Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

In Vitro SUMOylation analysen å studere SUMO E3 Ligase aktivitet

doi: 10.3791/56629 Published: January 29, 2018

Summary

I motsetning til ubiquitin ligases, har noen E3 SUMO ligases blitt identifisert. Dette endret i vitro SUMOylation protokollen er kjøpedyktig identifisere romanen SUMO E3 ligases ved i vitro rekonstituering analysen.

Abstract

Små ubiquitin som modifikator (SUMO) endring er en viktig post-translasjonell modifikasjon (PTM) som formidler signaltransduksjon primært gjennom modulerende protein-protein interaksjoner. Lik ubiquitin endring, SUMOylation er regissert av en sekvensiell enzym cascade inkludert E1-aktivere enzym (SAE1/SAE2), E2-Bøyning enzym (Ubc9) og E3-ligase (dvs., PIAER for familien, RanBP2 og Pc2). Men forskjellig fra ubiquitination, en E3 ligase er uvesentlig for reaksjonen men ikke gir presisjon og effekt SUMO Bøyning. Proteiner modifisert av SUMOylation kan identifiseres ved i vivo analysen via immunoprecipitation med substrat-spesifikke antistoffer og immunoblotting med SUMO-spesifikke antistoffer. Demonstrasjon av protein SUMO E3 ligase aktivitet krever imidlertid i vitro rekonstituering av SUMOylation analyser renset enzymer, substrat og SUMO proteiner. Siden i vitro reaksjoner, vanligvis SAE1/SAE2 og Ubc9, alene er tilstrekkelig for SUMO Bøyning, er forbedring av SUMOylation av en antatte E3-ligase ikke alltid lett å oppdage. Her beskriver vi en modifisert i vitro SUMOylation protokollen som konsekvent identifiserer SUMO modifisering benytter en i vitro rekonstituert system. En trinnvis protokoll å rense katalytisk aktive K-bZIP, en viral SUMO-2/3 E3 ligase, er også presentert. SUMOylation aktiviteter renset K-bZIP vises på p53, en velkjent mål i SUMO. Denne protokollen kan ikke bare være ansatt for Klargjørende romanen SUMO E3 ligases, men også for å avsløre deres SUMO paralog spesifisitet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SUMO endring ble først identifisert som en reversibel post-translasjonell modifikasjon (PTM) som regulerer protein stabilitet1. I tillegg til direkte Bøyning, kan SUMO også knyttes til et protein gjennom ikke-kovalente samhandling med SUMO samhandling motiver (SIMs)2. Lignende til binding av tyrosyl-fosforylering av molekyler skjuler Src homologi 2 (SH2) eller phosphotyrosine binding (PTB) domener3,4, SUMO modifisering har en ekstra samspill plattform for selektiv Rekruttering SIM inneholder effektor proteiner5,6. I tillegg til regulering av signaltransduksjon tjene SUMOylation transcriptional faktorer og chromatin remodeling molekyler å modulere gene expression7,8. Studier av genomet hele SUMOylation mønstre har avdekket at SUMO endringen er assosiert med positiv9,10 eller negativ10,11,12 transkripsjon regulering, delvis på grunn av paralogue spesifisiteten av SUMOylation.

Det er tre store SUMO isoformene for protein bøye dag i pattedyrceller; Disse inkluderer SUMO-1, og svært homologe SUMO-2 og SUMO-3 (referert til SUMO-2/3)13. SUMO er vanligvis konjugert til lysin (K) rester i ψKxD/E konsensus motivet i målet protein. SIM i SUMO E3 ligases er ansvarlig for det paralogue spesifisitet14. I motsetning til ubiquitination veier som inneholder hundrevis av E3 ligases, har det bare vært et par SUMO E3 ligases identifisert15. SUMO E3 ligases defineres av egenskaper inkludert deres evne til å (i) binde Ubc9, (ii) binder SUMO moiety via et SIM-domene og (iii) forbedre SUMO overføring fra Ubc9 på underlaget. E3 ligase er ikke absolutt nødvendig for SUMO Bøyning16, men gir substrat og SUMO-paralogue spesifisitet. Siden vanligvis bare en brøkdel av det totale substrat proteinet er SUMO-endret, er oppdagelsen av SUMOylated proteiner i vivo alltid en utfordring. Derfor er nøyaktig og reproduserbar analyser nødvendig for å belyse presis funksjonen til SUMO modifisering.

Den i vitro SUMOylation analysen, som evaluerer evne til renset Ubc9 å katalysere SUMOylation substrat proteiner, er en godt akseptert analysen for å studere SUMO endring17. Men SUMO E3 ligase aktivitet i de fleste tilfeller ikke kan oppdages eller bare bli oppdaget med mutert SUMO ligase med høy SUMO E3 ligase aktivitet og lav substrat spesifisitet av standard protokoll på grunn av en rikelig mengde Ubc918 . Den totale suksessen til denne analysen avhenger i stor grad forsiktig Serine renset Ubc9. I vitro SUMOylation analysen beskrevet her er endret fra en standard SUMOylation protokollen (se Tabell for materiale). Observasjon av økt global SUMO modifisering under Kaposis sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV) reaktivering bedt oss å identifisere det viral SUMO E3-ligase som kan være ansvarlig for opp-regulering av SUMOylation. Etter en småskala screening av samspill proteiner av viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 ble identifisert som en roman substrat. I denne protokollen viser vi detaljert i insekt celler trinnene involvert i uttrykk og rensing av vill-type K-bZIP, en viral SUMO E3 ligase med SUMO-2/3 spesifisitet. Evne til det renset K-bZIP å forbedre SUMOylation av p53, en velkjent SUMO underlaget, evalueres i nærvær av redusert mengder E1 og E2 enzymer. Bruker denne endrede SUMOylation analysen, kan forskere pålitelig Definer evnene til SUMO E3 ligase SUMOylate roman eller kjente underlag, som er en primær steg i studiet av protein SUMOylation. Videre er hjelper denne metoden identifisere romanen SUMO E3 ligases med lav ligase aktivitet, men høy substrat spesifisitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse av Baculovirus uttrykk konstruksjoner

  1. Rense SUMO E3 ligase K-bZIP ved kloning cDNA K-bZIP19 i en dobbel uttrykket baculovirus vektor (se tabell for materiale) med en N-terminal epitope-tag. Vi har hatt suksess ved hjelp av en octapeptide kode (angitt gjennom protokollen som vektor-koden-K-bZIP).
    Merk: DNA malen for K-bZIP polymerase kjedereaksjon (PCR) kloning er cDNA omvendt transkribert fra RNA isolert fra TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 celler etter doxycycline behandling20.
    1. Overføre full lengde K-bZIP cDNA19 til to uttrykk vektoren med Cpojeg kloning nettsteder. CPO Jeg fordøye PCR produktet og 1 µg av to uttrykk vektoren på 37 ° C for 3 h21.
    2. Skille og ekstra fordøyd DNA etter geleelektroforese på en 0,8% agarose gel22. Ligate innsatsen (K-bZIP) og vektor av T4 DNA ligase på 16 ° C i 30 min etter produsentens instruksjoner (se Tabell for materiale).
    3. Legge til 5 µL av hemorroider DNA til 50 µL kompetent E. coli celler "A" (se Tabell for materiale) i en 1,5 mL tube. Lagt på is i 30 min. Deretter ruge 1,5 mL røret i et vannbad 42 ° C for 45 s og umiddelbart legge røret på is 3 min.
    4. Legg til 600 µL S.O.C. medium (0,5% (w/v) gjærekstrakt, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2,5 KCl, 20 mM MgSO4og 4% (w/v) glukose) inn i røret og ruge ved 37 ° C i 1 time. Deretter sentrifuge røret ved romtemperatur for 3 min 600 x g.
    5. Fjerne nedbryting, resuspend pellets med 60 µL Luria-Bertani medium (LB; 1% (w/v) tryptone, 0,5% (w/v) gjær ekstrakt, og 85 mM NaCl) og spredt på LB agar plater som inneholder 100 µg/mL ampicillin. Inkuber agar platen på 37 ° C 16 h23,24.
    6. Velg 1 kolonien å vaksinere i 5 mL LB medium som inneholder 100 µg/mL ampicillin og kultur på 37 ° C 16 h med 250 rpm risting. Deretter pakker du ut plasmider, vektor-koden-K-bZIP, av en plasmider utvinning i henhold til produsentens instruksjoner (se Tabell for materiale).
  2. Generere rekombinant bacmid skjuler tag-K-bZIP av transformasjonen av vektor-koden-K-bZIP i kompetent E. coli celler "B" (se tabell for materiale).
    1. Bland 0,2 µg vektor-koden-K-bZIP plasmider og 100 µL kompetent E. coli celler "B" i en 1,5 mL rør og sette på is 30 min. ruge røret i 42 ° C vannbad for 45 s og umiddelbart legge røret på is 3 min.
    2. Legg til 900 µL av S.O.C. medium inn i røret og ruge på 37 ° C 4 h med rotasjon på 50 rpm. Neste, ta 10 µL av mediet, legger en ekstra 50 µL av S.O.C medium å spre på LB agar plater som inneholder 50 µg/mL kanamycin, 7 µg/mL gentamicin, 10 µg/mL tetracycline, 100 µg/mL galactosidase substrat og 40 µg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ), og Inkuber platene 48 h på 37 ° C.
    3. Vaksinere en hvit koloni i 5 mL LB medium inneholder 50 µg/mL kanamycin, 7 µg/mL gentamicin og 10 µg/mL tetracycline. Ruge på 37 ° C med 250 rpm risting 16 h.
    4. Isolere den rekombinant bacmid DNA skjuler tag-K-bZIP, kvantifisere og å suspendere i en konsentrasjon av 1 µg/µL25.
  3. Generere rekombinant baculoviruses uttrykke tag-K-bZIP av transfecting 1 µg av rekombinant bacmid DNA som inneholder kode-K-bZIP i Sf9 celler i en brønn av en 6-vel plate.
    1. Frø 2 x 106 Sf9 celler (se Tabell for materiale) i 2 mL Grace insekt Medium leveres med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% gentamicin i hver bra av en 6 godt plate, så ruge ved 27 ° C i 1 time.
    2. Opprettholde en logg fase kultur av Sf9 celler i Grace insekt Medium med 10% FBS, 1% gentamicin og 1% vaskemiddel C (se Tabell for materiale) ved 27 ° C i orbital suspensjon på 140 rpm. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og trypan blå flekker; cellen levedyktighet bør overstige 95%. Vedlikeholde celler med subcultivation forholdet 1:3 hver 2-3 dager (minimal tetthet ~0.5 x 106 celler/mL).
    3. Legge til 2 µL bacmid DNA (1 µg/µL) og 98 µL redusert serum media (se Tabell for materiale) i en 2 mL tube. Legg deretter til 4 µL transfection reagens (se Tabell of Materials) til rør og bland godt. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    4. Legg denne transfection blandingen (104 µL) i hver brønn, og ruge ved 27 ° C i 12-16 h.
    5. Fjerne utslitt media med mild aspirasjon, og Erstatt med 2 mL frisk Grace insekt Medium med 10% FBS og 1% gentamicin. Sf9 cellene overholde løst tallerken overflaten og ikke vil bli forstyrret med mild aspirasjon.
  4. Samle rekombinant baculovirus etter transfection og forsterke baculovirus for å få høy-titer aksjer (P1) for videre studier.
    1. 72 h etter bytte medium, skrape Sf9 celler ved hjelp av et sterilt celle lifter, samle nedbryting fra hver enkelt brønn i 1,5 mL tube og vortex for 10 s.
    2. Sentrifuge ved 4 ° C i 3 minutter på 150 x g. samle nedbryting P0 baculovirus og aliquot i 1,5 mL rør (1 mL baculovirus i hver retning). Butikken på-80 ° C.
    3. Frø 1 x 107 Sf9 celler i 10 mL Grace insekt Medium leveres med 10% FBS og 1% gentamicin i en 10 cm Petriskål og ruge ved 27 ° C i 1 time.
    4. Forsterkning av rekombinant baculoviruses uttrykke tag-K-bZIP, legge til 0,5 mL P0 baculovirus seeded Sf9 cellene og ruge ved 27 ° C i 48 timer.
    5. Samle nedbryting som P1 baculovirus 15 mL tube og butikk på 4 ° C i opptil 1 måned.

2. rensing av K-bZIP

  1. Opprettholde en logg fase kultur av Sf9 celler i Grace insekt Medium leveres med 10% FBS, 1% gentamicin og 1% vaskemiddel C ved 27 ° C i orbital suspensjon på 140 rpm som beskrevet i trinn 1.3.2.
  2. Ved signaltransduksjon, legger du til 1 mL av baculovirus inneholder nedbryting (P1) i 250 mL av Sf9 celler med en tetthet av 2 x 106 celler/mL.
  3. Inkuber Sf9 celler for 72 h ved 27 ° C på en orbital shaker med 140 rpm risting, og deretter samle med sentrifugering 2,740 x g i 15 min på 4 ° C.
  4. Fjerne nedbryting og lyse celle pellets i 10 mL lyseringsbuffer (20 mM HEPES pH 7.9, 0,5 M NaCl, 1% vaskemiddel en (se Tabell for materiale), 2% glyserol, protease hemmer cocktail) og rotere på 50 rpm bruker en suspensjon mikser på 4 ° C for 30 min.
  5. Sentrifuger celle lysate på 15 000 x g i 15 min samle nedbryting.
  6. For å rense koden-K-bZIP, ruge celle lysates (10 mL) med 50 µL av antistoff-merket magnetiske perler i 14 mL polypropylen rør og roterer på 50 rpm for 3t 4 ° c med en suspensjon blandebatteri. Etter protein fange, pellets perler på 800 x g sentrifugering for 30 s på 4 ° C. Fjerne det meste av nedbryting å suspendere perlene i residualvolum av ca 1 mL og overføre til en 1,5 mL tube for vask.
  7. Vask fanget protein ved å plassere røret som inneholder perler på en magnetisk stand, og fjern nedbryting når de magnetiske perlene har fullt overholdt ved siden av røret.
  8. Vask perler med lyseringsbuffer fire ganger.
    1. Legg 1 mL lyseringsbuffer til 1,5 mL rør, og Inverter rør 10 ganger. Sett 1,5 mL røret på en magnetisk stand og fjern nedbryting som beskrevet i 2.7.
    2. Gjenta forrige trinn en annen 3 ganger.
  9. Vask perler med fosfat bufret saltvann (PBS) en gang.
    1. Legg 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1, 5 mM KH2PO4) inn i 1,5 mL rør, og Inverter rør 10 ganger.
    2. Legge 1,5 mL røret på en magnetisk stand og fjern nedbryting.
  10. Elute tag-K-bZIP protein fra antistoff-merket magnetiske perler ved å legge til 100 µL av 150 µg/mL octapeptide fortynnet i PBS i en 1,5 mL tube. Rotere røret i 10 min 50 RPM ved suspensjon blandebatteri ved romtemperatur. Deretter sett røret tilbake på magnetiske stand og samle K-bZIP-som inneholder nedbryting i en ren 1,5 mL tube.
  11. Analysere 1-5 µL renset tag-K-bZIP protein SDS-side etterfulgt av Coomassie blå flekker26. Laste inn 2 µg, 1 µg og 0,5 µg prøver av bovin serum albumin (BSA) på samme gel og bruke den for kvantifisering med et bilde behandlingsprogram, som ImageJ. Anslå K-bZIP konsentrasjonen sammenligning BSA standarder.
  12. Den renset K-bZIP er nå klar til å brukes i hver SUMOylation analysen. Fortynne K-bZIP i PBS til en siste konsentrasjon av 100 ng/µL og store i små dele på-80 ° C.

3. SUMOylation analysen

  1. Legge 3 µL av 100 ng/µL av renset tag-K-bZIP inn i master blandingen av hver i vitro SUMOylation reaksjon. Inneholder komponentene i master mix 1 µL protein buffer, 1 x SUMOylation buffer, 0,5 µL p53 protein (0,5 mg/mL), 25 nM i E1 aktivering av enzym (lager conc.: 1 µM), 50 nM i E2 bøye enzym (lager conc.: 10 µM), og 250 nM av SUMO peptider (SUMO-1 , SUMO-2 eller SUMO-3; Stock conc.: 5 µM) til et endelig antall 17 µL.
  2. Bland innholdet forsiktig og Inkuber reaksjonen på 30 ° C for 3 h. stoppe reaksjonen ved å legge til 20 µL av 2 x SDS-lasting buffer (100 mM Tris-HCL pH 6.8, 4% natrium dodecyl sulfate, 0,2% (w/v) bromophenol blå, 20% (v/v) glyserol og 200 mM β-mercaptoethanol) og denature eksempler på 95 ° C i 5 minutter.
  3. Separate prøver på SDS-side, overføre atskilt proteiner til PVDF membran ved hjelp av en semi-tørr electrophoretic overføring apparater, og analysere ved Western blot bruke anti-p53 antistoff.
    1. Definere gel apparatet som i trinn 2.11 og laste 20 µL av prøve i gel brønner.
    2. Kjør 10% gel i en konstant strøm på 80 V i ca 120 min (til fargestoff bandet når bunnen av gel). Etter ferdigstillelse av geleelektroforese, slå av strømforsyningen.
    3. Koble gel apparater og gel-kassetter for å ta ut gel, og flyte gel i semi-tørr overføring buffer (48 mM Tris-HCl, 39 mM glysin, 20% metanol) i 5 min.
    4. Ta en container og suge PVDF membranen i metanol for 1 min. Deretter ta PVDF av metanol og satt i semi-tørr overføring buffer. Forsiktig agitere membranen i 5 min.
    5. Fjern sikkerhet dekselet av semi-tørr electrophoretic apparater.
    6. Pre våt filter papir og lage en gel sandwich på bunnen platina anoden som følger: filter papir, PVDF membran, gel og filter papir.
    7. Sikre katoden plate og sikkerhet dekke, Kjør klatt på 15 V konstant strøm for 90 min. slå av strømforsyningen, koble semi-tørr apparater, og ta ut PVDF membranen.
    8. Blokk PVDF membran med blokkering buffer (5% ikke-fett melk TBST buffer (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% vaskemiddel B (se Tabell for materiale), pH 7.6)) i romtemperatur 1t med 30 rpm risting av orbital shaker.
    9. Hybridize PVDF membranen med anti-p53 antistoff utvannet (1:1, 000) i blokkering buffer for 12-16 h på 4 ° C med 30 rpm risting med en suspensjon blandebatteri.
    10. Ta ut PVDF membranen i en container og sette i TBST. Skyll PVDF membran med TBST to ganger mer.
    11. Suge PVDF membranen i TBST i 30 min med 45 rpm risting av orbital shaker.
    12. Hybridize PVDF membranen med anti-kanin antistoff konjugert med pepperrotperoksidase (HRP) utvannet (1:4, 000) i blokkering buffer 1t ved romtemperatur med 30 rpm risting med en suspensjon blandebatteri.
    13. Vask PVDF membranen med TBST 3 ganger som beskrevet i trinn 3.4.10.
    14. Suge PVDF membranen i TBST i 30 min med 45 rpm skjelvende med en suspensjon blandebatteri. Fjern TBST og legge PBS Kunnskapsbasens PVDF membranen ved 4 ° C i opptil 12 h.
    15. Bland forbedret chemiluminescent substrat (ECL substrat) reagensen 1 og 2 (1:1) (se Tabell for materiale). Fjerne PVDF membranen fra PBS, blot kort med papirhåndkle eller lette svaber å absorbere fuktighet, og umiddelbart legge til 400 µL av ECL reagensen i overflaten av hver membran for 3-5 min. Fjern overflødig ECL reagens ved kort blotting, men tillater ikke m embrane til helt tørt.
    16. Utsett blot bruke luminescence tenkelig system eller autoradiography film27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ifølge opplysninger gitt av produsent, standard E1 og E2 enzym i SUMOylation analysen er 50 nM og 500 nM, henholdsvis. Minimalt med E2 bøye enzymet Ubc9 som kan SUMOylate p53 ble først bestemt av i vitro SUMOylation analysen. Så lavt som en femtedel av antallet Ubc9 som brukes i standard i vitro SUMOylation analysen protokollen kunne effektivt SUMOylate p53 (figur 1A). Derfor var halvparten av mengden E1 enzym i kombinasjon med en tidel av Ubc9 som brukes i standard protokoll brukes for en annen i vitro SUMOylation analysen. En betydelig reduksjon av SUMOylation effektiviteten ble observert sammenlignet med standard-protokoll (figur 1B).

Dermed endret evne til SUMO E3 ligase K-bZIP for å forbedre p53 SUMOylation ble bestemt bruker disse i vitro SUMOylation forhold. Merket K-bZIP renset fra Sf9 celler (figur 2A) var ansatt i en SUMOylation reaksjon med lavere mengder E1 og E2 Ubc9 enzymer. Under disse endrede forhold, K-bZIP kunne effektivt katalysere SUMOylation av p53 (figur 2B). Immunoblotting med anti-p53 antistoff bekreftet lignende totalbeløp av p53 hver reaksjon, og også oppdaget SUMO endret p53.

Figure 1
Figur 1 : Bestemmelse av minimalt med SUMO enzymer i i vitro SUMOylation analysen. (A) p53 SUMOylation ble evaluert i i vitro SUMOylation analysen som inkludert en halv og en femte mengden av Ubc9 enzym brukes i standardprotokollen. Etter 3 timer med i vitro SUMOylation reaksjonen, SUMOylated p53 enzymer ble undersøkt av Western blot med anti-p53 antistoff. (B) In vitro SUMOylation av p53 ble ytterligere analysert ved å bruke halvparten av E1 enzym i kombinasjon med en tidel mengden Ubc9 brukes i standard-protokoll. En Western blot ble utført som beskrevet som (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Av p53 SUMOylation av SUMO E3 ligase K-bZIP. (A) renset baculovirus-uttrykt K-bZIP protein, analyseres av SDS side med Coomassie blå flekker. 1 µg BSA og 10 µL renset K-bZIP var lasting komparative protein antallet. (B) K-bZIP forbedret p53 SUMOylation ble vurdert ved hjelp av en i vitro SUMOylation reaksjon med halvparten av E1 enzym og en tiendedel mengden av Ubc9 anbefale i standardprotokollen. SUMOylated p53 ble undersøkt ved Western blot som beskrevet i figur 1A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den i vitro SUMOylation-protokoll beskrevet her brukes rutinemessig til å etablere SUMOylation status identifisert Ubc9 underlag. Den store begrensningen bruke standardprotokollen for å studere SUMOylation funksjonen til SUMO E3 ligase er overflod av aktivering av SUMO E1 og E2 bøye enzymer Ubc9 som maksimerer SUMO bøyning i in vitro -systemer. Vurderer denne utfordringen tror vi at titrering mengden av SUMO E1 og E2 enzymer til nivå at man knapt kan oppdage sin aktivitet i SUMOylation finnes det bare måte å bestemme SUMO E3 ligase katalytisk aktiviteter bruker denne i vitro SUMOylation system. Etter denne hypotesen, vi er belyst E3 ligase aktiviteten til K-bZIP og identifiserer den som en roman SUMO E3 ligase med spesifisitet mot SUMO-2/3.

Det kritiske trinnet innenfor protokollen er inkorporering av lavere mengder E1 og E2. Ved hjelp av disse lavere beløp, som vist i figur 2, Roman SUMO E3 ligases med lav ligase aktivitet kanskje kunne identifiseres med bevaring av deres spesifisitet mot underlaget og SUMO paralogues. En stor begrensning av teknikken er behovet for et høykvalitets antistoff gjenkjenne SUMO underlaget, siden bare en svært liten del av underlaget kan SUMO endret.

Selv om mange proteiner viser potensial til å øke SUMOylation etter overuttrykte i vivo, må definere en SUMO E3 ligase bli demonstrert av et rekonstituert i vitro SUMOylation system som bruker renset E1 og E2 E3 enzymer. I motsetning til hundrevis og kanskje tusenvis av ubiquitin E3 ligases identifisert, inntil nå har bare noen SUMO E3 ligases blitt funnet. Dette kan skyldes delvis til bruk av tradisjonelle standard i vitro SUMOylation analysen som maksimerer SUMO Bøyning effektivitet og hindrer dermed potensielle SUMO E3 ligases SUMOylation funksjon. Nåværende protokollen beskriver en enkel og konsekvent analysen å undersøke SUMOylation forsterket av en SUMO E3 ligase. Metoden beskrevet er viktig for identifikasjon og karakterisering av romanen SUMO E3 ligases.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne avsløre noen mulige interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi (mest, 105-2320-B-010-007-MY3 til PCC), fra National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC til PCC), fra departementet for vitenskap og teknologi (mest 105-2314-B-400-019 til HJK) og fra National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 til HJK). Dette arbeidet ble også støttet delvis med National Yang-Ming University med manuskriptet publikasjon til PCC. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller oppreisning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pFastBac Invitrogen 10359-016 dual expression baculovirus vector
pCR2.1-TOPO vector Invitrogen PCR product vector
competent cell  E. coli DH5α Yeastern Biotech FYE678-80VL competent E. coli cells A
E. coli DH10Bac Invitrogen 10359-016 competent E. coli cells B
FugeneHD Roche 04709705001 transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985062 reduced serum media
T4 Ligase NEW England BioLabs M0202S
CpoI (RsrII) Thermo Scientific ER0741
Bluo-gal Thermo Scientific B1690 galactosidase substrate
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Grace’s Insect Medium Gibco 11605094
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Gentamicin Thermo Fisher 15750060
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-25G
Kanamycin Sigma-Aldrich K0254-20ML
gentamicin Gibco 15710-064
tetracyclin Sigma-Aldrich 87128-25G
LB Broth Merk 1.10285.0500
HEPES Sigma-Aldrich H4034-100G
NaCl Sigma-Aldrich S9888-5KG
KCl Merk 1.04936.1000
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136-500G
KH2PO4 J.T.Baker 3246-01
sodium dodecyl sulfate Merk 1.13760.1000
β-mercaptoethanol Bio-Rad 161-0710
TRIS (Base) J.T.Baker 4109-06
Non-fat milk Fonterra
glycerol J.T.Baker 2136-01
Triton X-100 Amresco 0694-1L detergent A
Tween 20 Amresco 0777-500ML detergent B
Poloxamer 188 solution Sigma-Aldrich P5556-100ML detergent C
Protease Inhibitor Cocktail Tablet Roche 04 693 132 001
3x Flag peptide Sigma F4799
anti-FLAG m2 Magnetic beads Sigma-Aldrich M8823 antibody-tagged magnetic beads
SUMOlink SUMO-1 Kit Active Motif 40120 standard SUMOylation protocol 
SUMOlink SUMO-2/3 Kit Active Motif 40220 standard SUMOylation protocol 
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN 12123 plasmid extraction kit
Polypropylene tubes Falcon 352059
Petri Dish Falcon 351029
Cell lifter Corning CNG3008
Loading tip Sorenson BioScience 28480
PVDF PerkinElmer NEF1002
Blotting filter paper Bio-Rad 1703932
Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) Bio-Rad 1658001 EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad 1703940
Pierce ECL Western Blotting Thermo 32106 ECL reagent
suspension mixer Digisystem laboratory instruments  Inc. SM-3000
orbital shaker Kansin instruments Co. OS701
ImageQuant LAS 4000
biomolecular imager
GE Healthcare 28955810
Sf9 Thermo Scientific B82501
anti-p53 antibody Cell Signaling #9282
anti-rabbit antibody GE Healthcare NA934-1ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277, (11), 8999-9009 (2002).
  2. Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24, (3), 341-354 (2006).
  3. Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56, (1), 21-31 (2016).
  4. Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14, (6), 567-588 (2014).
  5. Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33, (5), 201-208 (2008).
  6. Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, (18), 4102-4112 (2007).
  7. Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34, (2), 145-154 (2009).
  8. Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
  9. Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40, (20), 10172-10186 (2012).
  10. Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24, (12), 1242-1252 (2010).
  11. Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
  12. Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23, (10), 1563-1579 (2013).
  13. Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276, (38), 35368-35374 (2001).
  14. Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2, (2), 79-90 (2013).
  15. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (12), 861-871 (2010).
  16. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108, (3), 345-356 (2002).
  17. Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31, (3), 371-382 (2008).
  18. Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (1), 5121 (2009).
  19. Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73, (3), 1909-1917 (1999).
  20. Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11, (7), 1005051 (2015).
  21. Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12, (17), 6701-6708 (1984).
  22. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14, (5), 1235-1244 (1974).
  23. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189, (23), 8746-8749 (2007).
  24. Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
  25. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86, (18), 9708-9720 (2012).
  26. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  27. Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8, (5), 998-1009 (2013).
<em>In Vitro</em> SUMOylation analysen å studere SUMO E3 Ligase aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, W. S., Campbell, M., Kung, H. J., Chang, P. C. In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity. J. Vis. Exp. (131), e56629, doi:10.3791/56629 (2018).More

Yang, W. S., Campbell, M., Kung, H. J., Chang, P. C. In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity. J. Vis. Exp. (131), e56629, doi:10.3791/56629 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter