Summary
In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.
Abstract
Kleine ubiquitin-achtige modifier (SUMO) wijziging is een belangrijke posttranslationele wijziging (PTM) die bemiddelt signaaltransductie voornamelijk via het moduleren van eiwit-eiwitinteractie. Gelijkaardig aan wijziging van de ubiquitin, SUMOylation is geregisseerd door een cascade van de sequentiële enzym waaronder E1-activeren enzym (SAE1/SAE2), E2-conjugatie enzym (Ubc9) en E3-ligase (d.w.z., Pia's familie, RanBP2 en Pc2). Anders dan ubiquitination, een ligase E3 is echter niet-essentiële voor de reactie maar doet precisie en werkzaamheid voorzien in SUMO Woordherkomst en-opbouw. Aangepast door SUMOylation eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door in vivo test via immunoprecipitation met substraat-specifieke antilichamen en immunoblotting met SUMO-specifieke antilichamen. De demonstratie van eiwit SUMO E3 ligase activiteit vereist echter in vitro reconstitutie van SUMOylation tests met behulp van gezuiverde enzymen, substraat en SUMO eiwitten. Omdat in de reacties in vitro , meestal SAE1/SAE2 en Ubc9, alleen volstaan voor SUMO conjugatie, is verbetering van SUMOylation door een vermeende ligase E3 niet altijd gemakkelijk te ontdekken. Hier beschrijven we een gemodificeerde in vitro SUMOylation protocol waarmee consequent SUMO wijziging met behulp van een in vitro gereconstitueerd systeem. Een stapsgewijze protocol voor het zuiveren van catalytically actieve K-bZIP, een virale SUMO-2/3 E3 ligase, wordt ook gepresenteerd. De activiteiten van de SUMOylation van de gezuiverde K-bZIP staan op p53, een bekende doelstelling van SUMO. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor het ophelderen van de roman SUMO E3 ligases, maar ook voor het openbaren van de specificiteit van hun SUMO paralog.
Introduction
SUMO wijziging werd aanvankelijk geïdentificeerd als een omkeerbare posttranslationele modificatie (PTM) die proteïne stabiliteit1regelt. Naast directe conjugatie, kan SUMO ook worden verbonden aan een proteïne door niet-covalente interactie SUMO interactie motieven (SIMs)2. Vergelijkbaar met de binding van tyrosyl-fosforylering door moleculen herbergen Src homologie 2 (SH2) of phosphotyrosine binding (PTB) domeinen3,4, SUMO wijziging biedt een extra interactie platform voor selectieve aanwerving van SIM-bevattende effector eiwitten5,6. Naast regelgeving van signaaltransductie, SUMOylation van transcriptionele factoren en chromatine remodeling moleculen dienen te moduleren van gen expressie7,8. Studies van genoom-brede SUMOylation patronen is gebleken dat SUMO wijziging geassocieerd met positieve9,10 of negatieve10,11,12 transcriptie wordt verordening, deels wegens de specificiteit van de paralogue van SUMOylation.
Er zijn drie belangrijke SUMO isoforms voor proteïne conjugating van dit moment in de cellen van zoogdieren; het gaat hierbij om SUMO-1, en de zeer homologe SUMO-2 en SUMO-3 (hierna: SUMO-2/3)13. SUMO is meestal geconjugeerd aan het residu lysine (K) binnen het motief van de ψKxD/E consensus in het doel-eiwit. De SIM-kaart in SUMO E3 ligases is verantwoordelijk voor de paralogue specificiteit14. In tegenstelling tot ubiquitination trajecten met honderden E3 ligases, er alleen geweest een paar SUMO E3 ligases geïdentificeerd15. SUMO E3 ligases worden gedefinieerd door eigenschappen met inbegrip van hun vermogen om (i) Ubc9 binden, (ii) binden SUMO deel daarvan via een SIM-domein, en (iii) het verbeteren van SUMO overdracht van Ubc9 op substraat. Ligase E3 is niet absoluut vereist voor SUMO vervoeging16, maar biedt substraat en SUMO-paralogue specificiteit. Sinds meestal slechts een klein deel van de totale substraat proteïne SUMO-bewerkt is, is detectie van SUMOylated eiwitten in vivo altijd een uitdaging. Daarom, nauwkeurige en reproduceerbare testen nodig zijn om te verhelderen van de precieze functie van SUMO modificatie.
De in vitro SUMOylation assay, die resulteert in het vermogen van gezuiverde Ubc9 om SUMOylation van substraat eiwitten katalyseren, is een goed aanvaard assay voor het studeren SUMO wijziging17. Echter, SUMO E3 ligase activiteit in de meeste gevallen kan niet worden gedetecteerd of kan alleen worden gedetecteerd met gemuteerde SUMO ligase met SUMO E3 ligase hoogactieve en lage substraat specificiteit door het standaardprotocol vanwege de aanwezigheid van een overvloedige hoeveelheid Ubc918 . Het algehele succes van deze bepaling is grotendeels afhankelijk van de zorgvuldige titratie van gezuiverde Ubc9. De in vitro SUMOylation assay hier beschreven is aangepast ten opzichte van een standaard SUMOylation protocol (Zie Tabel van materialen). De waarneming van de toegenomen wereldwijde SUMO wijziging tijdens Kaposisarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) reactivering gevraagd ons te identificeren van de virale SUMO E3-ligase dat verantwoordelijk voor de up-regulatie van SUMOylation zijn kan. Naar aanleiding van een kleinschalige screening van de interacterende eiwitten van virale SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 werd geïdentificeerd als een roman substraat. In dit protocol tonen we in detail in insect cellen de stappen bij de expressie en de zuivering van wild-type K-bZIP, een virale SUMO E3 ligase met SUMO-2/3 specificiteit betrokken. Het vermogen van de gezuiverde K-bZIP ter verbetering van de SUMOylation van p53, een bekende SUMO substraat, wordt in aanwezigheid van verlaagde bedragen van E1 en E2 enzymen geëvalueerd. Deze gewijzigde SUMOylation assay kunnen, onderzoekers betrouwbaar definieert de capaciteiten van SUMO E3 ligase SUMOylate roman of bekende substraten, dat is een eerste stap in de studie van eiwit SUMOylation. Bovendien, deze methode helpt identificeren roman SUMO E3 ligases met lage ligase activiteit maar hoge substraat specificiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Baculovirus expressie constructies
-
SUMO E3 ligase K-bZIP zuiveren door de cDNA van K-bZIP19 klonen in een dual expressie baculovirus vector (zie tabel van materialen) met een N-terminal epitoop-tag. We hebben succes met behulp van een octapeptide-tag (aangegeven in het gehele protocol als vector-label-K-bZIP).
Opmerking: De DNA-sjabloon voor het klonen van K-bZIP polymerase kettingreactie (PCR) is cDNA omgekeerde transcriptie van RNA geïsoleerd uit TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 cellen na doxycycline behandeling20.- Breng de full-length K-bZIP cDNA19 in de dubbele expressie vector met Cpoik klonen van sites. CPO Ik verteren het PCR product en 1 µg van de vector dual expressie bij 37 ° C gedurende 3 h21.
- Scheiden en haal het verteerd DNA elektroforese aanleiding een 0,8% agarose gel22. Afbinden van de insert (K-bZIP) en vector door T4 DNA ligase bij 16 ° C gedurende 30 minuten volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
- Voeg 5 µL van afbinding van DNA tot 50 µL bevoegde E. coli cellen "A" (Zie Tabel van materialen) in een 1,5 mL-buis. Zet op het ijs gedurende 30 minuten. Vervolgens, Incubeer de 1,5 mL-buis in een waterbad van 42 ° C voor 45 s en onmiddellijk de buis op ijs gedurende 3 minuten.
- 600 µL S.O.C. medium (0,5% (w/v) gistextract, 2% (g/v) trypton 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4en 4% (m/v) glucose) toevoegen in de buis en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Centrifugeer vervolgens de buis bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten op 600 x g.
- Verwijder de bovendrijvende substantie, resuspendeer de pellet met 60 µL Luria Bertani medium (LB; 1% (m/v) trypton, 0,5% (w/v) gist extract, en 85 mM NaCl) en verspreid op LB agar platen met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de agarplaat bij 37 ° C gedurende 16 h23,24.
- Selecteer 1 kolonie om te enten in 5 mL LB opslagmedium met 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C gedurende 16 h met 250 t/min schudden. Dan, het uitpakken van de plasmide, vector-label-K-bZIP, door een plasmide extractie kit volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
-
Genereren van de recombinante bacmid herbergen van de tag-K-bZIP door omzetting van de vector-label-K-bZIP in bevoegde E. coli cellen "B" (zie tabel van materialen).
- Meng 0,2 µg vector-label-K-bZIP plasmide en 100 µL bevoegde E. coli cellen "B" in een tube 1,5 mL en put op ijs voor 30 min. Incubeer de buis in 42 ° C waterbad voor 45 s en onmiddellijk de buis op ijs gedurende 3 minuten.
- Voeg 900 µL van S.O.C. medium in de buis en Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur met rotatie op 50 rpm. Vervolgens nemen 10 µL van het medium, voeg een extra 50 µL van S.O.C medium verspreid over LB agar platen met 50 µg Mo/mL kanamycine, 7 µg/mL gentamicine, 10 µg/mL tetracycline, 100 µg/mL galactosidase substraat en 40 µg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ), en Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C.
- Inoculeer één witte kolonie in 5 mL LB opslagmedium met 50 µg Mo/mL kanamycine, 7 µg/mL gentamicine en 10 µg Fe/mL tetracycline. Incubeer bij 37 ° C met 250 t/min schudden voor 16 h.
- Isoleren van de recombinante bacmid DNA herbergen van de tag-K-bZIP, kwantificeren en resuspendeer bij een concentratie van 1 µg/µL25.
-
Genereren van recombinante baculoviruses tag-K-bZIP uitdrukken door transfecting 1 µg van recombinante bacmid DNA met label-K-bZIP in Sf9 cellen in één putje van de plaat van een 6-well.
- Zaad 2 x 106 Sf9 cellen (Zie Tabel van materialen) in 2 mL Grace Insect Medium geleverd met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% gentamicine in elk Nou van een 6 goed plaat, dan Incubeer bij 27 ° C gedurende 1 uur.
- Onderhouden van een logboek fase cultuur van Sf9 cellen in Grace Insect Medium geleverd met 10% FBS, gentamicine van 1% en 1% wasmiddel C (Zie Tabel van materialen) bij 27 ° C in orbitale schorsing bij 140 omwentelingen per minuut. Cellen met een hemocytometer en een trypan blauw kleuring; tellen levensvatbaarheid van de cellen groter is dan 95%. Handhaven van cellen met behulp van een subcultivation-verhouding van 1:3 elke 2-3 dagen (minimale dichtheid ~0.5 x 106 cellen/mL).
- Voeg 2 µL bacmid DNA (1 µg/µL) en 98 µL verminderd serum media (Zie Tabel van materialen) in een tube van 2 mL. Voeg vervolgens 4 µL transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) om de buis en meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg dit mengsel van transfectie (104 µL) in elk putje en Incubeer bij 27 ° C voor 12-16 h.
- Uitgeput media met behoedzame aspiratie verwijderen en vervangen door 2 mL verse Grace Insect voedingsbodem geleverd met 10% FBS en 1% gentamicine. De Sf9 cellen houden losjes aan het oppervlak van de plaat en zullen niet worden gestoord met behoedzame aspiratie.
-
Verzamelen van recombinante baculovirus na transfectie en versterken baculovirus om te verkrijgen van hoge-titer voorraden (P1) voor verdere experimenten.
- 72 uur na het wijzigen van medium, schraap de Sf9 cellen met behulp van een steriele cel lifter, verzamelen het supernatant van elk individuele putje in een tube 1,5 mL en vortex voor 10 s.
- Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 3 minuten op 150 x g. verzamelen bovendrijvende substantie als P0 baculovirus en aliquot in 1,5 mL buisjes (1 mL baculovirus in elke buis). Winkel bij-80 ° C.
- Zaad 1 x 107 Sf9 cellen in 10 mL Grace Insect Medium geleverd met 10% FBS en 1% gentamicine in een 10 cm petrischaal en Incubeer bij 27 ° C gedurende 1 uur.
- Voor versterking van recombinante baculoviruses waarin tag-K-bZIP, Voeg 0,5 mL P0 baculovirus aan de geplaatste Sf9 cellen en Incubeer bij 27 ° C gedurende 48 uur.
- Verzamelen bovendrijvende substantie als P1 baculovirus in een tube van 15 mL en de winkel bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
2. de zuivering van K-bZIP
- Onderhouden van een logboek fase cultuur van Sf9 cellen in Grace Insect Medium geleverd met 10% FBS, gentamicine van 1% en 1% wasmiddel C bij 27 ° C in orbitale schorsing bij 140 omwentelingen per minuut, zoals beschreven in stap 1.3.2.
- Op de dag van signaaltransductie, voeg 1 mL baculovirus-bevattende supernatant (P1) in 250 mL van Sf9 cellen met een bevolkingsdichtheid van 2 x 106 cellen/mL.
- Incubeer Sf9 cellen gedurende 72 uur bij 27 ° C op een roteerschudapparaat met 140 t/min schudden, dan verzamelen door centrifugeren bij 2,740 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijder de bovendrijvende vloeistof en lyse cel pellets in 10 mL lysis-buffermengsel (20 mM HEPES pH 7,9, 0.5 M NaCl, 1% wasmiddel proteaseinhibitor cocktail van een (Zie Tabel van materialen), 2% glycerol) en bij 50 rpm met behulp van een schorsing mixer bij 4 ° C gedurende 30 minuten draaien.
- Centrifuge cel lysate bij 15.000 x g gedurende 15 min voor het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
- Om te zuiveren tag-K-bZIP, Incubeer de cel lysates (10 mL) met 50 µL van antilichaam-gelabeld magnetische kralen in polypropyleen tubes van 14 mL en draaien op 50 rpm gedurende 3 uur bij 4 ° C met behulp van een schorsing mixer. De kralen bij 800 x g centrifugeren voor 30 na eiwit opname, pellet s bij 4 ° C. Allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen en resuspendeer de kralen in het restvolume voor ongeveer 1 mL overbrengen in een tube 1,5 mL voor wassen.
- Wassen van het geslagen eiwit door het plaatsen van de buis met de kralen op een magnetische standaard en verwijder het supernatant zodra de magnetische kralen hebben volledig gekleefd aan de kant van de buis.
-
Wassen van de kralen met lysis-buffermengsel viermaal.
- Voeg 1 mL lysis-buffermengsel in 1,5 mL buizen en omkeren van de buizen 10 keer. Plaats de buis 1,5 mL op een magnetische standaard en verwijder de bovendrijvende substantie zoals beschreven in punt 2.7.
- Herhaal de vorige stap 3 een andere keer.
-
De kralen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) keer wassen.
- Voeg 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4) in 1,5 mL buizen, en de buizen 10 keer omkeren.
- Zet de tube 1,5 mL op een magnetische standaard en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Elueer tag-K-bZIP eiwit uit de antilichaam-gelabeld magnetische kralen door toevoeging van 100 µL van 150 µg/mL octapeptide in PBS is verdund in een 1,5 mL-buis. De buis gedurende 10 minuten bij 50 t/min draaien door schorsing mixer bij kamertemperatuur. Vervolgens plaatst u de buis terug op de magnetische stand en verzamelen van het K-bZIP-bevattende supernatant in een schone 1,5 mL-buis.
- 1-5 µL gezuiverd tag-K-bZIP proteïne door SDS-PAGE gevolgd door Coomassie blue kleuring26analyseren. Laden 2 µg, 1 µg en 0,5 µg monsters van bovien serumalbumine (BSA) op het zelfde gel en gebruiken voor kwantificering met een beeld processing programma, zoals ImageJ. Schatten van de K-bZIP concentratie door vergelijking aan de normen van de BSA.
- De gezuiverde K-bZIP is nu klaar om te worden gebruikt in de assay van elke SUMOylation. Verdun de K-bZIP in PBS tot een eindconcentratie van 100 ng/µL en winkel in kleine porties bij-80 ° C.
3. SUMOylation test
- Voeg 3 µL van 100 ng/µL van gezuiverde tag-K-bZIP in de master mix van elke in vitro SUMOylation reactie. Componenten in master mix bevatten 1 µL eiwit buffer, 1 x SUMOylation buffer, 0,5 µL p53 proteïne (0,5 mg/mL), 25 nM E1 activeren enzym (voorraad conc.: 1 µM), 50 nM van E2 conjugating enzym (voorraad conc.: 10 µM), en 250 nM, elk van de SUMO peptiden (SUMO-1 , SUMO-2 of SUMO-3; voorraad conc.: 5 µM) tot een eindvolume van 17 µL.
- Meng de inhoud zachtjes en Incubeer de reactie bij 30 ° C voor 3 h. Zet de reactie Stop door toevoegen van 20 µL van 2 x SDS-pagina laden buffer (100 mM Tris-HCL, pH 6.8, 4% natrium dodecyl sulfaat, 0,2% (m/v) bromophenol blauw, 20% (v/v) van glycerol en 200 mM β-mercaptoethanol) en Het denatureren van de monsters bij 95 ° C gedurende 5 min.
-
Afzonderlijke monsters op SDS-pagina de gescheiden eiwitten op Membraan PVDF overbrengen met behulp van een semi-droge elektroforetische overdracht apparaat en analyseren door westelijke vlek met behulp van anti-p53 antilichaam.
- Instellen van het apparaat van de gel zoals in stap 2.11, en laadt 20 µL van monster in gel wells.
- De 10% gel worden uitgevoerd in een constante stroom bij 80 V voor ongeveer 120 minuten (totdat de kleurstof band de onderkant van de gel bereikt). Na voltooiing van elektroforese, uitschakelen naar de voeding.
- Koppel de gel toestellen en gel cassettes te nemen uit de gel en de gel in semi-droge overdracht buffer (48 mM Tris-HCl, 39 mM glycine, 20% methanol) voor 5 min zweven.
- Neem een andere container en geniet van het membraan PVDF in methanol voor 1 min. Vervolgens neemt van PVDF uit methanol en zet in semi-droge overdracht buffer. Zachtjes doorroeren het membraan gedurende 5 minuten.
- Verwijder het klepje van de veiligheid van het semi-droge elektroforetische apparaat.
- Vooraf NAT filtreerpapier, en bereiden een sandwich van de gel op de bodem platina anode als volgt: filtreerpapier, PVDF membraan, gel en filtreerpapier.
- Veilige kathode plaat en veiligheid cover, voer vlek op 15 V constante huidige voor 90 min. beurt uit de voeding, semi-droge apparaat en nemen het membraan PVDF.
- Blok PVDF membraan met een blokkeerbuffer (5% non-fat melk in buffer TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% wasmiddel B (Zie Tabel of Materials), pH 7,6)) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met 30 rpm schudden door rondschudapparaat.
- Kruisen het membraan PVDF met anti-p53 antilichaam verdund (1:1, 000) in blokkeerbuffer gedurende 12-16 uur bij 4 ° C met 30 rpm schudden met behulp van een schorsing mixer.
- Neem het membraan PVDF in een container en zet in TBST. Spoel PVDF membraan met TBST tweemaal meer.
- Geniet van het membraan PVDF in TBST voor 30 min met 45 rpm schudden door rondschudapparaat.
- Kruisen het membraan PVDF met anti-konijn antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) verdund (1:4, 000) in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 30 rpm schudden met behulp van een schorsing mixer.
- Het wassen van het membraan PVDF met TBST 3 keer zoals beschreven in stap 3.4.10.
- Geniet van het membraan PVDF in TBST voor 30 min met 45 rpm schudden met behulp van een schorsing mixer. Verwijder van TBST en voeg PBS voor het behoud van het membraan PVDF bij 4 ° C voor maximaal 12 h.
- Meng het reagens Verbeterde Chemiluminescentie substraat (ECL substraat) 1 en 2 (1:1) (Zie Tabel van materialen). Verwijder het membraan PVDF uit de PBS, blot kort met een papieren handdoek of lichte wisser overtollig vocht te absorberen, en onmiddellijk toevoegen 400 µL van ECL reagens op het oppervlak van elke membraan voor 3-5 min. verwijderen overtollige ECL reagens door kort bevlekken, maar laat niet de m embrane tot volledig droog.
- De vlek met een luminescentie imaging systeem of autoradiografie film27bloot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de informatie van de fabrikant, het forfaitaire bedrag van E1 en E2 enzym in de bepaling van de SUMOylation is 50 nM en 500 nM, respectievelijk. De minimale hoeveelheid E2 conjugating enzym Ubc9 welk vermag SUMOylate p53 werd eerst bepaald door een SUMOylation in vitro assay. Zo laag als een vijfde van het bedrag van de Ubc9 gebruikt in de standaard in vitro assay protocol van SUMOylation was in staat om efficiënt SUMOylate p53(Figuur 1). Daarom werd de helft van het bedrag van E1 enzym in combinatie met een tiende van de hoeveelheid Ubc9 in het standaard protocol gebruikt gebruikt voor een ander in vitro SUMOylation assay. Een aanzienlijke vermindering van de efficiëntie van de SUMOylation werd waargenomen ten opzichte van de standaard protocol (Figuur 1B).
Dus, het vermogen van SUMO E3 ligase K-bZIP ter verbetering van de p53 die sumoylation werd bepaald met behulp van deze bewerkt in vitro SUMOylation voorwaarden. Tagged K-bZIP gezuiverd van Sf9 cellen(Figuur 2)werkte in een SUMOylation reactie met lagere bedragen van E1 en E2 Ubc9 enzymen. Onder deze gewijzigde voorwaarden, K-bZIP efficiënt de SUMOylation van p53 kan katalyseren (Figuur 2B). Immunoblotting met anti-p53 antilichaam bevestigd de soortgelijke totaalbedragen van p53 in elke reactie, en ook de gedetecteerde SUMO p53 gewijzigd.
Figuur 1 : Bepaling van de minimale hoeveelheid SUMO enzymen gebruikt in de SUMOylation in vitro assay. (A) p53 die sumoylation werd beoordeeld in een in vitro SUMOylation bepaling die een halve en een vijfde de hoeveelheid Ubc9 enzym gebruikt in standaard protocol opgenomen. Na 3 uur in vitro SUMOylation reactie, SUMOylated p53 enzymen werden onderzocht door Western blot met anti-p53 antilichaam. (B) In vitro SUMOylation van p53 werd verder geanalyseerd met behulp van de helft van het bedrag van E1 enzym in combinatie met een tiende van de hoeveelheid Ubc9 gebruikt in het standaardprotocol. Een westelijke vlek werd uitgevoerd zoals beschreven in (A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Verhoging van de p53 SUMOylation door SUMO E3 ligase K-bZIP. (A) K-bZIP-eiwit baculovirus-uitgedrukt, geanalyseerd door SDS-PAGE volgde met Coomassie blue kleuring gezuiverd. 1 µg BSA en 10 µL gezuiverd K-bZIP de hoeveelheid eiwit voor vergelijkende werden geladen. (B) K-bZIP verbeterd p53 die sumoylation werd beoordeeld met behulp van een in vitro SUMOylation reactie met de helft van het bedrag van E1 enzym en een tiende van de hoeveelheid Ubc9 aanbevelen in het standaardprotocol. SUMOylated p53 werden onderzocht door westelijke vlek zoals beschreven in Figuur 1A. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in vitro SUMOylation protocol hier beschreven is routinematig gebruikt om de status van de SUMOylation van geïdentificeerde Ubc9 substraten. De belangrijkste beperking met behulp van het standaardprotocol te bestuderen van de SUMOylation functie van SUMO E3 ligase is de overvloed van het activeren van de SUMO E1 en E2 conjugating enzymen Ubc9 die maximaliseren van de SUMO vervoeging in in vitro -systemen. Gezien deze uitdaging, wij zijn van mening dat titratie van het bedrag van SUMO E1 en E2 enzymen naar het niveau dat een nauwelijks dat hun activiteit in SUMOylation is de enige manier mogelijke detecteren kan om SUMO E3 ligase katalytische activiteiten met behulp van deze in vitro SUMOylation systeem. Na deze hypothese, we met succes de activiteit ligase E3 van K-bZIP toegelicht en geïdentificeerd als een roman SUMO E3-ligase met specificiteit richting SUMO-2/3.
De kritieke stap in het protocol is de integratie van lagere bedragen van E1 en E2. Met behulp van deze lagere bedragen, zoals weergegeven in Figuur 2, roman SUMO E3 ligases met lage ligase activiteit mogelijk worden geïdentificeerd met behoud van hun specificiteit naar substraat en SUMO paralogues. Een belangrijke beperking van de techniek is de eis voor een kwalitatief hoogwaardige antilichaam herkennen het substraat SUMO, omdat slechts een zeer klein deel van het substraat SUMO bewerkt kan worden.
Hoewel veel eiwitten Toon de potentie om de SUMOylation te verhogen na overexpressie in vivo, moet definiëren een SUMO E3-ligase worden aangetoond door een gereconstitueerd in vitro SUMOylation systeem met behulp van gezuiverde E1, E2 en E3 enzymen. In tegenstelling tot de honderden en misschien wel duizenden ubiquitin E3 ligases geïdentificeerd, tot nu toe zijn alleen een paar SUMO E3 ligases bevonden. Dit kan te wijten zijn aan het gebruik van de traditionele standaard in vitro SUMOylation bepaling die maximaliseert SUMO vervoeging efficiëntie en dus de functie van de SUMOylation van potentiële SUMO E3 ligases belemmert. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en consistente assay om sonde SUMOylation versterkt door een SUMO E3-ligase. De beschreven methode is essentieel voor de identificatie en karakterisering van nieuwe SUMO E3 ligases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs vermelden geen potentiële belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en technologie (meeste, 105-2320-B-010-007-MY3 naar PCC), van de National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC naar PCC), van het ministerie van wetenschap en technologie (meest 105-2314-B-400-019 naar HJK) en van de National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 tot HJK). Dit werk werd ook ondersteund deels met de nationale universiteit van de Yang-Ming op PCC publicatie manuscript. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking van of reparatie van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
