जी (बी) = 45 मिलीग्राम (संदर्भ8देखें).
    6. आशा की EPR स्पेक्ट्रा को मध्यवर्ती पीएच (5 < ph < 8) में प्राप्त । अधिग्रहण EPR स्पेक्ट्रा के उच्च दायर घटक अनुकरण गैर में कई साइटों-युग्मित या शिथिल युग्मित सिस्टम संदर्भ से अनुकूलित19 के रूप में पहले18वर्णित के बीच विनिमय के सिद्धांत का उपयोग कर । एक और बी राज्यों के लिए प्राप्त आंतरिक मापदंडों का प्रयोग करें (चरण 1.4.5 देखें) चर की संख्या में कमी करने के लिए । प्रयोगात्मक लोगों के लिए परिकलित स्पेक्ट्रा फ़िट एक अंश (पीए) के मूल्यों को खोजने के लिए, और पीएच पर pA मूल्य की निर्भरता साजिश । एक पीएच अंशांकन वक्र के रूप में आगे के अध्ययन में पीएच पर पीए की निर्भरता का प्रयोग करें ।
      नोट: एक मानक अनुमापन वक्र के साथ पीए के पीएच निर्भरता फिटिंग पृथक्करण निरंतर, पीकेएक (आशा) = 6.98के मूल्य प्रदान करता है । vivo अध्ययनों में, आशा जांच के पूर्ण EPR स्पेक्ट्रा प्राप्त करने में अतिरिक्त समय के लिए कम और उच्च क्षेत्र के बीच अंतर प्राप्त करने के लिए आवश्यक की वजह से अव्यावहारिक है फास्फोरस hyperfine बंटवारे के EPR स्पेक्ट्रम में । इसलिए, आगे उदाहरण अध्ययन में केवल EPR स्पेक्ट्रम के उच्च दायर घटक मापा और विश्लेषण किया गया है ।
    7. पीओ2की जांच अंशांकन के लिए, विभिंन ऑक्सीजन सांद्रता पर आशा जांच के EPR स्पेक्ट्रा प्राप्त ।
    8. एक गैस नियंत्रक से दिया गैस मिश्रण के साथ bubbling द्वारा समाधान के पीओ2 मूल्यों पर नियंत्रण । नियंत्रण समाधान तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) एक पानी एक थर्मोस्टेट से जुड़ी स्नान का उपयोग कर ।
    9. EPR स्पेक्ट्रा अनुकरण और वे ऑक्सीजन प्रेरित छूट दरों के मूल्यों का निर्धारण करने के लिए कदम 1.4.6 में वर्णित के रूप में प्रयोगात्मक लोगों के लिए फिट ।
      नोट: ऑक्सीजन प्रेरित छूट दरों के मूल्यों थे ०.४९ मिलीग्राम/mmHg दोनों एक और आशा जांच के बी रूपों के लिए के रूप में 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया8।
    10. [Pi] की जांच अंशांकन के लिए, विभिन्न फॉस्फेट सांद्रता पर आशा जांच के EPR स्पेक्ट्रा प्राप्त. पीकेए (pka = 6.9 पर 37 ° c)18 और विभिन्न फॉस्फेट सांद्रता के साथ अनुमापन के पास पीएच मान के साथ आशा कट्टरपंथी समाधान का उपयोग करें । ऊपर दिए गए चरणों में वर्णित के रूप में तापमान और गैस संरचना बनाए रखें ।
    11. EPR स्पेक्ट्रा अनुकरण और उन्हें प्रयोगात्मक के लिए फिट के रूप में चरण 1.4.6 में वर्णित के रूप में Pi-प्रेरित विनिमय दर के मूल्यों का निर्धारण.
      नोट: pi-प्रेरित विनिमय दर पर [pi] की निर्भरता आगे की पढ़ाई में अंशांकन के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

2. स्तन कैंसर के माउस मॉडल

  1. MMTV-PyMT सहज ट्यूमर मॉडल
    1. प्रयोग 4-8 सप्ताह पुरानी महिला मित्र वायरस B-type संवेदनशीलता/NIH (FVB/एन) माउस स्तन ट्यूमर वायरस प्रमोटर (MMTV) polyoma मध्य-T प्रतिजन (PyMT +) अनायास के लिए बनाया स्तन ट्यूमर के साथ चूहों में vivo EPR अध्ययन ।
    2. सामान्य स्तन ग्रंथियों और ट्यूमर के ऊतक microenvironments की तुलना के लिए, PyMT oncogene (PyMT −, "जंगली प्रकार") में कमी आयु-मिलान littermate महिलाओं का उपयोग करें20.
    3. विषय के लिए चूहों एल बैंड EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रति सप्ताह एक बार isoflurane संज्ञाहरण के दौरान चार सप्ताह के लिए (नीचे जांच प्रसव देखें).
    4. Anesthetize एक हवा का उपयोग कर माउस isoflurane मिश्रण (3% isoflurane), और एक सही, ट्यूमर (स्तन ग्रंथियों) सतह कुंडल प्रतिध्वनित करने के लिए करीब के साथ पार्श्व स्थिति में एक समायोज्य मेज पर माउस जगह है ।
    5. माउस प्लेसमेंट के बाद, intratissual (आईएएएफ) इंजेक्शन द्वारा जांच प्रशासन, EPR स्पेक्ट्रोमीटर धुन, और 5-10 मिनट के लिए EPR स्पेक्ट्रा प्राप्त ।
    6. (MMTV-PyMT + चूहों से) या गैर ट्यूमर असर स्तन ग्रंथियों (PyMT − चूहों से) एक ही EPR सत्र के दौरान (से) 2-3 स्तन ट्यूमर को मापने ।
  2. Orthotopic मिले-1 ट्यूमर मॉडल
    1. बढ़ती FVB/एन पृष्ठभूमि से मुलाकात-1 murine स्तन कैंसर की कोशिकाओं पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2, और 95% DMEM में सापेक्षिक आर्द्रता जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10 µ जी/एमएल इंसुलिन, 5 एनजी/एमएल rhEGF, और 1% पीएसए (पेनिसिलिन ग्राम सोडियम, streptomycin सल्फेट, और amphotericin बी) को ~ एक T175 कुप्पी में 80% संगम ।
    2. महाप्राण मीडिया और कुल्ला अनुयाई कोशिकाओं के साथ 10 मिलीलीटर पंजाबियों (1.54 mm KH2PO4, 155 mm NaCl, और २.७१ mm Na2HPO4-7H2हे बिना कैल्शियम क्लोराइड या मैग्नीशियम क्लोराइड, पीएच = 7.4) ।
    3. कोशिकाओं को अलग से 0.25% Trypsin-EDTA समाधान और कुप्पी का घोड़ा 5 मिलीलीटर जोड़ कर । जब कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, 10 मिलीलीटर DMEM 10% FBS युक्त कुप्पी के लिए और कोशिकाओं को इकट्ठा जोड़ें ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 132 x g पर सेल सस्पेंशन के केंद्रापसारक । एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और 1 एक्स 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित 100 µ l न्यूनतम DMEM.
    5. एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना (29G1/2 सुई), धीरे 4 संख्या में ट्यूमर सेल निलंबन के 100 µ एल सुई 8 सप्ताह पुरानी महिला FVB के स्तन वसा पैड/एन जंगली प्रकार चूहों ।
    6. टटोलने का कार्य द्वारा ट्यूमर दीक्षा की निगरानी (लगभग 2-3 सप्ताह के बाद दिखाई देते हैं), विकास (दृश्य), और माउस हीथ (दृश्य) हर दूसरे दिन ।
    7. कैलिपर्स का उपयोग कर प्रति सप्ताह एक बार ट्यूमर आयामों को मापने और समीकरण का उपयोग ट्यूमर संस्करणों का निर्धारण:
      Figure

3. Vivo कार्यात्मक माप में के लिए जांच डिलिवरी

  1. का प्रयोग करें LiNc कण-BuO जांच (प्रोटोकॉल मैं) orthotopic ट्यूमर मॉडल में पीओ2 माप के लिए आंतरिक LiNc के साथ ट्यूमर कोशिकाओं प्रत्यारोपन-BuO microcrystals के रूप में पहले14वर्णित,21 और नीचे विस्तृत ।
    1. मिले-1 ट्यूमर मॉडल के मामले में, internalization के लिए LiNc-BuO microcrystals में मिले-1 कोशिकाओं, निलंबित LiNc-BuO microcrystals में 20 मिलीग्राम/एमएल और DMEM एक जांच sonicate के साथ 20 kHz पर एक 5-एमएल ग्लास दौर-नीचे ट्यूब में 7 W शक्ति का उपयोग कर बर्फ पर 5 मिनट के लिए ।
    2. 100 µ एल जोड़ें (2 LiNc के मिलीग्राम-BuO) 10 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया के साथ एक T75 कुप्पी को निलंबन के मिले-1 कोशिकाओं (लगभग 30% धाराप्रवाह) युक्त । सभी प्रक्रियाओं को एक सुरक्षा कैबिनेट में जगह ले और मीडिया में पेनिसिलिन और streptomycin संभावित संक्रमण को कम करने के लिए शामिल हैं ।
    3. 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन या जब तक वे पहुंच ~ 80% प्रवाह ।
    4. मीडिया को महाप्राण । 10 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ पांच बार कोशिकाओं को धो लें । 5 मिलीलीटर trypsin-EDTA के साथ कोशिकाओं को अलग । कोशिकाओं को इकट्ठा । कदम 2.2.4 में ऊपर वर्णित के रूप में केंद्रापसारक । कोशिका व्यवहार्यता और मात्रा निर्धारित करने के लिए अपवर्जन डाई के साथ कोशिकाओं का एक नमूना दाग ।
    5. कोशिकाओं को 1 x 106 प्रति 100 µ l ंयूनतम DMEM की एकाग्रता पर निलंबित ।
    6. एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, धीरे सेल निलंबन के 100 µ एल सुई का उपयोग कर LiNc-BuO microcrystals की संख्या 4 में 8 के स्तन वसा पैड सप्ताह पुरानी महिला FVB/एन जंगली प्रकार चूहों के रूप में चरण 2.2.5 में वर्णित.
    7. कदम 2.2.6 और 2.2.7 में वर्णित के रूप में ट्यूमर दीक्षा और विकास की निगरानी.
  2. या तो सहज या orthotopic मॉडल में कण LiNc-BuO जांच (प्रोटोकॉल द्वितीय) का प्रयोग करें । ब्याज की साइट पर LiNc-OBu microcrystals इंजेक्षन, सामान्य स्तन ग्रंथियों या स्तन ट्यूमर में उदा, एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर.
  3. घुलनशील जांच
    1. Anesthetize एक हवा की सांस लेना द्वारा चूहों isoflurane मिश्रण (1.0 L/मिन वितरण और isoflurane के 2-3%) एक संज्ञाहरण मशीन का उपयोग कर और उंहें EPR स्पेक्ट्रोमीटर के अंतर में जगह है ।
    2. इंस्ट्रूमेंट ट्यून करें, फिर NR (10-30 µ l, 10 mm), आशा जांच (10 − 30 µ l, 0.5-2 mm) खारा, पीएच 7.2, या DMSO में RSSR जांच (10 µ l, 10 mm) समाधान (आईएएएफ) इंजेक्ट करें ।

4. Vivo में कार्यात्मक माप

  1. EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए, anesthetize चरण में वर्णित के रूप में एक संज्ञाहरण मशीन का उपयोग हवा isoflurane मिश्रण की साँस लेना द्वारा चूहों ।
  2. इस प्रकार के रूप में एल बैंड (1.2 GHz) EPR स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कार्यात्मक माप प्रदर्शन ।
    1. एक सामान्य स्तन ग्रंथि या एक स्तन ट्यूमर पर सतह का तार प्रतिध्वनित प्लेस और स्पेक्ट्रोमीटर धुन ।
    2. प्रत्यारोपित के बाद कई हफ्तों से अधिक 5 − 10 मिनट के लिए प्रत्यारोपित कण जांच से EPR स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हैं । घुलनशील जांच के मामले में, 5-10 मिनट के लिए जांच इंजेक्शन के तुरंत बाद EPR स्पेक्ट्रा प्राप्त ।
    3. hyperfine बंटवारे, एकN, और सिग्नल आयाम, मैं (टी) को खोजने के लिए NR जांच के EPR स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करें । चरण 1.2.4 में प्राप्त अंशांकन वक्र का उपयोग करकेN के मान को pH मान में कनवर्ट करें । प्रारंभिक आयाम से रिश्तेदार परिवर्तन के रूप में संकेत आयाम मैं (टी) के क्षय की दर का विश्लेषण, मैं (टी = 0), प्रति सेकंड मनमानी इकाइयों में गणना (एस-1) ।
    4. monoexponents एकाग्रता की गणना करने के लिए घातांक कैनेटीक्स के समय स्थिरांक प्राप्त करने के लिए GSH के लिए GSH-संवेदी RSSR जांच के EPR स्पेक्ट्रम के monoradical घटक की वृद्धि को फ़िट करें ।
    5. पीएच, पीओ2 और Pi के मूल्यों को प्राप्त करने के लिए (चरण 1.4.5) में वर्णित के रूप में प्रयोगात्मक लोगों के लिए बहुआयामी आशा जांच के उच्च क्षेत्र घटक के EPR स्पेक्ट्रा फ़िट ।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. डेटा प्रोसेसिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं । सहसंबंध विश्लेषण के लिए (सामान्य रूप से वितरित डेटासेट के लिए) और स्पीमरन के रैंक क्रम सहसंबंध (डेटासेट के साथ अस्वीकृत डेटा वितरण की सामान्यता के लिए) पियरसन के r सहसंबंध परीक्षण का उपयोग करें ।

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Representative Results

ऊतक प हे 2 LiNc-BuO जांच का उपयोग कर आकलन:

चरण 1.1 के अंतर्गत वर्णित कार्यविधि का उपयोग करते हुए, हम नए सिरे से तैयार LiNc-BuO microcrystals निलंबन के अंशांकन प्रदर्शन किया । चित्रा 2 LiNc-BuO जांच के linewidth के ठेठ ऑक्सीजन निर्भरता से पता चलता है, साथ ही इसके उदाहरण EPR स्पेक्ट्रा में मापा बफर सस्पेंशन और महिला C57Bl में स्तन ट्यूमर ऊतक में/6 चूहों कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा ट्यूमर दीक्षा के बाद उगाया आंतरिक कणों के साथ (3.1 कदम) । linewidth अंशांकन का उपयोग कर ऊतक पीओ2 मूल्य की गणना के लिए अनुमति देता है (स्पेक्ट्रम के लिए 7.5 mmHg के बराबर (बी) चित्रा 2में दिखाया गया है).

Figure 2
चित्र 2 . EPR के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता कण LiNc-BuO जांच करने के लिए ऑक्सीजन । ऑक्सीजन आंशिक दबाव पर DMEM में LiNc-BuO जांच निलंबन के EPR स्पेक्ट्रम के linewidth के प्रतिनिधि निर्भरता दिखाया गया है । EPR स्पेक्ट्रम (डालें a) pO2, 37 ° c के 0% पर मापा गया था, और linewidth ΔHpaper = 113 mG के साथ एक शुद्ध Lorentzian रेखा का प्रतिनिधित्व करता है । linewidth 11.7 mG/mmHg की ढलान के साथ pO2 के साथ रेखीय बढ़ाता है । स्पेक्ट्रम में दिखाया (संमिलित ख) anesthetized महिला C57Bl के स्तन ट्यूमर ऊतक में मापा गया/Δएचपीपी = 204 मिलीग्राम दिखा रहा है, जो 7.5 mmHg के ऊतक पीओ2 से मेल खाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ऊतक Extracellular पीएच और Redox का आकलन NR जांच का उपयोग:

चरण 1.2 के अंतर्गत वर्णित कार्यविधि का उपयोग करते हुए, हम पीएच और redox जांच, NR के अंशांकन प्रदर्शन किया । चित्रा 3 मनाया hyperfine बंटवारे निरंतर निर्भरता, पीएच पर NR कट्टरपंथी के एकएन, से पता चलता है. निर्भरता के साथ एक मानक अनुमापन वक्र द्वारा वर्णन किया गया हैa = 6.6 37 डिग्री सेल्सियस पर । एकN(पीएच) के इस निर्भरता vivo माप में इसी के लिए अंशांकन वक्र के रूप में कार्य करता है, की सीमा में पीएच माप के लिए अनुमति 5.6 से 7.6, 0.05 पीएच इकाइयों की सटीकता के साथ ।

Figure 3
चित्र 3 . EPR के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता पीएच करने के लिए घुलनशील NR जांच. L-बैंड EPR स्पेक्ट्रा NR जांच समाधान के विभिन्न पीएच पर 37 डिग्री सेल्सियस में अधिग्रहीत किया गया था, और पीएच की निर्भरता मनाया hyperfine बंटवारे लगातार, एकN, साजिश रची गई थी. ठोस लाइन मानक अनुमापन वक्र के साथ प्रयोगात्मक डेटा के फिट है,, पावरफुल Equation 2 pKa = 6.6, aN(NR-H+) = १४.२४ g, और aN(R) = १५.२७ g. संमिलित करें: उदाहरण EPR स्पेक्ट्रम के 1 मिमी NR समाधान (पीएच 6.4) का अधिग्रहण निम्न स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स का उपयोग करना: चुंबकीय क्षेत्र झाडू, 80 जी; मॉडुलन आयाम, 2.5 ग्राम, अधिग्रहण समय, 20 एस. मापा hyperfine बंटवारे स्थिरांक १४.६३ G. जॉन विले एंड संस, Inc की अनुमति के साथ संदर्भ23 से reproduced कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 4 एक स्तन ट्यूमर माउस मॉडल में पीएच और redox माप मिसाल, के रूप में कदम 3.3 (आईएएएफ जांच इंजेक्शन) और धारा 4 (स्पेक्ट्रा अधिग्रहण और स्पेक्ट्रा विश्लेषण) के तहत वर्णित किया ।

Figure 4
चित्र 4 . vivo में ऊतक को कम करने की क्षमता का आकलन EPR . सम्मिलित करें: एल-बैंड EPR स्पेक्ट्रम के NR जांच के बाद vivo में मापी गई आईएएएफ इंजेक्शन (10 µ एल, 10 मिमी) स्तन ट्यूमर ऊतक में anesthetized महिला FVB/एन चूहों. hyperfine बंटवारे, एकN, के बराबर हो पाया था १४.७२ G, जो पीएच के मूल्यई = ६.५२ मान ट्यूमर ऊतक तापमान 34 डिग्री सेल्सियस और पीकेएक = 6.6 से मेल खाती है । NR कमी दर केंद्रीय क्षेत्र वर्णक्रमीय घटक के क्षय का पालन करके मूल्यांकन किया है. उदाहरण कैनेटीक्स स्तन ट्यूमर में मापा (■) और स्तन ग्रंथियों (ओ) सामान्य स्तन ग्रंथि बनाम ट्यूमर ऊतक के उच्च को कम करने की क्षमता का प्रदर्शन. कैनेटीक्स के प्रारंभिक भाग के विश्लेषण की पैदावार EPR संकेत कमी, कश्मीर केलाल, ऊतकों के extracellular मीडिया में के रूप में 2.5 x 10-3एस बनाम ट्यूमर में 0.5 x 10-3s में सामांय ग्रंथि/ जॉन विले एंड संस की अनुमति के साथ11 संदर्भ से reproduced, Inc कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 5 संक्षेप पीएचई और redox मापन ट्यूमर में महिला FVB/N MMTV-PyMT चूहों और ट्यूमर अम्लीय extracellular microenvironment और उच्च कम करने की क्षमता का समर्थन करने वाले सामान्य स्तन ग्रंथियों के समूह के लिए प्रदर्शन किया.

Figure 5
चित्र 5 . vivo में ऊतक अंलता और कम करने की क्षमता का आकलन EPR । Extracellular ऊतक पीएच (भरा सलाखों) और कमी दर (खाली सलाखों) के सामान्य स्तन ग्रंथियों में NR nitroxide के मूल्यों और महिला FVB के स्तन ट्यूमर/एन चूहों में द्वारा मापा vivo EPR. त्रुटि पट्टियां निरूपित एसई. जॉन विले एंड संस की अनुमति के साथ11 संदर्भ से reproduced, Inc कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समसामयिक ऊतक पीएच ई , Redox, और प हे 2 संयोजन NR और LiNc-BuO जांच द्वारा मूल्यांकन:

कण LiNc-BuO पसंद की जांच है जब पीओ2 मूल्यों के दोहराव अनुदैर्ध्य माप ब्याज की एक पूर्व निर्धारित ऊतक में योजना बनाई है । दुर्भाग्य से, कण जांच की एक प्रमुख सीमा है कि यह केवल ऑक्सीजन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है और कोई अंय टीएमई के भीतर शारीरिक रूप से प्रासंगिक रासायनिक मापदंडों, और ऊतक इमेजिंग के लिए अनुमति नहीं है । इस प्रकार, EPR में घुलनशील जांच का उपयोग इमेजिंग का लाभ है और कई शारीरिक-प्रासंगिक टीएमई मापदंडों का पता लगाने । इस संबंध में, पीओ2 माप प्रत्यारोपित LiNc-BuO कणों का उपयोग कर दोहरी समारोह पीएच और redox nr जांच के साथ जोड़ा जा सकता है क्योंकि कम और उच्च क्षेत्र वर्णक्रमीय घटक NR EPR स्पेक्ट्रम के EPR लाइन के साथ ओवरलैप नहीं करते LiNc-BuO जांच ।

चित्रा 6 एक ठेठ EPR स्पेक्ट्रम महिला C57Bl/6 चूहों के स्तन ट्यूमर ऊतक में आईएएएफ इंजेक्शन के तुरंत बाद NR जांच द्वारा मनाया दिखाता है । NR जांच के मनाया triplet स्पेक्ट्रम LiNc-BuO microcrystals है कि ट्यूमर के भीतर एंबेड किया गया है की एकल EPR लाइन के साथ मढ़ा (ट्यूमर वृद्धि आंतरिक कणों के साथ कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा शुरू किया गया था के रूप में कदम 3.1 में वर्णित है । pH मान की गणनाN hyperfine विभाजन को निंन-और उच्च-फ़ील्ड घटकों के बीच की दूरी के रूप में मापने और आरेख 6में दिखाए गए स्पेक्ट्रम के लिए चित्रा 3 (६.८८ के बराबर) में दिखाए गए अंशांकन का उपयोग करके की जाती है । ध्यान दें कि पीओ2 मूल्यांकन NR जांच के इंजेक्शन से पहले LiNc-BuO संकेत के linewidth की माप के आधार पर किया जाता है । NR संकेत के क्षय के रूप में चित्रा 4में सचित्र क्षमता को कम करने ऊतक के मूल्य प्रदान करता है.

Figure 6
चित्र 6 . बहुआयामी टीएमई मूल्यांकन संयोजन LiNc-BuO और NR जांच. EPR स्पेक्ट्रम महिला C57Bl के स्तन ट्यूमर ऊतक में vivo में मापा/6 माउस के तुरंत बाद आयकर NR जांच का इंजेक्शन. NR के मनाया triplet स्पेक्ट्रम LiNc-BuO ट्यूमर के भीतर एंबेडेड जांच की एक एकल EPR लाइन के साथ आरोपित है । कम-और उच्च-फ़ील्ड घटकों के बीच विभाजन से परिकलित pH मान ६.८८ है । NR संकेत के क्षय ऊतक को कम करने की क्षमता का मूल्य प्रदान करता है. प ओ2 मूल्यांकन NR जांच के इंजेक्शन से पहले LiNc-BuO के linewidth की माप के आधार पर किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Vivo में Intracellular GSH का मूल्यांकन:

RSSR जांच और GSH के बीच thiol-डाइसल्फ़ाइड विनिमय की प्रतिक्रिया डाइसल्फ़ाइड टुकड़ों के बीच दो monoradicals के22 और intramolecular स्पिन विनिमय के कैंसिलेशन के गठन में जिसके परिणामस्वरूप जांच के monoradical बांड विभाजन । चित्रा 7A EPR स्पेक्ट्रा के गायब होने में जिसके परिणामस्वरूप पर GSH के साथ RSSR जांच की प्रतिक्रिया के प्रभाव को दिखाता है "biradical" वर्णक्रमीय घटकों और monoradical घटकों की तीव्रता के इसी वृद्धि हुई है । मनाया दर GSH और RSSR के बीच प्रतिक्रिया के निरंतर है: kobs = 2.8 ± 0.2 M-1एस-1 (टी = 34 ° c, पीएच 7.2)11. चित्रा 7B मिसाल के कैनेटीक्स monoradical वर्णक्रमीय पीक तीव्रता परिवर्तन स्तन ट्यूमर में मापा (●) और सामान्य स्तन ग्रंथि (ओ) एल बैंड EPR का उपयोग कर. ठोस लाइनें kobs = 2.8 M-1s-1 और पावरफुल [GSH] = 10.7 mm और 3.3 mm ट्यूमर और सामान्य स्तन ग्रंथि के लिए, क्रमशः का उपयोग कर monoexponent द्वारा कैनेटीक्स के प्रारंभिक भाग के फिट बैठता है ।

Figure 7
चित्र 7 . vivo में intracellular ऊतक glutathione सांद्रता का EPR आकलन । (क) X-बैंड 100 µ एम के EPR स्पेक्ट्रा में 2.5 mM GSH के साथ मशीनीकरण के बाद विभिन्न समय अंक में मापा 0.1 m Na-फास्फेट बफर, पीएच 7.2, और 1 मिमी DTPA में 34 ° c. कैनेटीक्स विश्लेषण GSH और RSSR, kobs (pH 7.2, 34 ° c) = (2.8 ± 0.2) एम-1 एस-1के बीच की प्रतिक्रिया का स्वीकार्य दर निरंतर मूल्य प्रदान करता है । (B) monoradical वर्णक्रमीय पीक तीव्रता परिवर्तन के कैनेटीक्स स्तन ट्यूमर (●) और FVB/एन चूहों की सामान्य स्तन ग्रंथि (ओ) में एल बैंड EPR द्वारा मापा RSSR जांच के आईएएएफ इंजेक्शन के तुरंत बाद (कदम 3.3.2 देखें) । ठोस लाइनें monoexponent द्वारा कैनेटीक्स के प्रारंभिक भाग के फिट बैठता है, जाना चाहिए k obs (pH 7.2, 34 ° c) = 2.8 M -1 s- 1 और पावरफुल [GSH] = 10.7 mm और 3.3 mm ट्यूमर और सामान्य स्तन ग्रंथि के लिए, क्रमशः । जॉन विले एंड संस की अनुमति के साथ11 संदर्भ से reproduced, Inc कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ऊतक Extracellular पीएच के बहुआयामी मूल्यांकन, प हे 2 , और Pi बहुआयामी आशा जांच का उपयोग कर:

चित्रा 8 धारा 1.4 के तहत वर्णित अंशांकन प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त आशा जांच के वर्णक्रमीय मापदंडों की संवेदनशीलता को दर्शाता है ।

Figure 8
चित्र 8 . आशा जांच का उपयोग कर रासायनिक microenvironment के बहुआयामी आकलन । (क) जांच के दो ionization राज्यों के बीच पीएच-निर्भर संतुलन की योजना. (ख) एल-बैंड EPR स्पेक्ट्रम ऑफ होप । (ग) आशा के EPR linewidth एक पृO2 मार्कर (शुद्धता, ≈ 1 mmHg; प हे२ रेंज, 1-100 mmHg). (घ) protonated आशा के अंश 6 से 8.0 (सटीकता, ± 0.05) की सीमा में एक पीएच मार्कर है । (ई) प्रोटॉन विनिमय दर की निर्भरता (मिलीग्राम में व्यक्त) अकार्बनिक फॉस्फेट (Pi) स्पेक्ट्रा सिमुलेशन द्वारा निकाली गई एकाग्रता के साथ आशा की (सटीकता, ± 0.1 mm, रेंज, 0.1-20 मिमी) 12,18. संदर्भ8 से प्रकृति प्रकाशन समूह की अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 9 FVB/एन जंगली प्रकार स्तन ग्रंथियों में प्रदर्शन किया और MMTV-PyMT ट्रांसजेनिक चूहों, जो अनायास स्तन कैंसर का विकास और मानव ट्यूमर का अनुकरण20के टीएमई में निष्पादनीय माप दिखाता है । पीओ2 का मतलब मान (50 ± 3 mmHg टीएमई बनाम में 58 ± 3 सामान्य ऊतक में mmHg) और पीएचई (सामान्य ऊतक में टीएमई बनाम 7.1 ± 0.03 में ६.९९ ± 0.03) ट्यूमर में hypoxic और अम्लीय क्षेत्रों की एक उपस्थिति का समर्थन करते हैं । सबसे नाटकीय परिवर्तन मध्य pi की एकाग्रता में मनाया गया (1.8 ± 0.2 mm में टीएमई vs. ०.८४ ± 0.07 mm सामान्य ऊतक में) ट्यूमर प्रगति के एक टीएमई मार्कर के रूप में मध्य pi एकाग्रता की एक संभावित भूमिका का संकेत. व्यक्तिगत माप मतलब मूल्यों के आसपास महत्वपूर्ण बदलाव दिखा । एक बहुआयामी जांच का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि सभी मापदंडों एक ही जांच का उपयोग कर मापा जाता है, इसलिए सहसंबंध के लिए अनुमति जांच वितरण और माप के समय के रूप में चित्रा 9bमें सचित्र की स्वतंत्र- ई. पीओ2 और सामान्य स्तन ग्रंथि में पीएचई के बीच सकारात्मक सहसंबंध ट्यूमर में सहसंबंध के अभाव बनाम ऑक्सीजन एकाग्रता के स्वतंत्र glycolysis पर ट्यूमर निर्भरता का समर्थन करता है; हमारी राय में इस Warburg प्रभाव के vivo प्रदर्शन में एक उदाहरण है । बारी में, मध्य [pi] और pO2 दोनों सामांय और ट्यूमर ऊतकों में उच्च [pi] (और कम एटीपी/pi अनुपात) में परिवर्तन के साथ समझौते में है के बीच नकारात्मक सहसंबंध स्वीकार्य कम ऑक्सीजन पर आपूर्ति.

Figure 9
चित्र 9 . vivo में ऊतक प हे 2 , पीएच ई , और Pi आकलन आशा जांच और EPR का उपयोग कर । (एक) के लिए सेट अप की तस्वीर vivo L-बैंड EPR माप में EPR स्पेक्ट्रोमीटर के मैग्नेट के बीच anesthetized माउस से पता चलता है, सही स्थान दिखा पर डालने के साथ और पाश के शीर्ष पर प्रतिध्वनित की स्थिति मापा ऊतक । आशा जांच के मध्य extracellular स्थानीयकरण नोट: यह भारी आरोप लगाया संरचनाओं और रक्त से आशा संकेत के कारण कोशिकाओं में घुसना नहीं है प्लाज्मा एल्ब्युमिन के साथ आशा है कि परिसर के द्वारा व्यापक संकेत के कारण EPR द्वारा पता नहीं है24 . (ख-ङ) मध्य पीओ2, pHe, और Pi मान के बीच सहसंबंध FVB/N जंगली प्रकार के चूहों और MMTV-PyMT ट्रांसजेनिक चूहों (N = 23) में स्तन कैंसर के टीएमई में मापा सामान्य स्तन ग्रंथियों में । ऑक्सीजन विविधताओं की सीमा का विस्तार करने के लिए, मध्यवर्ती अंतरिक्ष में anoxic शर्तों ग्लूकोज की ऑक्सीजन लेने वाली एंजाइमी प्रणाली की आईएएएफ इंजेक्शन द्वारा स्थापित किया गया था/ग्लूकोज oxidase (लाल प्रतीकों). नीली रेखाएं कुल डेटा सेट्स के लिए रेखीय फ़िट का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ख) सामांय ऊतक में पीओ2 और पीएचई के बीच एक सकारात्मक संबंध (r = 0.5, p = ०.०१४ काले प्रतीकों के लिए; r = ०.६४, p = 1.8 × 10-4 कुल डेटा सेट के लिए) बनाम (c) कोई महत्वपूर्ण टीएमई में pO2 और pHe के बीच सहसंबंध (r = 0.01, p = ०.९७ काले प्रतीकों के लिए; r = ०.२३, p = 0.3 कुल डेटा सेट के लिए) पाया गया । (घ) सामान्य ऊतक में पीओ2 और Pi दोनों के बीच एक नकारात्मक संबंध (r = − ०.५१, p = ०.०१३ काले प्रतीकों के लिए; r = − 0.7, p = 2.3 × 10-5 कुल डेटा सेट के लिए) और (e) टीएमई में (b, नीचे: r = − 0.4, p = ०.०७९ काले प्रतीकों के लिए; r = − ०.६२, p = कुल डेटा सेट के लिए ०.००१) पाए गए । प्रकृति प्रकाशन समूह की अनुमति के साथ संदर्भ8 से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रस्तुत तरीकों vivo में रासायनिक टीएमई, अर्थात् पीओ2, पीएच, redox स्थिति, और मध्य Pi और intracellular GSH की सांद्रता के महत्वपूर्ण मापदंडों के आकलन में इनवेसिव के लिए अनुमति देते हैं । ऐसे एमआरआई और कम क्षेत्र EPR के रूप में चुंबकीय अनुनाद तकनीक, इन टीएमई मानकों की रूपरेखा vivo में गैर इनवेसिव के लिए पसंद के तरीके हैं. एमआरआई संरचनात्मक संरचनाओं visualizes लेकिन कार्यात्मक संवेदनशीलता का अभाव है । एमआरआई के विपरीत, EPR तकनीक कार्यात्मक स्पिन जांच के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जब microenvironment के स्थानीय मापदंडों के लिए कार्यात्मक संवेदनशीलता प्रदान करते हैं । हमारे ज्ञान के लिए, वहां कोई अंय तरीकों को समवर्ती vivo में शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण रासायनिक टीएमई मानकों पीओ2, पीएचई, Pi, redox, और GSH के रूप में रहने वाले विषयों में मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध हैं ।

वर्णित प्रोटोकॉल कम क्षेत्र एल बैंड EPR और विशेष रूप से डिजाइन paramagnetic जांच का उपयोग कर पर आधारित हैं । चित्रा 1 में प्रस्तुत चार जांचों का एक सेट vivo टीएमई असेसमेंट की परख में एक प्रभावी माना जा सकता है । जांच की उपलब्धता vivo EPR माप में वर्णित के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है । प्रकाशित प्रक्रियाओं के अनुसार जांच के संश्लेषण11,12,13,15 सिंथेटिक कार्बनिक रसायन विज्ञान में विशेषज्ञता की आवश्यकता है और विधि के कार्यांवयन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम बन सकता है .

कण जांच के आवेदन ऊतक पीओ2 के लिए सप्ताह के लिए प्रत्यारोपण के बाद14,21के लिए दोहराया माप सक्षम बनाता है । घुलनशील जांच ऑक्सीजन एकाग्रता25 से परे मापदंडों की एक विस्तारित संख्या के लिए संवेदनशीलता का प्रदर्शन और स्थानिक हल माप26के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, बहुआयामी आशा जांच के एक आवेदन vivo समवर्ती माप में पीएच, पीओ2, और Pi extracellular अंतरिक्ष में के लिए नायाब अवसर प्रदान करता है । तीन मापदंडों की माप एक जांच का उपयोग कर अपने सहसंबंध जांच के वितरण और माप के समय के स्वतंत्र विश्लेषण के लिए अनुमति देता है8।

जांच एक साथ नहीं किया जा सकता है, प्रत्यारोपित LiNc-BuO कण जांच, जो घुलनशील जांच के रूप में किसी के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए छोड़कर के रूप में चित्रा 6में प्रदर्शन किया । इसलिए, प्रयोगात्मक डिजाइन विशिष्ट कार्यात्मक घुलनशील जांच के व्यक्तिगत इंजेक्शन के अलग माप पर आधारित होना चाहिए । हाइड्रोफिलिक extracellular पीएच और redox NR जांच आईएएएफ इंजेक्शन11,14,26 और प्रणालीगत डिलीवरी27के माध्यम से दोनों को दिया जा सकता है, जबकि दो अन्य घुलनशील जांच, RSSR और आशा, केवल आईएएएफ प्रसव के लिए अनुमति दें 8 , 11 , 12 , 16. ध्यान दें कि RSSR और आशा है कि जांच के भविष्य संरचनात्मक संशोधनों और अधिक हाइड्रोफिलिक और प्रणालीगत प्रसव के लिए25कम विषाक्त जांच के अनुरूप के विकास के द्वारा जांच वितरण के बाद सीमा पर काबू पाने सकता है ।

ध्यान दें कि स्पेक्ट्रोस्कोपी EPR रूपरेखा टीएमई, जो अक्सर अपने उच्च विविधता द्वारा विशेषता है में मापा मापदंडों के औसत मूल्यों प्रदान करता है । यह आंशिक रूप से पैरामीटर्स के बीच संभावित अंतर मास्क या सहसंबंध विश्लेषण में महत्व घटाता है । इमेजिंग मोडलों में वर्णित जांच का उपयोग स्थानिक रूप से हल कार्यात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है26. हम मानते है कि बहु-कार्यात्मक EPR इमेजिंग के भविष्य में अपेक्षाकृत नए तरीके के आगे विकास पर निर्भर करता है जैसे रैपिड स्कैन EPR इमेजिंग और Overhauser-बढ़ाया एमआरआई (ओमरी, यह भी प्रोटॉन-इलेक्ट्रॉन डबल अनुनाद इमेजिंग, PEDRI) का कार्यकाल । कार्यात्मक EPR जांच और एडवांस्ड इमेजिंग तकनीक के विकास में नई दिशाओं से संबंधित फीचर आर्टिकल25में हाल ही में चर्चा में आया है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से NIH पलाश CA194013, CA192064 और U54GM104942 ने समर्थन दिया था. WVCTSI VVK, अटल बिहारी, और TDE को शुरू करने के लिए स्वीकार किया है । लेखकों ने गाये प्रयोगों के साथ सहायता के लिए डॉ॰ एम. Gencheva और के. Steinberger का धन्यवाद किया । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NIH के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-band EPR spectrometer Magnettech, Germany L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller  Noxygen, Germany Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
Sonicator Fisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced) Sigma-Aldrich G4251
MMTV-PyMT  mice In house
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Met-1 murine breast cancer cells In house
C57Bl/6 wild type mice  Jackson Laboratory
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypan Blue Exclusion Dye  Thermo Fisher Scientific T10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo) Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic sigma-Aldrich S07051
Sodium Chloride sigma-Aldrich S7653
Hydrochloric acid sigma-Aldrich 320331
Sodium Hydroxide sigma-Aldrich S8045
Glucose sigma-Aldrich
Glucose oxydase sigma-Aldrich
Lauda Circulator E100 Lauda-Brikmann
pH meter Orion Thermo Scientific 
LiNc-BuO probe In house The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probe In house The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probe In house The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probe In house The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 133 इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद nitroxide trityl कट्टरपंथी पीएच ऑक्सीजन एकाग्रता redox स्थिति glutathione अकार्बनिक फॉस्फेट ट्यूमर microenvironment
<em>Vivo में</em> पीएच के EPR आकलन, <em>पी</em>ओ<sub>2</sub>, Redox स्थिति, और ट्यूमर में फॉस्फेट और Glutathione की सांद्रता Microenvironment
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Bobko, A. A., Eubank, T. D., Driesschaert, B., Khramtsov, V. V. In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (133), e56624, doi:10.3791/56624 (2018).

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