Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

सुप्त Daphnia magnaका पुनरुत्थान: प्रोटोकॉल और अनुप्रयोग

Published: January 19, 2018 doi: 10.3791/56637
Automatic Translation
1, 1
1Environmental Genomics Group, School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

दीर्घकालिक अध्ययन विकास और अनुकूलन के तंत्र की प्रक्रिया को समझने के लिए आवश्यक हैं । सामान्यत: इन अध्ययनों से शोधकर्ताओं के जीवन-समय से परे कमिटमेंट की आवश्यकता होती है । यहां, एक शक्तिशाली तरीका वर्णित है कि नाटकीय रूप से अग्रिम राज्य के अत्याधुनिक डेटा संग्रह के लिए प्राकृतिक प्रणालियों में अनुदैर्ध्य डेटा उत्पंन करते हैं ।

Abstract

दीर्घकालिक अध्ययन पारिस्थितिकी की पहचान-विकासवादी प्रक्रियाओं है कि विस्तारित समय अवधि खत्म हो सक्षम करें । इसके अलावा, वे प्रमुख अनुभवजंय डेटा है कि भविष्य में पर्यावरण परिवर्तन के लिए प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों के विकासवादी प्रतिक्रियाओं का पूर्वानुमान करने के लिए अनुमानित मॉडलिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करते हैं । हालांकि, कुछ असाधारण मामलों को छोड़कर, लंबी अवधि के अध्ययन के कारण उपस्कर लौकिक नमूनों तक पहुंचने के साथ जुड़े कठिनाइयों के दुर्लभ हैं । लौकिक गतिशीलता अक्सर प्रयोगशाला में या असाधारण अध्ययन है कि जंगली में प्राकृतिक आबादी के विकास के पुनर्निर्माण के साथ नियंत्रित mesocosm प्रयोगों में अध्ययन कर रहे हैं ।

यहां, एक मानक संचालन प्रक्रिया (शराबी) को पुनर्जीवित या जीवित निष्क्रिय Daphnia magna, जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक व्यापक zooplankton कीस्टोन प्रजातियों के लिए प्रदान की जाती है, को नाटकीय रूप से राज्य के अत्याधुनिक अनुदैर्ध्य डेटा संग्रह में अग्रिम प्राकृतिक प्रणालियों । जी उठने पारिस्थितिकी के क्षेत्र Kerfoot और सह कार्यकर्ताओं द्वारा १९९९ में परिभाषित किया गया था, भले ही diapausing zooplankton अंडे सेने में पहला प्रयास देर से 1980 के दशक के लिए वापस तिथि । के बाद से है Kerfoot लाभदायक कागज, zooplankton प्रजातियों जी उठने की कार्यप्रणाली में तेजी से अक्सर लागू किया गया है, हालांकि प्रयोगशालाओं के बीच ही प्रत्यक्ष ज्ञान हस्तांतरण के माध्यम से प्रचारित । यहां, एक शराबी वर्णित है कि सुप्त Daphnia magna अंडे जीवित करने के अभ्यास पर एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।

दो प्रमुख अध्ययनों में प्रदान की गई है जिसमें जीवित Daphnia magna आबादी की फिटनेस प्रतिक्रिया वार्मिंग को मापा जाता है, एक ही सेटिंग में ऐतिहासिक और आधुनिक आबादी का अध्ययन करने की क्षमता पर कैपिटल । अंत में, पुनर्जीवित या अभी भी निष्क्रिय चरणों के लिए अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के आवेदन पर चर्चा की है । इन प्रौद्योगिकियों प्रक्रियाओं और विकास के तंत्र विदारक में अभूतपूर्व शक्ति प्रदान अगर आबादी है कि समय के साथ चयन के दबाव में परिवर्तन का अनुभव किया है पर लागू ।

Introduction

दीर्घकालिक अध्ययन पारिस्थितिकी और प्रकृति में विकासवादी प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और कैसे प्रजातियों का आकलन करने के लिए पर्यावरण के परिवर्तन के दौरान1का जवाब और बनी रहती है । इसका कारण यह है पारिस्थितिकी विकासवादी प्रक्रियाओं पीढ़ियों और पर्यावरण में परिवर्तन के पार हो लंबे समय spans पर होते हैं । इसके अलावा, दीर्घकालिक अध्ययन प्रमुख अनुभवजंय डेटा है कि पूर्वानुमान मॉडलिंग की सटीकता में सुधार करने के लिए प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों के विकासवादी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए पर्यावरणीय परिवर्तन2प्रदान करते हैं । इन मॉडलों की सटीकता के लिए जैव विविधता और पारिस्थितिकी तंत्र सेवाओं के संरक्षण के लिए प्रबंधन और संरक्षण रणनीतियों को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

कुछ असाधारण मामलों को छोड़कर (उदा, गैलापागोस डार्विन finches3 और शैवाल4), दीर्घकालिक अध्ययन मुख्यतः कम पीढ़ी के समय है कि प्रयोगशाला में प्रचारित किया जा सकता है के साथ प्रजातियों के लिए सीमित कर रहे है5,6 , 7 , 8. इसलिए, प्रक्रियाओं underpinning विकासवादी गतिशीलता मायावी रहते हैं । रसद की वजह से लौकिक नमूनों तक पहुंचने के साथ जुड़े कठिनाइयों का, अनुभवजंय डेटा अधिक बार एक अस्थाई संदर्भ की तुलना में एक स्थानिक में अध्ययन कर रहे हैं, और लौकिक पारिस्थितिकी विकास प्रक्रियाओं आस्थगित या स्थानिक डेटा से मॉडलिंग कर रहे हैं । इस दृष्टिकोण के लिए अंतरिक्ष के रूप में जाना जाता है ' समय ' प्रतिस्थापन9, जिससे अंतरिक्ष एक किराए के लिए लौकिक विकासवादी गतिशीलता अध्ययन के रूप में अपनाया है । ' अंतरिक्ष के लिए समय ' प्रतिस्थापन की मुख्य सीमा है कि विभिंन स्थानिक तराजू पर अनुकूलन की दर एक ही आबादी में लौकिक परिवर्तन से अलग; इसलिए, अंतरिक्ष के साथ समय की प्रतिस्थापन के आधार पर निष्कर्ष10पक्षपातपूर्ण हैं ।

एक शक्तिशाली विकल्प है कि समय के साथ प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों में विकासवादी गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देता है पारिस्थितिकी और आनुवंशिक परिवर्तन का विश्लेषण प्रजातियों में निष्क्रिय चरणों का उत्पादन11है । इन निष्क्रिय चरणों स्तरीकृत जैविक अभिलेखागार है कि सही ढंग से दिनांकित किया जा सकता है और paleolimnologically12,13विशेषता फार्म जमा । महत्वपूर्ण बात, इन निष्क्रिय चरणों पुनर्जीवित और प्रयोगशाला प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां पर्यावरण को बदलने के लिए उनके विकासवादी प्रतिक्रिया सीधे मापा जा सकता है । ऐतिहासिक आबादी उनके आधुनिक वंश विकसित करने के लिए फिटनेस परिवर्तन और पर्यावरण परिवर्तन के साथ कदम में विकसित जीन के समारोह का अध्ययन14,15,16के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की जा सकती है ।

सुप्त अवस्थाओं में बीज, अल्सर, बीजाणु, और अंडा बैंक शामिल हैं । हालांकि पुनर्जीवित निष्क्रिय अंडे पर पहले अध्ययन के देर से 1980 के दशक के लिए वापस तिथियां17, और अध्ययन के एक मुट्ठी 1990 के दशक में इस तकनीक को लागू किया है18,19, जी उठने पारिस्थितिकी के क्षेत्र में औपचारिक रूप से किया गया है Kerfoot और सह के लाभदायक कागज १९९९ में कार्यकर्ताओं द्वारा स्थापित20। इस अभ्यास में मुख्य रूप से मीठे पानी प्रजातियों17,21,22के paleolimnological पुनर्निर्माण में लागू किया गया है । हालांकि, एक शराबी अभी तक उपलब्ध नहीं है । यहां, zooplankton प्रजातियों के सुप्त अंडे के लिए लागू पुनर्जीवन प्रोटोकॉल का एक कदम दर कदम विवरण Daphnia magna , hatchlings से क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना के लिए तलछट के नमूने से प्रदान की जाती है । शराबी के कदम है कि आसानी से Daphniaकी अंय प्रजातियों के लिए हस्तांतरणीय हैं, साथ ही कदम है कि अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, पर चर्चा कर रहे हैं ।

Daphnia ताजे पानी के lotic निवास23 के बहुमत में मौजूद zooplankters हैं । Daphnia प्रजातियों या तो बाध्य अलैंगिक या चक्रीय parthenogens हैं । D. magna एक चक्रीय parthenogen कि अनुकूल पर्यावरण की स्थिति24के तहत क्लोनिंग reproduces है । जब पर्यावरण की स्थिति बिगड़ती है, पुरुष उत्पादन होता है और यौन संयोजन निषेचित अंडे के गठन की ओर जाता है कि एक काइटिन मामले द्वारा पर्यावरण से सुरक्षित निद्रा के एक राज्य में प्रवेश ephippium कहा जाता है । इन निष्क्रिय अंडे का अनुपात हैच जब अनुकूल पर्यावरण शर्तों वापस । हालांकि, सुप्त अंडा बैंक का एक बड़ा अनुपात कभी नहीं हैच करने के लिए एक मौका है और इस तरह समय के साथ जैविक अभिलेखागार का निर्माण । निष्क्रिय चरणों झीलों और तालाबों की तलछट में दफन रहते है और विस्तारित समय अवधि में विकासवादी गतिशीलता के अध्ययन के लिए पुनर्जीवित किया जा सकता है । क्योंकि डी magna के सुप्त अंडे यौन संयोजन का परिणाम हैं, वे प्रजातियों के प्राकृतिक आनुवंशिक विविधता का एक अच्छा प्रतिनिधित्व कर रहे है25। इसके अलावा, वे प्रयोगशाला में क्लोनल प्रजनन के माध्यम से बनाए रखा जा सकता है । इन विशेषताओं isogenic मॉडल जीवों का अनूठा लाभ प्रदान करते हैं, जबकि प्राकृतिक आनुवंशिक विविधता को बनाए रखने ।

दो प्रमुख अध्ययनों से सीधे समय के साथ पर्यावरण चयन दबाव का सामना कर डी. magna की एक ही आबादी के ऐतिहासिक और आधुनिक वंश की तुलना के लाभों को प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । D. magna नमूनों झील की अंगूठी (डेनमार्क), एक उथले (5 मीटर गहराई; सतह 22 हेक्टेयर) मिश्रित तालाब है कि औसत तापमान और समय के साथ गर्मी की लहरों की घटना में वृद्धि का अनुभव किया है से पुनर्जीवित थे । D. magna (उप) आबादी इस लौकिक ६० वर्ष फैले ढाल (1960-2005) और तापमान वार्मिंग के लिए विकासवादी प्रतिक्रिया की जांच का अध्ययन के साथ पुनर्जीवित किया गया । एक आम बगीचे प्रयोग में पहले अध्ययन में, फिटनेस में परिवर्तन से जुड़े जीवन इतिहास लक्षण के तापमान में वृद्धि के जवाब में मापा गया + 6 ° c, आगामी १०० वर्ष के लिए जलवायु परिवर्तन के लिए अंतरराष्ट्रीय पैनल की भविष्यवाणियों के साथ लाइन में 26. दूसरे अध्ययन में, एक mesocosm प्रयोग वार्मिंग के तहत तीन (उप) आबादी की प्रतिस्पर्धात्मक क्षमताओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन प्रयोगों संयुक्त बताते है कि केवल तनाव के रूप में वार्मिंग की उपस्थिति में, सभी जीवन के इतिहास लक्षण और आबादी प्लास्टिक के एक उच्च स्तर दिखाने के लिए और समान प्रतिस्पर्धी क्षमता है । इन निष्कर्षों का सुझाव है कि एक तनाव के रूप में वार्मिंग महत्वपूर्ण फिटनेस की लागत को लागू नहीं करता है, कम जनसंख्या में यहां का अध्ययन किया ।

Protocol

निंनलिखित घूस एक कदम-दर-कदम Daphnia magna निष्क्रिय अंडे, नमूने, तलछट से ephippia के अलगाव, और क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना का एक विस्तृत विवरण सहित, जीवित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का विवरण प्रदान करता है ( चित्र 1) ।

Figure 1
चित्रा 1: कदम दर कदम गाइड Daphnia magna के पुनरुत्थान के लिए । एक प्राकृतिक मीठे पानी का निवास स्थान (ए) से तलछट एक पिस्टन corer (बी) के साथ नमूना है । तलछट कोर (सी) 1 या ०.५ सेमी (डी) की वृद्धिशील परतों में कटा हुआ है । तलछट की प्रत्येक परत (4 डिग्री सेल्सियस) अंधेरे और ठंड की स्थिति में एक नमूना ज़िप लॉक बैग (ई) में संग्रहित किया जाता है । तलछट की प्रत्येक परत तौला और भूवैज्ञानिक छलनी का उपयोग कर छलनी (1 मिमी और १२५ µm मेष आकार, च) । सफेद पृष्ठभूमि ट्रे Daphnia magna ephippia (जी) को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । Decapsulated निष्क्रिय अंडे (एच) पेट्री व्यंजन को हस्तांतरित कर रहे है और प्रकाश और तापमान उत्तेजनाओं को उजागर करने के लिए सेने प्रेरित । Hatchlings isoclonal लाइनों को स्थापित करने के लिए अलग जार (I) को हस्तांतरित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

1. तलछट कोर के नमूने

  1. एक पिस्टन corer का उपयोग झीलों या तालाबों से नमूना तलछट । इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया बिग बेन27, लंबाई में 14 सेमी की एक आंतरिक ट्यूब व्यास के साथ लगभग १.५ मीटर की एक कोर ट्यूब । बिग बेन एक रस्सी और एक corer सिर पर एक पिस्टन के होते हैं, जो छड़ को तलछट में ट्यूब ड्राइव संलग्न हैं । एक कोर कैच जब तलछट से भरा कोर ट्यूब के समर्थन एड्स । तलछट बाहर निकालना करने के लिए, एक रूपरेखा कोर ट्यूब ईमानदार और स्थिर रहता है, और एक संशोधित बोतल जैक बाहर निकालना प्रक्रिया (अनुपूरक वीडियो 1) के दौरान पिस्टन ऊपर की ओर धक्का करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    1. गहराई में से कम 1 मीटर के उथले तालाबों के लिए, मैन्युअल रूप से तलछट में धकेल दिया व्यास के कोई अधिक से अधिक 6 सेमी की एक सामिल गुरुत्वाकर्षण corer का उपयोग करें ।
    2. गहरी झीलों के लिए (> गहराई के 6 मीटर), एक लंगर पीपे नाव के एड्स के साथ Livingston पिस्टन corers28 या एकल ड्राइव ग्रिफ़िथ तलछट corers का उपयोग करें । लिविंगस्टोन-प्रकार ड्राइव रॉड पिस्टन corer के बारे में 30 मीटर गहरी करने के लिए एक समेकित झील तलछट के लिए नरम की लगातार एक मीटर ड्राइव इकट्ठा करने के लिए गहरे पानी में इस्तेमाल किया जा सकता है । एकल ड्राइव ग्रिफ़िथ corer एक सरल लेकिन मजबूत कोर सिर है कि लिविंगस्टोन ड्राइव छड़ को मानक पाली कार्बोनेट ट्यूबों जोड़ता है के होते हैं । corers छड़ के साथ तलछट में धकेल दिया जाता है, और एक पिस्टन तलछट की वसूली के लिए आवश्यक चूषण प्रदान करता है (चित्रा 2) ।
    3. निरंतर, अबाधित कोर को पुनर्प्राप्त करने के लिए, vibracoring का उपयोग करें । ये corers पानी की गहराई की एक किस्म पर काम करते हैं और विभिन्न लंबाई के कोर नमूने प्राप्त कर सकते हैं, तलछट lithology के आधार पर. कम आयाम कंपन है कि vibracore सिर से नीचे संलग्न बैरल या कोर ट्यूब liquefies तलछट के माध्यम से स्थानांतरित कर रहा है, कोर vibracore इकाई से जुड़ी बैरल को सक्षम करने के लिए तरलीकृत तलछट में घुसना । कुछ vibracorers छोटे, हल्के, और पोर्टेबल हैं, दूसरों को बड़े भारी इकाइयों कि केवल बड़े जहाजों से तैनात किया जा सकता है । corers का चुनाव तलछट के lithology पर निर्भर करता है.
  2. एक फ्लैट धातु की सतह (अनुपूरक वीडियो 1) का उपयोग कर 1 सेमी या उससे कम की वृद्धिशील परतों में क्षैतिज कोर टुकड़ा । तलछट corers यहां इस्तेमाल किया एक तरह बाहर निकालना पर हीड्रास्टाटिक दबाव को कम करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, तलछट परतों की अशांति को कम करने । जब अंय corers उपयोग किया जाता है, प्रत्येक तलछट परत के बाहरी छिलका एक कुकी कटर तरह ब्लेड के साथ हटाया जा सकता है परतों के बीच संदूषण सीमा ।
  3. एक अलग नमूना बैग (अनुपूरक वीडियो 1) में प्रत्येक तलछट परत ले लीजिए, और अंधेरे और ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) की स्थिति में दुकान ।
  4. radiometric डेटिंग के लिए सभी परतों से तलछट के 5 जी की एक ंयूनतम ले लीजिए । radiometric डेटिंग के रूप में डेटिंग परख का एक विस्तृत विवरण के लिए एक स्थापित प्रोटोकॉल है, मौजूदा प्रकाशन12,13को देखें ।

Figure 2
चित्रा 2: पिस्टन coring प्रक्रिया के कार्टून । पिस्टन corer, एक आंतरिक फिसलने सील (पिस्टन) है कि एक कमजोर शूंय पैदा के साथ एक खोखले ट्यूब । जब पिस्टन तलछट-पानी इंटरफेस को छूता है, वजन तलछट में कोर बैरल धक्का और निर्वात तलछट में प्रवेश करने के लिए और तलछट परतों परेशान बिना ट्यूब ऊपर ले जाने के लिए कोर किया जा रहा है का कारण बनता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

२. तलछटी परतों का Sieving

  1. एक सटीक पैमाने का उपयोग करना, भविष्य के संदर्भ के लिए प्रत्येक तलछट परत तौलना । झील में प्रजातियों के घनत्व की गणना करने के लिए सतह क्षेत्र और वजन का उपयोग करें ।
  2. दो भूवैज्ञानिक छलनी एक दूसरे के शीर्ष पर ढेर का उपयोग कर प्रत्येक तलछट परत छलनी । पहले छलनी 1 मिमी का एक जाल आकार है और मिट्टी, बड़े अकशेरूकीय और कण अलग, जैसे बीज, पौधों, और कीड़ों, तलछट के शेष से । दूसरी चलनी १२५ µm की एक जाल है और तलछट (अनुपूरक वीडियो 2) के शेष से घ. manga ephippia और छोटे कण अलग ।
  3. एक सफेद पृष्ठभूमि ट्रे के लिए १२५ µm मेष छलनी पर एकत्र तलछटी अंश के छोटे aliquots स्थानांतरण । तलछट के प्रकार पर निर्भर करता है, तलछट के छोटे या बड़े aliquots हर समय स्थानांतरित किया जा सकता है ।
    1. नमूना सफेद ट्रे के लिए मध्यम के छोटे खंड (२०० मिलीलीटर) को फिर से स्थानांतरित करने के लिए तबादला अवसादी अंश को जोड़ने और ephippia की आंख खोलना (चित्रा 3) की सुविधा । तलछट को पुनर्निलंबित करने के लिए प्रयोग किया जाने वाला मध्यम dechlorinated नल का जल, बोरहोल जल, कॉंबो29, या एडम मीडियम (Aachener Daphnien)30हो सकता है । इसके बाद, ' माध्यम ' शब्द का उपयोग या तो सभी सूचीबद्ध समाधानों को संदर्भित करने के लिए किया जाएगा ।

Figure 3
चित्र 3: Daphnia magna ephippium । सुप्त Daphnia magna अण्डे के तुरंत बाद decapsulation । ephippium (ए), भीतरी अंडा झिल्ली (ख), और निष्क्रिय अंडे (सी) दिखाया गया है। स्केल बार = ५०० µm ।

3. Ephippia और सेने का Decapsulation

  1. एक डिस्पोजेबल पाश्चर पिपेट के साथ या microdissection संदंश का उपयोग कर, ephippia मध्यम के 10 मिलीलीटर से भरा व्यंजन के लिए व्यक्तिगत पेट्री हस्तांतरण । तलछट की परत के प्रति कम से पेट्री पकवान का प्रयोग करें ।
  2. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, decapsulate काइटिन केस (अनुपूरक वीडियो 3) खोलने के लिए मजबूर करके microdissection संदंश का उपयोग कर प्रत्येक ephippia. आराम अंडा भीतरी झिल्ली नाजुक निकालें, ध्यान दे अंडे को बाधित नहीं है, और उंहें पेट्री एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर माध्यम से भर पकवान को हस्तांतरण । Decapsulation वृद्धि में सफलता सेने डी magna; हालांकि, यह आवश्यक नहीं हो सकता है या यह छोटे ephippia उत्पादन अन्य Daphnia प्रजातियों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
  3. एक पूर्ण स्पेक्ट्रम के लिए decapsulated अंडे का पर्दाफाश लंबे दिन photoperiod प्रकाश (16:8 प्रकाश: डार्क) और उच्च तापमान (20 ± 1 ° c) एक नियंत्रित तापमान डिवाइस (मशीन) या कमरे में सेने के लिए प्रेरित करने के लिए । सेने ४८ एच और कई हफ्तों के बीच होता है (चार तक; अनुपूरक वीडियो 4) । decapsulation की अनुपस्थिति में, सीधे (लंबे दिन photoperiod प्रकाश (16:8 प्रकाश: डार्क) और उच्च तापमान (20 ± 1 डिग्री सेल्सियस)) सेने उत्तेजनाओं के लिए ephippia का पर्दाफाश ।

4. Daphnia magna की Isoclonal लाइनें स्थापित करना

  1. एकल hatchlings से isoclonal लाइनों को एक डिस्पोजेबल पाश्चर पिपेट का उपयोग कर मध्यम के २०० मिलीलीटर से भरा अलग जार करने के लिए ३.३ चरण से अलग से स्थानांतरित करके स्थापित करें । प्रत्येक व्यक्ति आनुवंशिक रूप से अलग है, यौन संयोजन का परिणाम जा रहा है ।
  2. isoclonal लाइनों को बनाए रखने के शेयर शर्तों में अनिश्चित काल के 10 ± 1 ° c, 16:8 प्रकाश: डार्क शासन, ०.२ मिलीग्राम सी के साथ साप्ताहिक फेड/ Chlorella या अंय हरी शैवाल (जैसे, Scenedesmus obliquus) के एल । मध्यम हर तीसरे सप्ताह नवीनीकृत । स्टॉक शर्तों तापमान, खिला शासन, और प्रजातियों के साथ बदल सकते हैं ।

5. मुख्य अध्ययन

नोट: दो प्रमुख अध्ययनों का विवरण प्रदान किया गया है जिसमें D. magna (उप) झील की अंगूठी के अवसादी संग्रह से आबादी (डेनमार्क) वार्मिंग के लिए विकासवादी प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । तीन (उप) आबादी निंनलिखित समय अवधि: 1960-1970, 1970-1985, और > 1999 से पुनर्जीवित किया गया । डी magna अवसादन पुरालेख से सेने सफलता 11 और ५८% (चित्रा 4) के बीच की दूरी पर । प्रत्येक timeperiod से प्राप्त hatchlings से, यहां वर्णित दो प्रमुख अध्ययनों के लिए एक यादृच्छिक सबसेट चुना गया था । इन अध्ययनों का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था कि क्या (उप) जनसंख्या तापमान ढाल के साथ अलग समय अवधि से पुनर्जीवित स्वास्थ्य में मतभेद-जुड़े जीवन के इतिहास लक्षण (५.१) दिखाया, और क्या वे अलग प्रतियोगी क्षमता थी (५.२) वार्मिंग के लिए जोखिम के बाद ।

Figure 4
चित्रा 4: एक अवसादी संग्रह झील की अंगूठी से नमूना में सेने सफलता । महत्वपूर्ण अध्ययन में प्रयुक्त झील की अंगूठी के अवसादी संग्रह के साथ सफल hatchlings के अनुपात । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. आम बगीचे प्रयोगों
    1. हस्तांतरण दस hatchlings प्रति (उप) शेयर संस्कृतियों से आम बगीचे की स्थिति के लिए जनसंख्या: 16 ° c; लांग photoperiod (16:8 प्रकाश: डार्क शासन); Chlorellaके ०.८ मिलीग्राम C/L के साथ दैनिक फ़ीड, और हर दूसरे दिन मध्यम नवीनीकृत । hatchlings को आम बगीचे की स्थितियों में कम से दो पीढ़ियों के लिए बनाए रखें (ca. ४५ दिन) । आम बगीचे की स्थिति मातृ प्रभाव से हस्तक्षेप को कम करने और hatchlings के बीच प्रजनन सिंक्रनाइज़ ।
    2. चिंता चैंबर में दूसरी चिंता की रिहाई पर, दूसरी पीढ़ी से वयस्क महिलाओं के हस्तांतरण के लिए ५०० मिलीलीटर मध्यम से भरा जार जब तक वे किशोरों की दूसरी चिंता जारी ।
    3. बेतरतीब ढंग से 24-48 एच, दूसरी पीढ़ी की दूसरी चिंता से पैदा हुए, १०० मिलीलीटर मध्यम से भरा जार और निंनलिखित प्रयोगात्मक स्थितियों से अवगत कराया के व्यक्तिगत किशोरों स्थानांतरण: 18 ° c (झील में वर्तमान तापमान) और 24 ° c (वार्मिंग, तापमान आगामी १०० वर्ष के लिए आईपीसीसी 26 द्वारा पूर्वानुमानित), 16:8 प्रकाश: डार्क शासन, और फ़ीड दैनिक ०.८ मिलीग्राम C/ Chlorellavulgarisके एल ।
    4. प्रत्येक प्रयोगात्मक पशु पर, सिर और पूंछ रीढ़ (चित्रा 5) के आधार के बीच की दूरी के रूप में एक stereomicroscope के साथ परिपक्वता पर आकार को मापने । प्रत्येक जानवर तस्वीर और बाद में एक उपयुक्त छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अपने आकार का विश्लेषण ।
    5. परिपक्वता पर उंर उपाय: जिस दिन में अंडे चिंता चैंबर में पहली बार के लिए मनाया जाता है ।
    6. मृत्युदर को मापने: प्रयोग के दौरान विलुप्त व्यक्तियों की संख्या ।
    7. fecundity को मापने: प्रथम और द्वितीय क्लोनल प्रजनन में जारी वंश की कुल संख्या ।
    8. जनसंख्या वृद्धि दर को मापने, Euler के समीकरण का उपयोग अनुमानित (1):
      Equation1)
      जहां एलx आयु xमें जीवित रहने के अनुपात है, बीएक्स नवजात की संख्या एक्समें जीवित व्यक्ति प्रति उत्पादित है, और आर प्राकृतिक वृद्धि की आंतरिक दर है ।
    9. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण करें । यहाँ, ggplot2 पैकेज का उपयोग कर, प्रत्येक जीवन इतिहास विशेषता के लिए प्रतिक्रिया मानदंडों (एक एकल जीनोटाइप के वातावरण में phenotypic अभिव्यक्ति) की साजिश करने के लिए आर31 का उपयोग करें । जीवन रक्षा विश्लेषण (आर पैकेज rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf) के माध्यम से जनसंख्या प्रति मृत्यु दर की गणना । अंत में, (ANOVA, तालिका 2) आर31 में विचरण का एक विश्लेषण प्रदर्शन का आकलन है कि लक्षण पर तापमान के प्रभाव को विकास द्वारा समझाया जा सकता है (आबादी के बीच अंतर), प्लास्टिक (उपचार के लिए प्रतिक्रिया), या के विकास प्लास्टिक (जनसंख्या एक्स उपचार) ।
  2. स्पर्धेचे प्रयोग
    1. हस्तांतरण दस hatchlings शेयर संस्कृतियों से प्रति जनसंख्या आम बगीचे की स्थिति के लिए: 20 ° c, लंबे समय तक photoperiod (16:8 प्रकाश: डार्क शासन), दैनिक फ़ीड के साथ ०.८ मिलीग्राम C/ Chlorella के, और मध्यम हर दूसरे दिन नवीनीकृत । मातृ प्रभाव से व्यवधान को कम करने के लिए कम-से-कम दो पीढ़ियों (ca. ४५ दिन) के लिए आम बगीचे की स्थिति बनाए रखें ।
    2. बेतरतीब ढंग से प्रत्येक hatchling की दूसरी पीढ़ियों के दूसरे के लिए प्रयोगात्मक mesocosms (20 एल प्लास्टिक aquaria माध्यम से भरा), triplicates में, 10 पशुओं के घनत्व पर से 24 से ४८ ज के पांच किशोर आवंटित/
    3. 24 ° c, 16:8 L:D शासन को mesocosms बेनकाब, और एक नियंत्रित तापमान कक्ष या मशीन में चार सप्ताह (> 3 क्लोनल पीढ़ियों) की एक ंयूनतम के लिए ०.८ मिलीग्राम C/ Chlorellavulgaris के साथ दैनिक फ़ीड ।
    4. चुनना प्रत्येक mesocosm साप्ताहिक, मध्यम के 10% ताज़ा करने के लिए एक जनसंख्या गतिशील अनुकरण है कि Daphnia प्राकृतिक वातावरण में मुठभेड़ हो सकता है । प्रत्येक मछलीघर से मध्यम और जानवरों की एक ज्ञात मात्रा को हटाने के द्वारा मुर्गियों थोपना (इस मामले में १.२ L), और ताजा माध्यम के साथ अख़बारों की मात्रा बदलकर. प्रायोगिक पशुओं के परिपक्वता (दिन 10) तक पहुंचने के बाद मुर्गियों शासन प्रारंभ करें ।
    5. चौथे सप्ताह के अंत में, प्रत्येक mesocosm से ३२ पशुओं के नमूने प्रारंभिक इनोक्युलम की तुलना में genotypic संरचना में बदलाव का आकलन करने के लिए ।
      1. microcentrifuge ट्यूबों में व्यक्तिगत Daphnia प्लेस और एक पाश्चर पिपेट की मदद से अतिरिक्त तरल निकालें ।
      2. फ्लैश तरल नाइट्रोजन में व्यक्तिगत ट्यूबों फ्रीज और दुकान पर-८० ° c ।
      3. उपलब्ध प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकल व्यक्तियों से जीनोमिक डीएनए निकालें और निर्माता के निर्देशों का पालन ।
      4. hatchling प्रति एक अद्वितीय multilocus जीनोटाइप प्रदान करने के लिए पर्याप्त आनुवंशिक मार्करों के एक नंबर का उपयोग कर निकाले डीएनए बढ़ाना. यहाँ एक एकल मल्टीप्लेक्स (M01, टेबल १) में ८ microsatellites बिछाए गए निम्न स्थापित चलत३२,३३का उपयोग किया गया.
      5. जीनोटाइप एक टुकड़ा विश्लेषक पर टुकड़ों प्रवर्धित ।
      6. एक उपयुक्त आकार मानक का उपयोग कर एक वाणिज्यिक या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ टुकड़ा विश्लेषण आचरण ।
      7. ३२ व्यक्तियों को सट्रेक् loci के एक सेट के साथ genotyping द्वारा प्रयोग के अंत में genotypic संरचना का आकलन करें जैसा कि३३बताया गया है, और प्रयोग के अंत में प्रत्येक जीनोटाइप की आवृत्ति की गणना प्रारंभिक इनोक्युलम की तुलना में की जाती है ।

Figure 5
चित्रा 5: वयस्क महिला Daphnia magna. चिंता चैंबर में parthenogenetic अंडे के साथ वयस्क महिला Daphnia magna । सिर और पूंछ रीढ़ की हड्डी के आधार के बीच की दूरी जानवर के आकार को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है । लाल रेखाएं आकार माप को इंगित करती हैं । स्केल बार = ५०० µm ।

Representative Results

दीर्घकालिक अनुभवजंय डेटा विकासवादी गतिशीलता और प्राकृतिक आबादी के हठ की समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस तरह के डेटा आमतौर पर रसद के लिए अस्थाई नमूनों तक पहुंचने और लंबे समय तक डेटा संग्रह करने के लिए अवधि की आवश्यकता के साथ जुड़े कठिनाइयों की वजह से प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं । दो प्रमुख अध्ययनों में यहां प्रस्तुत, मीठे पानी के पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक केंद्रीय zooplankter के तापमान के लिए प्रतिक्रिया के अनुभवजंय सबूत विकासवादी समय पर प्रदान की जाती है । इस स्तरित निष्क्रिय अंडा बैंकों के उपयोग से सक्षम है कि ऐतिहासिक आबादी और उनके सामांय प्रयोगात्मक सेटिंग्स में पर्यावरण तनाव को आधुनिक वंश की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं ।

आम बगीचे प्रयोग
आम बगीचे प्रयोग से पता चला है कि सभी जीवन इतिहास लक्षण तापमान (चित्रा 6 और चित्रा 7) का जवाब दिया । ANOVA विश्लेषण से पता चला कि सभी (उप) आबादी के माध्यम से तापमान का जवाब प्लास्टिक (2 तालिका), मृत्यु दर के लिए छोड़कर, जो अप्रतिसादी है. विकासवादी परिवर्तन के साक्ष्य (उप) आबादी के बीच (अंतर) केवल जनसंख्या वृद्धि दर (तालिका 2) में देखा गया था, जो काफी में तीन (उप) की आबादी में 24 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 6) में वृद्धि हुई ।

Figure 6
चित्रा 6: आम बगीचे प्रयोग । जीवन के इतिहास लक्षण (fecundity, आकार, और परिपक्वता पर आयु) और जनसंख्या वृद्धि दर (r) के लिए प्रतिक्रिया के मानदंडों को तापमान वार्मिंग (24 डिग्री सेल्सियस) के तहत प्रत्येक (उप) जनसंख्या के लिए दिखाए जाते है के रूप में आम बगीचे और वर्तमान तापमान शासन (18 डिग्री सेल्सियस) की तुलना में । जनसंख्या वृद्धि दर 'r' Eulerian समीकरण (1) का उपयोग करते हुए परिकलित की जाती है । आत्मविश्वास के अंतराल दिखाए जाते हैं. (उप) आबादी रंग कोडित रहे हैं: (i) नीला: 1960-1970; (२) हरित: १९७०-१९८५; (iii) लाल: > 1999 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: मृत्यु दर । मृत्यु दर प्रति (उप) जनसंख्या (1960-1970; 1970-1985; > 1999) वार्मिंग (24 डिग्री सेल्सियस) के रूप में आधुनिक तापमान शासन (18 डिग्री सेल्सियस) की तुलना में दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Mesocosm प्रयोग
चयन के चार सप्ताह के बाद, 24 डिग्री सेल्सियस पर वार्मिंग के द्वारा प्रतिनिधित्व, तीन की आवृत्ति (उप) आबादी काफी बदल नहीं किया (χ2 = ०.५५, पी = ०.७६) के रूप में प्रारंभिक इनोक्युलम (चित्रा 8) की तुलना में । mesocosm प्रयोग में ३० पादी inoculated के अलावा बहुमत के चयन के चार सप्ताह बाद (चित्रा ९) की पहचान की गई. विशेष रूप से, inoculated पादी के ७०% बरामद किए गए, ३२ व्यक्तियों के एक नमूने में एक जीनोटाइप के कम से एक प्रतिनिधि से उबरने के Poissonian उंमीद के साथ संगत ।

Figure 8
चित्र 8: प्रतियोगिता प्रयोग-जनसंख्या आवृत्ति । जनसंख्या औसत माध्य और quartiles (25वें और ७५वें), तीन (उप) magna की आबादी के लिए दिखाया गया है mesocosm प्रतियोगिता प्रयोगों (24 डिग्री सेल्सियस) में चयन के चार सप्ताह के बाद, के रूप में एक प्रारंभिक बराबर आवृत्ति की तुलना में ( प्रारंभ) । (उप) आबादी रंग कोडित रहे हैं के रूप में चित्रा 6में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: प्रतियोगिता प्रयोग-जीनोटाइप आवृत्ति । जीनोटाइप आवृत्तियों-औसत माध्य और quartiles (25गु और ७५वें), वार्मिंग के लिए जोखिम के चार सप्ताह के बाद दिखाया (24 डिग्री सेल्सियस) के रूप में पादी (बिंदीदार रेखा) के एक प्रारंभिक समान आवृत्ति की तुलना में कर रहे हैं । x-अक्ष पर नाम inoculated पादी ID, प्रति समूहीकृत (उप) जनसंख्या (नीला, 1960-1970; हरा, 1970-1985; लाल, > 1999) होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लोकस एक आकार सीमा (बीपी) प्राइमरी (5 '-3 ') डाई लेबल आकृति दोहराएं टीएम
B008 HQ234154 १५० – १७० च: TGGGATCACAACGTTACACAA विक टीसी) 9 ५६
R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC
B030 HQ234160 154 – 172 च: CCAGCACACAAAGACGAA पालतू गा) 11 ५६
R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT
B045 HQ234168 118 – 126 च: GCTCATCATCCCTCTGCTTC नेड टीजी) 8 ५६
R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA
B050 HQ234170 234 – 248 च: TTTCAAAAATCGCTCCCATC 6FAM गाा) ६ ५६
R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG
B064 HQ234172 135 – 151 च: CTCCTTAGCAACCGAATCCA 6FAM टीसी) 8 ५६
R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA
B074 HQ234174 196 – 204 च: TCTTTCAGCGCACAATGAAT नेड जीटी) 9 ५६
R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG
B096 HQ234181 234 – 240 च: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA विक एसी) 15 ५६
R: TTGAACCACGTCGAGGATTT
B107 HQ234184 250 – 274 च: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA पालतू सीटी) 8 ५६
R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG

तालिका 1: सट्रेक् मल्टीप्लेक्स । इसमें NCBI सेस नंबर (ए), मल्टीप्लेक्स की जानकारी, पीसीआर प्राइमरी जुगाड़, पीसीआर साइज रेंज, दोहराने की आकृति, फॉरवर्ड प्राइमरी को लेबल करने के लिए इस्तेमाल होने वाला डाई, और एनीलिंग तापमान (Tm) दिखाया गया है ।

Pop विकास दर (r) df च पी
विकास (Pop) 2 ३०.३०९ < 0.001
प्लास्टिक (Temp) 1 ५३१.५४६ < 0.001
evol. प्लास्टिक (पॉप एक्स अस्थायी) 2 ६५.१३७ < 0.001
मृत्यु df च पी
विकास (Pop) 2 २.२३४ ०.११६२
प्लास्टिक (Temp) 1 २.६७९ ०.१०७१
evol. प्लास्टिक (पॉप एक्स अस्थायी) 2 १.८६५७ ०.१६४
Fecundity df च पी
विकास (Pop) 2 १.८८५२ ०.१६३३
प्लास्टिक (Temp) 1 ६.८९३४ ०.०११७
evol. प्लास्टिक (पॉप एक्स अस्थायी) 2 १.६५११ ०.२०३
परिपक्वता पर आकार df च पी
विकास (Pop) 2 ०.२११ ०.८१०६
प्लास्टिक (Temp) 1 ११.१३६१ ०.००१७
evol. प्लास्टिक (पॉप एक्स अस्थायी) 2 ०.६५८६ ०.५२२५
परिपक्वता पर आयु df च पी
विकास (Pop) 2 ०.७८११ ०.४६३७
प्लास्टिक (Temp) 1 ८.०७६४ ०.००६६
evol. प्लास्टिक (पॉप एक्स अस्थायी) 2 ०.०८८ ०.९१५९

तालिका 2: प्रसरण का विश्लेषण (ANOVA) । विचरण परीक्षण का विश्लेषण कि जीवन के इतिहास लक्षण और पुनर्जीवित (उप) आबादी वार्मिंग को उजागर की जनसंख्या वृद्धि दर में परिवर्तन विकासवादी अनुकूलन (आबादी), प्लास्टिक (तापमान उपचार) द्वारा समझाया जाता है, और उनके इंटरेक्शन टर्म (प्लास्टिक के विकास) । महत्वपूर्ण p-मान (p< 0.05) बोल्ड में दिखाए जाते हैं ।

अनुपूरक वीडियो 1: तलछट कोर के नमूने । एक बड़ा बेन corer का प्रयोग दिखाया गया है । बिग बेन लगभग १.५ मीटर की एक कोर ट्यूब 14 सेमी की एक आंतरिक ट्यूब व्यास के साथ लंबाई में है । यह एक रस्सी और एक corer सिर पर एक पिस्टन के होते हैं, जो छड़ को तलछट में ट्यूब ड्राइव संलग्न हैं । एक कोर पकड़ने के लिए कोर ट्यूब है कि एक छोटे पोत से तैनात है समर्थन किया जाता है । पिस्टन गुरुत्वाकर्षण दबाव द्वारा तलछट में नीचे धकेल दिया है । एक रूपरेखा बाहर निकालना प्रक्रिया के दौरान कोर ट्यूब का समर्थन करने के लिए एक संशोधित बोतल जैक है कि पिस्टन ऊपर की ओर धक्का का उपयोग किया जाता है । प्रत्येक तलछट परत एक फ्लैट धातु की सतह पर एकत्र और लंबी अवधि के भंडारण के लिए पारदर्शी नमूना बैग [डार्क और शीत (4 डिग्री सेल्सियस) की स्थिति] के लिए स्थानांतरित कर दिया है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 2: तलछट sieving । sieving तलछट के लिए आवश्यक उपकरण एक सटीक पैमाने, सफेद नमूना ट्रे और भूवैज्ञानिक छलनी है । प्रत्येक तलछट परत से, कम से radiometric डेटिंग के लिए 5 ग्राम बनाए रखे जाते हैं । तलछट के शेष ephippia को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तलछट दो भूवैज्ञानिक छलनी, 1 मिमी और १२५ µm मेष आकार, एक दूसरे के शीर्ष पर ढेर के साथ एक दूसरे के साथ एक के माध्यम से छलनी है । मध्यम 1 मिमी मेष छलनी पर डाल करने के लिए अलग मिट्टी, बड़े अकशेरूकीय है, और बात कण । मध्यम १२५ µm मेष के साथ दूसरी छलनी पर डाला D. magna ephippia और छोटे बात कण अलग करता है । तलछट के Aliquots तो एक सफेद नमूना ट्रे को हस्तांतरित कर रहे हैं । D. magna ephippia सफेद पृष्ठभूमि ट्रे में आंख से देखा जाता है । प्रत्येक परत से Ephippia पृथक पेट्री व्यंजन में एकत्र किए जाते हैं. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 3: Decapsulation । एक stereomicroscope के तहत, D. magna ephippia संदंश मामले की रीढ़ की हड्डी पर दबाव लागू करके microdissection काइटिन के साथ खोला जाता है । भीतरी अंडे की झिल्ली नाजुक रूप से हटा दिया और आराम अंडे धीरे एक पेट्री मध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त पकवान के लिए एक पाश्चर पिपेट के साथ स्थानांतरित कर रहा है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 4: सेने । एक लंबी photoperiod और 20 डिग्री सेल्सियस के लिए जोखिम के बाद, भ्रूण विकास ४८ ज और कुछ हफ्तों के बीच शुरू होता है । जब विकास पूरा हो जाता है तो भ्रूण को अंडा खोल से मुक्त कर मुक्त कर मध्यम में तैरने से तोड़ देते हैं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

जल के उच्च तापीय चालकता के कारण, मीठे पानी पारिस्थितिकी प्रणालियों ग्लोबल वार्मिंग३४के चेहरे में स्थलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों की तुलना में जैव विविधता हानि के उच्च जोखिम में हैं । इसलिए, इन पारिस्थितिकी प्रणालियों में कीस्टोन प्रजातियों की प्रतिक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और थर्मल तनाव जीवित रहने के लिए मुकाबला तंत्र की पहचान । प्रजातियों और समुदाय के स्तर पर इन तंत्र की समझ में मदद कर सकते है भविष्यवाणी कैसे प्रजातियों ग्लोबल वार्मिंग से प्रभावित कर रहे है और कैसे व्यक्तिगत प्रजातियों पर प्रभाव अंय पौष्टिकता स्तरों के लिए झरने । अंततः, ग्लोबल वार्मिंग के लिए प्रतिक्रियाओं के तंत्र को समझने remediation रणनीतियों की पहचान के लिए विलुप्त होने को कम करने में सक्षम बनाता है ।

मामले के अध्ययन यहां प्रस्तुत बताते है कि तापमान में वृद्धि के लिए डी magna की प्रतिक्रिया व्यापक रूप से जीवन के इतिहास लक्षण में प्लास्टिक की मध्यस्थता और तापमान वृद्धि के लिए प्रतिक्रिया है कि अकेले स्पष्ट फिटनेस की लागत को लागू नहीं करता है, कम से यहां जनसंख्या अध्ययन किया । जीवन के इतिहास में उच्च प्लास्टिक लक्षण गैर द्वारा समर्थित है (उप) वार्मिंग की उपस्थिति में जनसंख्या की प्रतिस्पर्धा क्षमताओं में महत्वपूर्ण अंतर । हालांकि, कई आबादी पर अब अवधि प्रतियोगिता प्रयोगों इन निष्कर्षों को सामान्य करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

सुप्त अवस्थाओं का पुनरुत्थान समय10के माध्यम से एक प्रजातियों के विकास के अनुकूलन और पथ के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अभूतपूर्व संसाधन प्रदान करता है । Zooplankton प्रजातियों एक तेजी से पीढ़ी के समय (के बारे में 2 सप्ताह) से लाभ, और सुप्त अवस्थाओं की व्यवहार्यता, जो एक पूर्वज अपनी सन्तान के खिलाफ headtohead प्रतिस्पर्धा करने के लिए अनुमति देता है, या ' पुनरावृत्ति ' विकास है कि विभिंन पिछले राज्यों से शुरू होता है । जी उठने पारिस्थितिकी अनिवार्य रूप से एक विशेष विकासवादी परिणाम है कि कुछ पूर्व घटना पर आकस्मिक है की जांच में सक्षम बनाता है । विकास के आनुवंशिक तत्वों की पहचान वर्तमान में प्रयोगशाला प्रयोगों में संभव है सूक्ष्मजीवों जिसके लिए ' पैतृक लाइनों ' जमे हुए है और उनके विकसित वंशज6के साथ तुलनात्मक विश्लेषण के लिए पुनर्जीवित का उपयोग कर । हालांकि, प्रयोगशाला जीवों के साथ काम करने की मुख्य सीमाओं में से एक यह है कि ' पैतृक राज्य ' एक पहले से ही स्थानांतरित आधारभूत है । सुप्त अवस्थाओं का अध्ययन किसी भी तनाव की घटना (उदा., प्राचीन पर्यावरणीय स्थितियों) से पहले समय से नमूनों के नमूने की अनुमति देता है और विभिन्न अतीत राज्यों को अशांत पर्यावरणीय परिस्थितियों से विकासवादी पथ को मापने के लिए आधुनिक समय तक । हाल के वर्षों में, डीएनए बहुरूपता के अध्ययन में पुनर्जीवित या अभी भी निष्क्रिय zooplankton चरणों पिछले जनसांख्यिकीय और अनुकूली प्रक्रियाओं है कि वर्तमान दिन की आबादी14 के आनुवंशिक श्रृंगार में योगदान दिया है में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है , 16 , 25 , ३३ , ३५ , ३६. उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के उच्च पहुंच के साथ, जीनोम और पुनर्जीवित की transcriptome या अभी भी निष्क्रिय चरणों अनुक्रम किया जा सकता है और प्रकार और आनुवंशिक पर आबादी विकसित करने में संचित परिवर्तन की संख्या समय मापा ।

जी उठने शराबी यहां प्रस्तुत दो स्तरों पर बहु ओमिक्स के क्षेत्र में महत्वपूर्ण आवेदन किया है । बहु ओमिक्स प्रौद्योगिकियों पुनर्जीवित नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है, आणविक पर्यावरण चयन दबाव को अनुकूली प्रतिक्रियाओं में शामिल तत्वों की एक विस्तृत विश्लेषण की अनुमति । इसके अलावा, ओमिक्स प्रौद्योगिकियों decapsulated लेकिन अभी भी निष्क्रिय चरणों के लिए लागू किया जा सकता है । अब तक, चरणों आराम करने के लिए उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के आवेदन इनपुट सामग्री की एक बड़ी राशि की आवश्यकता द्वारा सीमित किया गया है । इन सीमाओं को३७उठा लिया जा रहा है । इनपुट सामग्री और nanofluidics में प्रगति के लिए कम आवश्यकताओं के साथ, पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) अब से संभव है के रूप में के रूप में कम 1 एनजी या शुरू सामग्री३८के कुछ स्नातकोत्तर । पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) और पूरे transcriptome प्रवर्धन (डब्ल्यूटीए) तकनीक का उपयोग, ऊतक की बहुत छोटी मात्रा से डीएनए और आरएनए के संवर्धन को सक्षम करने, दोनों metagenomics३९,४० और चिकित्सा क्रांति की है शोध४१. इन प्रौद्योगिकियों decapsulated निष्क्रिय अंडे के लिए लागू निष्क्रिय चरणों की व्यवहार्यता और विस्तारित समय अवधि (जैसे, सदियों) की जांच के साथ जुड़े सीमाओं की अधिक से अधिक सक्षम करें ।

invertebrate आराम चरणों का उत्पादन समुदायों के जी उठने प्राकृतिक परिदृश्य में जाना जाता परिवर्तन के साथ समुदाय के इतिहास के संरेखण में सक्षम बनाता है, या पर्यावरण अवसादों orsoils के विश्लेषण से आस्थगित परिवर्तन के साथ2। पर्यावरण परिवर्तन के जवाब में समुदाय परिवर्तन के विश्लेषण हमें पारिस्थितिकी यों की क्षमता-विकासवादी फीडबैक४२ है कि जनसंख्या हठ४३पर पर्याप्त परिणाम है, पौष्टिकता सहभागिता४४ के साथ प्रदान करता है , सामुदायिक सभा४५, और पारिस्थितिकी तंत्र कार्यों और सेवाओं में परिवर्तन४६। अंत में, पर्यावरणीय परिवर्तन करने के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं के बारे में सटीक भविष्यवाणी के लिए जैव विविधता४७के संरक्षण गाइड सर्वोपरि हैं । वर्तमान पूर्वानुमान मॉडल इस संबंध में गलत है क्योंकि वे खाते में जनसांख्यिकी, फैलाव, विकास, और प्रजातियों के रूप में महत्वपूर्ण जैविक तंत्र नहीं ले कर रहे है बातचीत । समझ कैसे इन समय के साथ प्रक्रियाओं परिवर्तन और पूर्वानुमान मॉडलिंग में एक से पहले के रूप में इस जानकारी का उपयोग कर हमारे पर्यावरण परिवर्तन के चेहरे में प्रजातियों और समुदाय हठ भविष्यवाणी करने की क्षमता में सुधार होगा2।

यहां प्रस्तुत शराबी के आवेदन चुनौतियों के बिना नहीं है । निष्क्रिय चरणों जी उठने की प्राथमिक सीमा नमूना लेने के लिए विशेष उपकरणों की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, पूरी प्रक्रिया, तलछटी sieving से क्लोनल संस्कृतियों की स्थापना के लिए, काफी समय पर हाथ की आवश्यकता है ।

कुछ शराबी कदम यहां प्रस्तुत अंय Daphnia प्रजातियों के लिए आसानी से हस्तांतरणीय हैं । ये हैं: नमूना, क्लोनिंग लाइनों की स्थापना, और प्रयोगात्मक डिजाइन । हालांकि, शराबी के अंय कदम आगे अध्ययन के तहत प्रजातियों के अनुरूप अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । Decapsulation अक्सर D. magna नमूनों के लिए लागू करने के लिए सेने सफलता में सुधार है । हालांकि, इस दृष्टिकोण छोटे नमूनों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । सेने उत्तेजनाओं भी प्रजातियों के बीच४८ और विशिष्ट नमूना४९के बीच भिंन हो सकते हैं । इसलिए, शराबी के सेने कदम के एक तदर्थ अनुकूलन अंय क्रसटेशियन के लिए आवेदन करने से पहले की आवश्यकता हो सकती है । D. magna की सेने सफलता Whilst झील की अंगूठी से पुनर्जीवित जनसंख्या (अवसादी संग्रह में ३०.५%) पिछले परिणाम के साथ लाइन में है४९, सेने सफलता तलछट के संरक्षण राज्य के साथ बदलता रहता है, प्रजातियों ५०,५१, और तलछट४८के भौगोलिक मूल । diapause के चरणों के माध्यम से प्रवेश और प्रगति को विनियमित कि तंत्र पर भविष्य के अध्ययन के लिए विभिन्न प्रजातियों के अनुरूप इष्टतम सेने उत्तेजनाओं की पहचान करने के लिए आवश्यक है.

अंत में, अध्ययन प्रणाली की पृष्ठभूमि ज्ञान, विशेष रूप से समय के साथ ब्याज की प्रजातियों की उपस्थिति, उचित है । यह ऐतिहासिक रिकॉर्ड के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । यदि ऐतिहासिक रिकॉर्ड उपलब्ध नहीं हैं, नमूना और झील तलछट की सतह परतों की स्क्रीनिंग कोर नमूने से पहले सलाह दी जाती है, हालांकि यह जानकारी केवल सबसे हाल के इतिहास पर प्रदान कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

यह काम NERC हाइलाइट्स अनुदान (NE/N016777/1) द्वारा समर्थित किया गया था । Ensis लिमिटेड, पर्यावरण वैज्ञानिक सेवाएं, पर्यावरण परिवर्तन अनुसंधान केंद्र, विश्वविद्यालय कॉलेज लंदन नमूना और दिनांक तलछट कोर ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sampling bags Fisher Scientific 11542783 Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand
piston corer ENSIS ltd na Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC
precision scale Veritas-M124A TLP-50 Analytical Balance
geological sieve UKGE limited SV7521 200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh
geological sieve UKGE limited SV7525 200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh
white sampling tray nhbs http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 Standard mulipurpose lab trays
pasteur pipette Globe Scientific inc. 138020B Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL
stereo microscope nikon smz800 Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit
petri dish EduLab 153-533 Sterile 90mm diameter plastic petri dish
glass jars compak Round Jam Jars 4oz 100 mL jars
glass jars compak Atum Jars/ Bonta Jar 10oz 200 mL jars
glass jars bottlecompanysouth 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid 500 mL jars
statistical software R https://cran.r-project.org/ na Free online GNU  language and environment for statistical computing and graphics
microdissection forceps Fisher Scientific 41122405 Fine point stainless steel forceps for microdissections
image software https://imagej.nih.gov/ij/index.html na Open source ImageJ image processing toolkit written in Java
mesocosm amazon na Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter
mirocentrifuge tubes Sigma_Aldrick - Merck Z606340 premium microcentrifuge tubes 1.5 mL
AGENCOURT DNAdvance Beckman Coulter A48705 DNA extraction kit
size standard Thermo Fisher Scientific 4322682 LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers
ABI3032 sequencer ABI na Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindenmayer, D. B., et al. Value of long-term ecological studies. Austral Ecol. 37 (7), 745-757 (2012).
  2. Orsini, L., et al. The evolutionary time machine: using dormant propagules to forecast how populations can adapt to changing environments. TREE. 28, 274-282 (2013).
  3. Grant, P. R., Grant, B. R. Unpredictable evolution in a 30- year study of Darwin's finches. Science. 296, 707-711 (2002).
  4. Lohbeck, K. T., Riebesell, U., Reusch, T. B. H. Adaptive evolution of a key phytoplankton species to ocean acidification. Nature Biosci. 5, 346-351 (2012).
  5. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  6. Barrick, J. E., Lenki, R. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
  7. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  8. Kawecki, T. J., et al. Experimental evolution. TREE. 27, 547-560 (2012).
  9. Fukami, T., Wardle, D. A. Long-term ecological dynamics: reciprocal insights from natural and anthropogenic gradients. P Roy Soc B-Biol Sci. 272, 2105-2115 (2005).
  10. Merila, J., Hendry, A. P. Climate change, adaptation, and phenotypic plasticity: the problem and the evidence. Evol Appl. 7 (1), 1-14 (2014).
  11. Evans, M. E., Dennehy, J. J. Germ banking: bet-hedging and variable release from egg and seed dormancy. Q Rev Biol. 80 (4), 431-451 (2005).
  12. Appleby, P. G. Chronostratigraphic techniques in recent sediments. 1, Kluwer Academic Publisher. (2001).
  13. Appleby, P. G., et al. PB-210 dating by low background gamma-counting. Hydrobiologia. 143, 21-27 (1986).
  14. Bidle, K. D., Lee, S. H., Marchant, D. R., Falkowski, P. G. Fossil genes and microbes in the oldest ice on Earth. PNAS. 104, 13455-13460 (2007).
  15. Geerts, A. N., et al. Rapid evolution of thermal tolerance in the water flea Daphnia. Nat Clim Change. 5, 665-668 (2015).
  16. Jansen, M., et al. Thermal tolerance in the keystone species Daphnia magna-a candidate gene and an outlier analysis approach. Mol Ecol. 26 (8), 2291-2305 (2017).
  17. Hairston, N. G. Jr, De Stasio, B. T. Jr Rate of evolution slowed by a dormant propagule pool. Nature. 336, 239-242 (1988).
  18. Hairston, N. G. Jr, et al. Lake ecosystems: Rapid evolution revealed by dormant eggs. Nature. 401, 446 (1999).
  19. Weider, L. J., Lampert, W., Wessel, M., Colbourne, J. K., Limburg, P. Long-term genetic shifts in a microcrustacean egg bank associated with anthropogenic changes in the Lake Constance ecosystem. Proc. R. Soc. Lond. B. 264, 1613-1618 (1997).
  20. Kerfoot, W. C., Robbins, J. A., Weider, L. J. A new approach to historical reconstruction: Combining descriptive and experimental paleolimnology. Limnol Oceanogr. 44 (5), 1232-1247 (1999).
  21. Cousyn, C., et al. Rapid, local adaptation of zooplankton behavior to changes in predation pressure in the absence of neutral genetic changes. PNAS. 98, 6256-6260 (2001).
  22. Decaestecker, E., et al. Host-parasite Red Queen dynamics archived in pond sediment. Nature. 450, 870-874 (2007).
  23. Miner, B. E., De Meester, L., Pfrender, M. E., Lampert, W., Hairston, N. G. Linking genes to communities and ecosystems: Daphnia as an ecogenomic model. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1735), 1873-1882 (2012).
  24. Ebert, D. Ecology, epidemiology, and evolution of parasitism in Daphnia. , National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology. (2005).
  25. Orsini, L., et al. Temporal genetic stability in natural populations of the waterflea Daphnia magna in response to strong selection pressure. Mol Ecol. 25, 6024-6038 (2016).
  26. IPCC. Summary for policymakers. , Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA. 1-32 (2014).
  27. Patmore, I. R., et al. Big Ben: a new wide-bore piston corer for multi-proxy palaeolimnology. J Paleolimnol. 51 (1), 79-86 (2014).
  28. Wright, H. E. Jr A square-rod piston sampler for lake sediments. J Sedimentary Petrology. 37, 975-976 (1967).
  29. Kilham, S. S., Kreeger, D. A., Lynn, S. G., Goulden, C. E., Herrera, L. COMBO: a defined freshwater culture medium for algae and zooplankton. Hydrobiologia. 377, 147-159 (1998).
  30. Klüttgen, B., Kuntz, N. orbert, Ratte, H. T. Combined effects of 3,4-dichloroaniune and food concentration on life-table data of two related cladocerans, Daphnia magna and Ceriodaphnia quadrangula. Chemosphere. 32, 2015-2028 (1996).
  31. R: A language and environment for statistical computing. , Vienna, Austria. (2017).
  32. Jansen, B., Geldof, S., De Meester, L., Orsini, L. Isolation and characterization of microsatellite markers in the waterflea Daphnia magna. Mol Ecol Res. 11, 418-421 (2011).
  33. Orsini, L., Spanier, K. I., De Meester, L. Genomic signature of natural and anthropogenic stress in wild populations of the waterflea Daphnia magna: validation in space, time and experimental evolution. Mol Ecol. 21, 2160-2175 (2012).
  34. Verberk, W. C. E. P., et al. Does oxygen limit thermal tolerance in arthropods? A critical review of current evidence. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 192, 64-78 (2016).
  35. Frisch, D., et al. A millennial-scale chronicle of evolutionary responses to cultural eutrophication in Daphnia. Ecol Lett. 17 (3), 360-368 (2014).
  36. Yashina, S., et al. Regeneration of whole fertile plants from 30,000-y-old fruit tissue buried in Siberian permafrost. PNAS. 109, 4008-4013 (2012).
  37. Southam, A. D., Weber, R. J. M., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nat Protoc. 12 (2), 310-328 (2017).
  38. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. Plos One. 9 (11), (2014).
  39. Baym, M., et al. Inexpensive Multiplexed Library Preparation for Megabase-Sized Genomes. Plos One. 10 (5), 6 (2015).
  40. Bourcy, C. F. A., et al. A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome Amplification Methods. Plos One. 9 (8), (2014).
  41. Hasmats, J., et al. Assessment of whole genome amplification for sequence capture and massively parallel sequencing. PLoS One. 9 (1), e84785 (2014).
  42. Becks, L., Ellner, S. P., Jones, L. E., Hairston, N. G. Jr The functional genomics of an eco-evolutionary feedback loop: linking gene expression, trait evolution, and community dynamics. Ecol Lett. 15 (5), 492-501 (2012).
  43. Ellner, S. P., Geber, M. A., Hairston, N. G. Does rapid evolution matter? Measuring the rate of contemporary evolution and its impacts on ecological dynamics. Ecol Lett. 14 (6), 603-614 (2011).
  44. Yoshida, T., Jones, L. E., Ellner, S. P., Fussmann, G. F., Hairston, N. G. Jr Rapid evolution drives ecological dynamics in a predator-prey system. Nature. 424 (6946), 303-306 (2003).
  45. Urban, M., et al. The evolutionary ecology of metacommunities. TREE. 23, 311-317 (2008).
  46. Dokulil, M. T. Eutrophication: Causes, Consequences and Control. , Springer. Netherlands. 81-88 (2014).
  47. Urban, M. C., et al. Improving the forecast for biodiversity under climate change. Science. 353 (6304), (2016).
  48. Schwartz, S. S., Hebert, P. D. N. Methods for the activation of the resting eggs of Daphnia. Freshwater Biol. 17, 373-379 (1987).
  49. Vanderkerhove, J., et al. Hatching of cladoceran resting eggs: temperature and photoperiod. Freshwater Biol. 50, 96-104 (2005).
  50. Caceres, C. E. Temporal variation, dormancy, and coexistence: a field test of the storage effect. PNAS. 94 (17), 9171-9175 (1997).
  51. Caceres, C. E. Interspecific variation in the abundance, production, and emergence of Daphnia diapausing eggs. Ecology. 79 (5), 1699-1710 (1998).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक १३१ जी उठने जीव विज्ञान waterflea निद्रा अनुदैर्ध्य डेटा आम बगीचे प्रयोगों प्रतियोगिता प्रयोगों
सुप्त <em>Daphnia magna</em>का पुनरुत्थान: प्रोटोकॉल और अनुप्रयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuenca Cambronero, M., Orsini, L.… More

Cuenca Cambronero, M., Orsini, L. Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications. J. Vis. Exp. (131), e56637, doi:10.3791/56637 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter