Summary
Langsiktige studier er nødvendig for å forstå prosessen med evolusjonen og mekanismer for tilpasning. Vanligvis krever disse studiene forpliktelser utover av forskere. Her, beskrives en kraftig metode som dramatisk fremskritt state-of-the-art datainnsamling vil generere Longitudinelle data i naturlige systemer.
Abstract
Langsiktige studier aktiverer identifisering av øko-evolusjonære prosesser over lengre tidsperioder. I tillegg gir de viktigste empiriske data som kan brukes i prediktiv modellering for å forutsi evolusjonære svar på naturlige økosystemer til fremtidige endringer i miljøet. Men uten noen spesielle tilfeller er langsiktige studier knappe på grunn av logistiske problemer forbundet med tilgang til timelige prøver. Timelige dynamics er ofte studert i laboratoriet eller i kontrollerte mesocosm eksperimenter med eksepsjonell studier som rekonstruere utviklingen av naturlige populasjoner i naturen.
Her, gis en standard prosedyre (SOP) til gjenopplive eller gjenopplive sovende Daphnia magna, en utbredt dyreplankton keystone Art i akvatiske økosystemer, for å dramatisk fremme state-of-the-art langsgående datainnsamling i naturlige systemer. Feltet oppstandelse økologi ble definert i 1999 av Kerfoot og kolleger, selv om først forsøk på klekking diapausing dyreplankton egg dateres tilbake til slutten av 1980. Siden Kerfoots banebrytende papir, er metodikk gjenopplive dyreplankton arter stadig oftere brukt, men overført mellom laboratorier bare via direkte overføring. Her en SOP er beskrevet som gir en trinnvis protokoll praksisen med å gjenopplive sovende Daphnia magna egg.
To viktige studier er angitt i som fitness svar oppstandne Daphnia magna bestander å oppvarming måles, capitalizing på muligheten til å studere historiske og moderne populasjoner i de samme innstillingene. Til slutt, bruk av neste generasjons sekvensering teknologi til gjenopplivet eller fortsatt sovende stadier er diskutert. Disse teknologiene gir enestående makt i dissekere prosessene og mekanismer for utviklingen hvis populasjoner som har opplevd endringer i markering press over tid.
Introduction
Langsiktige studier er avgjørende for å forstå økologiske og evolusjonære prosesser i naturen og vurdere hvordan arter svare og vedvarer under miljøendringer1. Dette er fordi øko-evolusjonære prosesser skjer på tvers av generasjoner og endringer i miljøet oppstår over lang tid spenn. Videre yter langsiktige studier nøkkel empiriske data som forbedrer nøyaktigheten av prediktiv modellering å forutsi evolusjonære svar på naturlige økosystemer miljøendringer2. Nøyaktigheten av disse modellene er avgjørende å implementere forvaltning strategier for å bevare biologisk mangfold og økosystem.
Uten noen spesielle tilfeller (f.eks, Galapagos Darwin finches3 og alger4) er langsiktige studier begrenset til arter med kort generasjonstid som kan overføres i laboratoriet5,6 , 7 , 8. dermed prosessene underbygger evolusjonære dynamics forblir unnvikende. På grunn av logistiske problemer forbundet med tilgang til timelige prøver, empiri er studert oftere i en romlig enn i timelige sammenheng, og timelige øko-evolusjonære prosesser er tiltenkt eller modellert fra romlige data. Denne tilnærmingen er kjent som 'plass-for-time' substitusjon9, der plassen er vedtatt som et surrogat å studere timelige evolusjonære dynamics. Den viktigste begrensningen på plass-for-time erstatningen er at utbredelsen av tilpasning på forskjellige romlige skalaer avvike fra timelige variasjon i samme populasjon. Derfor er slutninger basert på erstatning tid med plass partisk10.
En kraftig alternativ som tillater studere evolusjonære dynamikk i naturlige økosystemer over tid er analysen av økologiske og genetiske endringer i arter produsere sovende trinn11. Disse sovende stadiene akkumuleres til skjemaet stratifisert biologiske arkiver som kan nøyaktig datert og paleolimnologically preget12,13. Viktigere, kan disse sovende stadier, gjenopplivet og brukt i laboratorieforsøk, der sin evolusjonære respons til miljøproblemene direkte kan måles. Historiske populasjoner kan være konkurrerte mot deres moderne utviklet etterkommere fitness endringer og funksjonen av gener utvikler seg i takt med miljøendringer14,15,16.
Sovende stadier inkluderer frø, cyster, sporer og egg banker. Selv om den første studier på gjenopplivet sovende egg dateres tilbake til slutten av 1980-tallet17, og en håndfull studier har brukt denne teknikken i tidlig på 1990-tallet18,19, har feltet oppstandelse økologi blitt formelt etablert av banebrytende papir av Kerfoot og kolleger i 199920. Denne praksisen har blitt brukt hovedsakelig i paleolimnological rekonstruksjoner av ferskvannsarter17,21,22. Imidlertid er Ettergivenhet ennå ikke tilgjengelig. Her tilbys en detaljert beskrivelse av oppstandelsen protokollen brukes sovende egg av dyreplankton arter Daphnia magna , fra prøvetaking av sedimenter til etableringen av klonal kulturer fra skilpadder. Trinnene i SOP som lett kan overføres til andre arter av Daphniaog fremgangsmåte som kan innebære ytterligere optimalisering, diskuteres.
Daphnia er ferskvann zooplankters i fleste ganske flate habitater23 . Daphnia arter er enten forplikte aseksuell eller sykliske parthenogens. D. magna er en syklisk parthenogen som reproduserer clonally under gunstige forhold24. Når miljøforhold svekkes, mannlige produksjon skjer og seksuell rekombinasjon fører til dannelse av befruktet egg som angir en tilstand av dormancy beskyttet fra omgivelsene av en chitin sak som heter ephippium. En andel av disse sovende eggene klekkes når gunstige miljømessige forhold tilbake. En stor andel av sovende egg banken har imidlertid aldri klekkes og dermed bygge opp biologiske arkiver over tid. Sovende fortsatt begravd i sedimentet innsjøer og dammer og kan oppstå for studier av evolusjonære dynamics over lengre tidsperioder. Fordi sovende egg D. Magna er et resultat av seksuelle rekombinasjon, er de en god representasjon av naturlige genetisk mangfold av arter25. Videre kan de vedlikeholdes via klonal reproduksjon i laboratoriet. Disse egenskapene gir unike fordelen av isogenic modellen organismer, samtidig som det naturlige genetisk mangfoldet.
To viktige studier presenteres for å demonstrere fordelene med direkte sammenligne historiske og moderne etterkommere av samme populasjon D. Magna opplever miljømessige markering press over tid. D. magna prøvene var opp fra innsjøen Ring (Danmark), en grunne (5 m dyp; overflaten 22 ha) blandet dammen som har opplevd en økning i gjennomsnittlig temperatur og hetebølger forekomst over tid. D. magna (sub) bestander var gjenoppstått langs denne timelige gradient som strekker seg 60 år (1960-2005) og studerte undersøke evolusjonære svar til temperatur oppvarming. I den første studien i en vanlig hage eksperiment, ble endringer i fitness-tilknyttet livshistorie egenskaper målt som svar på en økning i temperaturen på + 6 ° C, i tråd med spådommer for FNs klimapanel for klimaendringer i de kommende 100 år 26. i den andre studien, en mesocosm eksperiment ble brukt til å måle konkurransedyktig evnene til tre (sub) bestander under oppvarming. Disse eksperimentene kombinert viser at i nærvær av oppvarming som bare stress, alle livshistorie trekk og befolkningsgrupper viser høy plastisitet og har like konkurransedyktig evner. Disse funnene tyder på at oppvarming som et enkelt stress ikke innføre betydelig fitness kostnader, minst i befolkningen studert her.
Protocol
Følgende SOP inneholder en detaljert beskrivelse av protokollen som brukes til å gjenopplive Daphnia magna sovende egg, inkludert en detaljert beskrivelse av prøvetaking, isolering av ephippia fra sedimenter og etablering av klonal kulturer ( Figur 1).
Figur 1: trinnvise instruksjoner for oppstandelse Daphnia magna. Sedimenter fra en ferskvann naturlige (A) samples med en stempelet corer (B). Sediment kjernen (C) er snittet i trinnvis lag 1 eller 0,5 cm (D). Hvert lag med sedimenter er lagret i et eksempel zip lock bag (E) i mørke og kalde forhold (4 ° C). Hvert lag med sedimenter veies og soldet bruker geologiske sikter (1 mm og 125 µm mesh størrelser, F). Hvit bakgrunn skuffer brukes til å isolere Daphnia magna ephippia (G). Decapsulated sovende egg (H) overført til Petri retter og utsatt for lys og temperatur stimuli å indusere klekking. Skilpadder overføres til separate glassene (jeg) for å etablere isoclonal linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. utvalg av Sediment kjerner
- Eksempel sedimenter fra innsjøer eller dammer med en stempelet corer. Denne protokollen brukes Big Ben27, en kjerne tube ca 1.5 m lang med en indre rør diameter på 14 cm. Big Ben består av et stempel på et tau og en corer hodet, som stenger er tilknyttet for å kjøre tuben ned i sedimentene. En kjerne catcher hjelpemidler støtte fra kjernen røret når full av sedimenter. For å extrude sediment, et rammeverk holder kjernen røret oppreist og stasjonære og en modifisert flaske jack brukes til å skyve stempelet oppover i ekstruderingsprosessen (supplerende Video 1).
- Grunne dammer på mindre enn 1 meter i dybden, bruke en plexiglass tyngdekraften corer mer enn 6 cm i diameter manuelt presset ned i sedimentene.
- For dype sjøer (> 6 m dybde), bruke Livingston stempel corers28 eller én stasjon Griffith sediment corers med aids av en forankret pontong båt. Livingstone-type stasjon rod stempelet corer kan brukes i vann opp ca 30 m dyp å samle påfølgende én meter stasjoner av myk til konsoliderte innsjø sedimenter. Én stasjon Griffith corer består av en enkel men robust kjerne hodet som kobler standard polykarbonat rør til Livingstone stasjonen stenger. Corers skyves ned i sedimentene med stenger, og et stempel gir inntaks nødvendig for utvinning av sediment (figur 2).
- For å hente kontinuerlig, bruk uforstyrret kjerner, vibracoring. Disse corers på en rekke vanndybder og kan hente kjerneprøver av forskjellige lengder, avhengig av sediment lithology. Lav amplituden vibrasjon som er overført fra vibracore hodet ned gjennom tilknyttede FAT eller core tube flytende sedimenter, aktiverer kjernen fat tilknyttet vibracore enheten å trenge inn i flytende sedimenter. Noen vibracorers er små, lette og bærbare, andre er store tunge enheter som kan bare distribueres fra store fartøy. Valg av corers, avhenger av lithology av sedimenter.
- Skjær kjernen vannrett i trinnvis lag 1 cm eller mindre ved hjelp av en flat metalloverflate (supplerende Video 1). Sediment corers som brukes her er utviklet for å redusere hydrostatisk trykk på ekstrudering, redusere forstyrrelse av sediment lagene. Når andre corers brukes, fjernes den ytre skallet av hvert sediment lag med en cookie-cutter slags blad begrense forurensning blant lag.
- Samle hvert sediment lag i en separat prøvetaking bag (supplerende Video 1), og lagre i mørket og kalde (4 ° C) forhold.
- Samle minst 5 g av sedimenter fra alle lag for radiometric dating. Radiometric dating er en etablert protokoll for en detaljert beskrivelse av dating analysen, se eksisterende publikasjoner12,13.
Figur 2: tegneserie av stempelet coring prosedyren. Stempelet corer, en hul tube med en intern skyve segl (stempelet) som produserer en svak vakuum. Når stempelet berører sediment-vann-grensesnittet, vekten presser kjernen fat i sedimentet og vakuum fører sediment blir cored å gå inn og flytte opp røret uten å forstyrre sediment lagene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. sikting av Sediment lag
- Med en presisjon skala, vei hvert sediment lag for fremtidig referanse. Bruk areal og vekt for å beregne arter tettheten i sjøen.
- Sil hver sediment laget med to geologiske sikter stablet oppå hverandre. Første silen maske størrelse på 1 mm og skiller leire, store dyr og svevestøv, f.eks frø, planter og insekter, fra resten av sediment. Andre silen har et nett av 125 µm og skiller D. manga ephippia og små partikler fra resten av sedimentet (supplerende Video 2).
-
Overføre små dele sediment brøken samlet på 125 µm sil til en hvit bakgrunn skuff. Avhengig av sedimenter overføres mindre eller større dele sediment på hver gang.
- Legge til små volumer (opp til 200 mL) av middels til prøvetaking hvit skuffen å suspendere overførte sediment brøken og tilrettelegge øye spotting av ephippia (Figur 3). Mediet som brukes til resuspend sediment kan dechlorinated vann, borehullet vann, COMBO29eller ADaM medium (Aachener Daphnien)30. Heretter, brukes begrepet "medium" til å referere til enten av eller alle de oppførte løsningene.
Figur 3: Daphnia magna ephippium. Sovende Daphnia magna egg umiddelbart etter utpakking. Ephippium (A), indre egg membranen (B) og de sovende egg (C) vises. Skala bar = 500 µm.
3. utpakking av Ephippia og klekking
- Med en engangs Pasteur pipette eller bruker microdissection tang, overføre personlige ephippia Petri retter fylt med 10 mL av medium. Bruke minst en Petriskål per lag av sedimenter.
- Under en stereo mikroskop, decapsulate hver ephippia bruker microdissection tang ved å tvinge åpne chitin saken (supplerende Video 3). Fjerne hvile egg interne membran delikat, betaler oppmerksomhet til ikke forstyrre egg, og overføre dem til Petriskål fylt med mediet bruker en Pasteur pipette. Utpakking øker klekking suksess i D. magna, imidlertid, det kan ikke være nødvendig eller det kan være utfordrende for andre Daphnia arter produsere mindre ephippia.
- Utsett decapsulated egg hele spekteret lang dag fotoperiode lys (16:8 lys: mørk) og høy temperatur (20 ± 1 ° C) å indusere klekking i en kontrollert temperatur enhet (inkubator) eller rommet. Klekking oppstår mellom 48 h og flere uker (opptil fire; Supplerende Video 4). I fravær av utpakking, utsette direkte ephippia til klekking stimuli (lang dag fotoperiode lys (16:8 lys: mørk) og høy temperatur (20 ± 1 ° C)).
4. etablere Isoclonal linjer Daphnia Magna
- Etablere isoclonal linjer fra enkelt skilpadder ved å overføre personlige D. magna fra trinn 3.3 skille krukker fylt med 200 mL mediet bruker en engangs Pasteur pipette. Hver person er genetisk distinkte, blir resultatet av seksuell rekombinasjon.
- Opprettholde isoclonal linjer på ubestemt tid i lager betingelser som består av 10 ± 1 ° C, 16:8 lys: mørk regimet, matet ukentlig med 0,2 mg C/L Chlorella vulgaris eller andre grønne alger (f.eks Scenedesmus obliquus). Fornye mediet hver tredje uke. Lager vilkår kan endres med temperaturen, fôring regimer og arter.
5. nøkkelen studier
Merk: En beskrivelse av to viktige studier tilbys som oppstandne D.magna (sub) befolkningen fra sedimentære arkivet i Lake Ring (Danmark) brukes til å vurdere evolusjonære svaret til oppvarming. Tre (sub) bestander var oppstandne fra følgende tidsperiodene: 1960-1970, 1970-1985 og > 1999. D. magna klekking suksess fra sedimentære arkivet varierte mellom 11 og 58% (Figur 4). Fra hatchlings fra hver timeperiod, ble et tilfeldig delsett valgt for to viktige studiene beskrevet her. Disse studiene ble utformet for å vurdere om (sub) bestander opp fra ulike tidsperioder langs temperaturgradient viste forskjeller i fitness-tilknyttet livshistorie trekk (5.1), og om de hadde ulike konkurransedyktig evner (5,2) etter eksponering for oppvarming.
Figur 4: klekking suksess i en sedimentær arkiv samplet fra Lake Ring. Andelen vellykkede hatchlings langs sedimentære arkiv av innsjøen Ring brukes i nøkkel erfaringene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Felles hage eksperimenter
- Overføre ti hatchlings pr. (sub) innbyggere fra lager kulturer felles hage forhold: 16 ° C; lang fotoperiode (16:8 lys: mørk regimet); feed daglig med 0,8 mg C/L Chlorella vulgaris, og fornye medium hver annen dag. Opprettholde hatchlings i felles hage forhold for minst to generasjoner (ca. 45 dager). Felles hage forhold redusere interferensen mors effekten og synkronisere reproduksjon blant skilpadder.
- Ved utgivelsen av andre brood i Foreldreomsorg og yngelens kammeret, overføre voksne hunner fra andre generasjon til 500 mL krukker fylt med middels før de slipper andre kull av barn.
- Tilfeldig overføre personlige yngel av 24 – 48 h, født fra andre kull av andre generasjon, til 100 mL krukker fylt med medium og utsatt for eksperimentell følgende: 18 ° C (gjeldende temperatur i sjøen) og 24 ° C (oppvarming, temperatur prognosen av IPCC 26 for de kommende 100 år), 16:8 lys: mørk regimet og mate daglig 0,8 mg C/L av Chlorellavulgaris.
- På hvert eksperimentelle dyr, måle størrelsen ved forfall med en stereomicroscope som avstanden mellom hodet og av halen ryggraden (figur 5). Fotografere hvert dyr og deretter analysere størrelsen ved hjelp av en passende bilde-programvare.
- Måle alder ved forfall: dagen som egg er observert for første gang i Foreldreomsorg og yngelens kammeret.
- Måle dødeligheten: antallet utdødd personer under eksperimentet.
- Måle fruktbarhet: antall avkom i første og andre klonal reproduksjon.
- Måle befolkningsveksten, beregnet ved hjelp av Eulers formelen (1):
(1)
Der lx er andelen overlevelse alder x, er bx antall nyfødte produsert per overlevende individ alder xog r er iboende naturlig økning. - Utføre statistisk analyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. Her, bruk R31 tegne reaksjon normer (fenotypiske uttrykk for et enkelt genotype over miljøer) for hver livshistorie egenskap, bruker ggplot2 pakken. Beregne dødelighet per befolkningen via overlevelse analyse (R pakken rms, https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Til slutt, utføre en variansanalyse (ANOVA, tabell 2) i R31 å vurdere om effekten av temperatur på trekk kan forklares av evolusjon (forskjeller blant populasjoner), plastisitet (respons på behandling) og utviklingen av plastisitet (befolkningen x behandling).
-
Konkurranse eksperiment
- Overføre ti hatchlings pr. innbyggere fra lager kulturer felles hage forhold: 20 ° C, lang fotoperiode (16:8 lys: mørk regimet), mate daglig med 0,8 mg C/L Chlorella vulgaris, og fornye medium hver annen dag. Opprettholde felles hage forhold i minst to generasjoner (ca. 45 dager) å redusere forstyrrelser fra mors effekter.
- Tilfeldig tilordne fem yngel av 24 til 48 timer fra andre kull av de andre generasjonene av hver hatchling til eksperimentelle mesocosms (20 L plast akvarier fylt med medium), i triplicates, på en tetthet av 10 dyr/L.
- Vise mesocosms til 24 ° C, 16:8 L:D regimet, og mate daglig med 0,8 mg C/L av Chlorellavulgaris i en kontrollert temperatur kammer eller inkubator i minst fire uker (> 3 klonal generasjoner).
- Innhente hver mesocosm ukentlig oppdatering 10% av mediet å simulere en populasjon dynamisk Daphnia kan støte i naturen. Pålegge culling ved å fjerne et kjent volum av middels og dyr fra hver akvariet (1,2 L i dette tilfellet), og culled volumet med fersk medium. Starte culling regimet etter forsøksdyr nå modenhet (dag 10).
- Ved utgangen av fjerde uken, kan du prøve 32 dyr fra hver mesocosm å vurdere endringer i genotypic sammensetning i forhold til den opprinnelige inoculum.
- Plasser personlige Daphnia i microcentrifuge rør og fjerne overflødig væske med hjelp av en Pasteur pipette.
- Flash fryse personlige rør i flytende nitrogen og store på-80 ° C.
- Pakk ut genomisk DNA fra enkelt individer hjelp tilgjengelig protokoller og følge instruksjonene fra produsenten.
- Forsterke utdraget DNA ved hjelp av en rekke genetiske markører nok til å gi en unik multilocus genotype per hatchling. Her ble 8 microsatellites arrangert i en enkelt multipleks (M01, tabell 1) brukt etter etablerte protokoller32,33.
- Genotype forsterket fragmenter til en fragment analysator.
- Utfør fragment analyse med en kommersiell eller fritt tilgjengelig programvare ved hjelp av en passende størrelse standard.
- Vurdere genotypic komposisjon ved slutten av forsøket av genotyperingteknologi 32 personer med et sett med mikrosatellittmarkør loci som beskrevet33og beregning av hyppigheten av hver genotype ved slutten av forsøket sammenlignet med den første inoculum.
(1)
Figur 5: voksen kvinne Daphnia magna. Voksne kvinnelige Daphnia magna med parthenogenetiske egg i Foreldreomsorg og yngelens kammeret. Avstanden mellom hodet og av halen ryggraden brukes til å måle størrelsen på dyret. De røde linjene indikerer størrelsen målinger. Skala bar = 500 µm.
Representative Results
Langsiktig empiriske data er avgjørende for forståelse av evolusjonære dynamikken og utholdenhet av naturlige populasjoner. Slike data er vanligvis utfordrende å få på grunn av logistiske problemer forbundet med tilgang til timelige prøver og behovet for å begå langsiktige datainnsamling. I de to viktige studiene presenteres her, finnes empiriske bevis av svaret til temperaturen på en sentral zooplankter i ferskvann økosystemer over evolusjonære ganger. Dette aktiveres ved bruk av lagdelt sovende egg banker som gir mulighet til å studere svaret historiske populasjoner og deres moderne etterkommere miljøstress i vanlige eksperimentelle innstillinger.
Felles hage eksperiment
Det felles hage eksperimentet viste at alle livshistorie egenskaper svarte temperatur (figur 6 og figur 7). ANOVA analysen avdekket at alle (sub) bestander reagerer på temperatur via plastisitet (tabell 2), bortsett fra dødelighet, som ikke svarer. Bevis av utviklingsendringene (forskjeller blant (sub) befolkningen) ble observert i befolkningsveksten (tabell 2), som betydelig økte i to av tre (sub) befolkninger på 24 ° C (figur 6).
Figur 6: felles hage eksperimentet. Reaksjon normer for livshistorie egenskaper (fruktbarhet, størrelse og alder på modenhet) og befolkningsveksten (r) vises for hver (sub) befolkningen under temperatur oppvarming (24 ° C) i forhold til den felles hage og gjeldende temperatur regimet (18 ° C). Befolkningsveksten 'r' beregnes ved hjelp av Eulerian formelen (1). Konfidensintervall vises. (Sub) populasjoner er fargekodet: (i) blå: 1960-1970; (ii) grønt: 1970-1985; (iii) red: > 1999. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: dødelighet. Dødelighet pr. (sub) innbyggere (1960-1970, 1970-1985; > 1999) vises under oppvarming (24 ° C) i forhold til moderne temperatur regimer (18 ° C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mesocosm eksperiment
Etter fire uker med utvalg, representert ved oppvarming på 24 ° C, frekvensen av tre (sub) befolkninger endret ikke betydelig (χ2 = 0,55, P = 0.76) i forhold til den opprinnelige inoculum (Figur 8). Blant de 30 genotyper inokulert i mesocosm eksperimentet, ble fleste identifisert etter fire uker utvalg (figur 9). Spesielt var 70% av de inokulerte genotyper gjenopprettet, kompatibel med Poissonian forventning om å utvinne minst en representant for hver genotype i et utvalg av 32 personer.
Figur 8: konkurranse eksperiment - befolkningen frekvens. Befolkning-gjennomsnitt median og kvartiler (25th og 75th) vises for tre (sub) bestander av D. magna etter fire uker med valget i mesocosm konkurransen eksperimenter (24 ° C), sammenlignet med en innledende lik frekvensen (på start). (Sub) populasjoner er fargekodet som vist i figur 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: konkurranse eksperiment - genotype frekvens. Genotype frekvenser-gjennomsnitt median og kvartiler (25th og 75th) vises etter fire uker av eksponering for oppvarming (24 ° C) sammenlignet med en innledende lik frekvensen av genotyper (stiplet linje). Navn på x-aksen er inokulerte genotyper ID, gruppert pr. (sub) innbyggere (blå, 1960-1970 green, 1970-1985; rød, > 1999). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Locus | EN | Størrelse utvalg (bp) | Primere (5 - 3') | Fargestoff etikett | Gjenta motiv | TM | |
| B008 | HQ234154 | 150-170 | F: TGGGATCACAACGTTACACAA | VIC | (TC) 9 | 56 | |
| R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC | |||||||
| B030 | HQ234160 | 154-172 | F: CCAGCACACAAAGACGAA | PET | (GA) 11 | 56 | |
| R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT | |||||||
| B045 | HQ234168 | 118-126 | F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC | NED | (TG) 8 | 56 | |
| R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA | |||||||
| B050 | HQ234170 | 234-248 | F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC | 6FAM | (GAA) 6 | 56 | |
| R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG | |||||||
| B064 | HQ234172 | 135-151 | F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA | 6FAM | (TC) 8 | 56 | |
| R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA | |||||||
| B074 | HQ234174 | 196-204 | F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT | NED | (GT) 9 | 56 | |
| R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG | |||||||
| B096 | HQ234181 | 234-240 | F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA | VIC | (AC) 15 | 56 | |
| R: TTGAACCACGTCGAGGATTT | |||||||
| B107 | HQ234184 | 250-274 | F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA | PET | (CT) 8 | 56 | |
| R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG | |||||||
Tabell 1: mikrosatellittmarkør multipleks. NCBI tiltredelse nummer (AN), multiplex informasjonen, PCR primer sekvenser, PCR størrelse utvalg, gjenta motivet, fargestoff brukes til etiketten frem primer og annealing temperaturen (Tm) vises.
| Pop vekstrate (r) | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 30.309 | < 0,001 | |
| Plastisitet (Temp) | 1 | 531.546 | < 0,001 | |
| Evol. Plastisitet (Pop x Temp) | 2 | 65.137 | < 0,001 | |
| Dødelighet | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 2.234 | 0.1162 | |
| Plastisitet (Temp) | 1 | 2.679 | 0.1071 | |
| Evol. Plastisitet (Pop x Temp) | 2 | 1.8657 | 0.164 | |
| Fruktbarhet | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 1.8852 | 0.1633 | |
| Plastisitet (Temp) | 1 | 6.8934 | 0.0117 | |
| Evol. Plastisitet (Pop x Temp) | 2 | 1.6511 | 0.203 | |
| Størrelse på modenhet | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 0.211 | 0.8106 | |
| Plastisitet (Temp) | 1 | 11.1361 | 0.0017 | |
| Evol. Plastisitet (Pop x Temp) | 2 | 0.6586 | 0.5225 | |
| Alder ved forfall | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 0.7811 | 0.4637 | |
| Plastisitet (Temp) | 1 | 8.0764 | 0.0066 | |
| Evol. Plastisitet (Pop x Temp) | 2 | 0.088 | 0.9159 | |
Tabell 2: variansanalyse (ANOVA). Variansanalyse teste om endringer i livshistorie trekk og befolkningsveksten av den oppstandne (sub) befolkningen utsatt for oppvarming er forklart av evolusjonære tilpasning (befolkningen), plastisitet (temperatur behandling), og deres samhandling sikt (utviklingen av plastisitet). Betydelig p-verdier (p< 0,05) vises i fet skrift.
Supplerende Video 1: prøvetaking av sediment kjerner. Bruk av en Big Ben corer vises. Big Ben er en kjerne tube ca 1.5 m lang med en indre rør diameter på 14 cm. Det består av et stempel på et tau og en corer hodet, som stenger er tilknyttet for å kjøre tuben ned i sedimentene. En kjerne catcher brukes til å støtte kjernen røret som distribueres fra et lite fartøy. Stempelet skyves ned i sedimentet av gravitasjonsfeltet press. En ramme brukes til å støtte kjernen røret i ekstruderingsprosessen utført med en modifisert flaske jack som presser stempelet oppover. Hver sediment laget er samlet på flat metall og overført til gjennomsiktig prøvetaking poser for langtidslagring [mørkt og kaldt (4 ° C) forhold]. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 2: Sediment sikting. Utrustningen for sikting sedimenter er en presisjon skala, hvit prøvetaking skuffer og geologiske sikter. Fra hvert sediment lag beholdes minst 5 g for radiometric dating. Resten av sediment brukes til å isolere ephippia. Sediment er soldet gjennom to geologiske sikter, med 1 mm og andre med 125 µm mesh størrelsen, stablet oppå hverandre. Middels helles på 1 mm sil å skille leire, store dyr og partikler. Middels strømmet på andre silen med 125 µm mesh skiller D. magna ephippia og små partikler. Dele sediment overføres deretter til en hvit prøvetaking skuff. D. magna ephippia er oppdaget av øyet i hvit bakgrunn skuffen. Ephippia fra hvert lag er samlet i separate Petri retter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 3: utpakking. Under en stereomicroscope, D. magna ephippia åpnes med microdissection tang ved å legge press på ryggen av chitin saken. Indre egg membranen fjernes delikat og hvile egg forsiktig overført med en Pasteur pipette til en Petriskål inneholder 10 mL av medium. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 4: klekking. Etter eksponering for en lang fotoperiode og 20 ° C fortsetter embryo utvikling mellom 48 timer og ukene. Når utbyggingen er ferdig, embryoene bryte fri fra egg shell og svømme fritt i medium. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
På grunn av den høye varmeledningsevne vann er ferskvann økosystemer høyere risiko for tap av biologisk mangfold enn Terrestre økosystemer mot global oppvarming34. Det er derfor avgjørende å forstå svar keystone arter i disse økosystemene og identifisere mestring mekanismene for å overleve termisk stress. Forståelsen av disse mekanismene på arter og samfunnet kan bidra til å forutsi hvordan arter er påvirket av global oppvarming og hvordan effekten på individuelle arter kaskader til andre nivåer i næringskjeden. Til slutt, forstå mekanismer av Svar å global oppvarming kan identifikasjon av Utbedring strategier for å redusere utryddelse.
Selskapsstudier presenteres her viser at responsen på D. magna temperaturøkningen er pervasively formidlet av plastisitet i livshistorie egenskaper og at svar på temperaturøkningen alene ikke pålegger klart fitness kostnader, i hvert fall i den befolkningen studert her. Høy plastisitet i livshistorie egenskaper støttes av ikke-signifikante forskjeller i konkurrerende evner mellom de (sub) i nærvær av oppvarming. Men kan langsiktige konkurranse eksperimenter på flere befolkninger være nødvendig å generalisere disse funnene.
Oppstandelsen av sovende stadier gir en enestående ressurs for å studere mekanismer for tilpasning og baner av en art utviklingen gjennom tid10. Dyreplankton arter nytte av en rask generasjonstid (ca 2 uker) og levedyktigheten til sovende stadier, som lar en stamfar konkurrere headtohead mot sin egen etterkommere eller 'spill' utviklingen som starter fra ulike siste stater. Oppstandelse økologi egentlig kan undersøke om et bestemt evolusjonære resultat er betinget av en tidligere hendelse. Identifikasjon av genetiske elementer av evolusjon er mulig i laboratorieforsøk mikroorganismer som er 'forfedrenes linjer' frosset og gjenopplivet i komparativ analyse med deres utviklet etterkommer6. En av viktigste begrensningene i samarbeid med laboratoriet organismer er imidlertid at "forfedrenes staten" er en allerede skiftet planlagt. Studiet av sovende stadier lar prøvetaking av prøver fra tid trevirket uansett stress (f.eks, uberørte miljøforhold) og måle evolusjonære baner fra uforstyrret miljømessige forhold til ulike siste stater til moderne tid. De siste årene, har studier av DNA polymorfisme i oppstandne eller fortsatt sovende dyreplankton stadier gitt viktig innsikt i siste demografiske og adaptive prosesser som har bidratt til den genetiske sammensetningen av dagens befolkninger14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. med høyere tilgjengelighet til høy gjennomstrømning sekvensering teknologi, genom og transcriptome av oppstandne eller fortsatt sovende trinn kan være sekvensielt og typen og nummeret av genetiske endringer akkumulert i utvikling befolkninger tiden målt.
Oppstandelsen SOP presenteres her har viktige programmer innen multi-omics på to nivåer. Multi-omics teknologi kan brukes for oppstandne prøver, slik at en uttømmende analyse av molekylære elementene i adaptive svar til miljømessige utvalg press. I tillegg kan omics teknologier brukes decapsulated men fortsatt sovende stadier. Så langt, har bruk av høy sekvensering teknologiene å hvile stadier vært begrenset av kravet om en stor mengde input materiale. Disse begrensningene blir løftet37. Redusere kravene for input materialer og fremgang i nanofluidics, hele genomet sekvensering (WGS) er nå mulig fra så lite som 1 ng eller noen pg starter materiale38. Bruk av hele genomet forsterkning (WGA) og hele transcriptome forsterkning (WTA) teknikker, aktivere anriking av DNA og RNA fra svært små mengder vev, har revolusjonert både metagenomics39,40 og medisinsk forskning41. Disse teknologiene gjelder decapsulated sovende egg kan overskride begrensninger knyttet levedyktigheten til sovende stadier og undersøke med utvidede tidsperioder (f.eks, århundrer).
Oppstandelsen av virvelløse samfunn produserer hvile stadier kan samfunnet historier med kjente endringer i det naturlige landskapet eller miljøendringer avledet fra analyser av sedimenter orsoils2. Analyse av samfunnet endringer i respons til miljøproblemene gir oss evne å kvantifisere øko-evolusjonære tilbakemeldinger42 som har store konsekvenser på befolkningen utholdenhet43, trophic interaksjoner44 , samfunnet montering45, og endringer i økosystemet funksjoner og tjenester46. Endelig er nøyaktige spådommer om biologiske svar til miljøproblemene viktig å få beskyttelse av biologisk mangfold47. Gjeldende prediktive modeller er unøyaktig i denne forbindelse fordi de ikke ta i kontoen viktige biologiske mekanismer som demografi, spredning, utviklingen og arter interaksjoner. Forstå hvordan endre disse prosessene over tid og bruker denne informasjonen før prognosen speile forbedrer vår evne til å forutsi arter og samfunnet utholdenhet mot miljømessig endre2.
Anvendelsen av SOP presenteres her er ikke uten utfordringer. Den største begrensningen av gjenopplive sovende stadier er behovet for spesialisert utstyr for prøvetaking. I tillegg krever hele prosessen, fra sedimenter sikting til etablering av klonal kulturer, hands-on tid.
Noen av punktene SOP presenteres her er lett kan overføres til andre Daphnia arter. Dette er: prøvetaking, etablering av klonal linjer og eksperimentell design. Men kan andre trinn av SOP kreve ytterligere optimalisering tilpasset arter under studien. Utpakking brukes ofte D. magna prøver å forbedre klekking suksess. Men kan denne tilnærmingen ikke være egnet for mindre prøver. Klekking stimuli kan også variere blant arter48 og blant conspecific prøven49. Derfor kan en ad hoc optimalisering av klekking trinnene på SOP være nødvendig før programmer til andre krepsdyr. Mens klekking suksessen av D. magna befolkningen opp fra innsjøen Ring (30,5% over sedimentære arkivet) er i tråd med tidligere resultater49, varierer klekking suksess med bevaring delstaten sediment, arten 50,51, og den geografiske opprinnelsen til sediment48. Fremtidige studier på mekanismer som regulerer oppføringen og fremdrift gjennom faser av diapause er nødvendig for å identifisere optimal klekking stimuli tilpasset forskjellige arter.
Til slutt, bakgrunn kunnskap av studien, spesielt tilstedeværelsen av arten av interesse over tid, anbefales. Dette kan oppnås via loggposter. Hvis loggposter ikke er tilgjengelig, er prøvetaking og screening på overflaten lag av innsjø sedimenter før kjernen prøvetaking tilrådelig, selv om det kan gi informasjon på siste historien.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NERC høydepunkter tilskudd (NE/N016777/1). Ensis Ltd, vitenskapelige miljøtjenester, miljømessig endre forskningssenter, University College London samplet og datert sediment kjernen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
| piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
| precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
| geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh |
| geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh |
| white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
| pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL |
| stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
| petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
| glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
| glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
| glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
| statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
| microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
| image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
| mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
| mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick - Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
| AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
| size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers |
| ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |
References
- Lindenmayer, D. B., et al. Value of long-term ecological studies. Austral Ecol. 37 (7), 745-757 (2012).
- Orsini, L., et al. The evolutionary time machine: using dormant propagules to forecast how populations can adapt to changing environments. TREE. 28, 274-282 (2013).
- Grant, P. R., Grant, B. R. Unpredictable evolution in a 30- year study of Darwin's finches. Science. 296, 707-711 (2002).
- Lohbeck, K. T., Riebesell, U., Reusch, T. B. H. Adaptive evolution of a key phytoplankton species to ocean acidification. Nature Biosci. 5, 346-351 (2012).
- Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
- Barrick, J. E., Lenki, R. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
- Kawecki, T. J., et al. Experimental evolution. TREE. 27, 547-560 (2012).
- Fukami, T., Wardle, D. A. Long-term ecological dynamics: reciprocal insights from natural and anthropogenic gradients. P Roy Soc B-Biol Sci. 272, 2105-2115 (2005).
- Merila, J., Hendry, A. P. Climate change, adaptation, and phenotypic plasticity: the problem and the evidence. Evol Appl. 7 (1), 1-14 (2014).
- Evans, M. E., Dennehy, J. J. Germ banking: bet-hedging and variable release from egg and seed dormancy. Q Rev Biol. 80 (4), 431-451 (2005).
- Appleby, P. G. Chronostratigraphic techniques in recent sediments. 1, Kluwer Academic Publisher. (2001).
- Appleby, P. G., et al. PB-210 dating by low background gamma-counting. Hydrobiologia. 143, 21-27 (1986).
- Bidle, K. D., Lee, S. H., Marchant, D. R., Falkowski, P. G. Fossil genes and microbes in the oldest ice on Earth. PNAS. 104, 13455-13460 (2007).
- Geerts, A. N., et al. Rapid evolution of thermal tolerance in the water flea Daphnia. Nat Clim Change. 5, 665-668 (2015).
- Jansen, M., et al. Thermal tolerance in the keystone species Daphnia magna-a candidate gene and an outlier analysis approach. Mol Ecol. 26 (8), 2291-2305 (2017).
- Hairston, N. G. Jr, De Stasio, B. T. Jr Rate of evolution slowed by a dormant propagule pool. Nature. 336, 239-242 (1988).
- Hairston, N. G. Jr, et al. Lake ecosystems: Rapid evolution revealed by dormant eggs. Nature. 401, 446 (1999).
- Weider, L. J., Lampert, W., Wessel, M., Colbourne, J. K., Limburg, P. Long-term genetic shifts in a microcrustacean egg bank associated with anthropogenic changes in the Lake Constance ecosystem. Proc. R. Soc. Lond. B. 264, 1613-1618 (1997).
- Kerfoot, W. C., Robbins, J. A., Weider, L. J. A new approach to historical reconstruction: Combining descriptive and experimental paleolimnology. Limnol Oceanogr. 44 (5), 1232-1247 (1999).
- Cousyn, C., et al. Rapid, local adaptation of zooplankton behavior to changes in predation pressure in the absence of neutral genetic changes. PNAS. 98, 6256-6260 (2001).
- Decaestecker, E., et al. Host-parasite Red Queen dynamics archived in pond sediment. Nature. 450, 870-874 (2007).
- Miner, B. E., De Meester, L., Pfrender, M. E., Lampert, W., Hairston, N. G. Linking genes to communities and ecosystems: Daphnia as an ecogenomic model. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1735), 1873-1882 (2012).
- Ebert, D. Ecology, epidemiology, and evolution of parasitism in Daphnia. , National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology. (2005).
- Orsini, L., et al. Temporal genetic stability in natural populations of the waterflea Daphnia magna in response to strong selection pressure. Mol Ecol. 25, 6024-6038 (2016).
- IPCC. Summary for policymakers. , Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA. 1-32 (2014).
- Patmore, I. R., et al. Big Ben: a new wide-bore piston corer for multi-proxy palaeolimnology. J Paleolimnol. 51 (1), 79-86 (2014).
- Wright, H. E. Jr A square-rod piston sampler for lake sediments. J Sedimentary Petrology. 37, 975-976 (1967).
- Kilham, S. S., Kreeger, D. A., Lynn, S. G., Goulden, C. E., Herrera, L. COMBO: a defined freshwater culture medium for algae and zooplankton. Hydrobiologia. 377, 147-159 (1998).
- Klüttgen, B., Kuntz, N. orbert, Ratte, H. T. Combined effects of 3,4-dichloroaniune and food concentration on life-table data of two related cladocerans, Daphnia magna and Ceriodaphnia quadrangula. Chemosphere. 32, 2015-2028 (1996).
- R: A language and environment for statistical computing. , Vienna, Austria. (2017).
- Jansen, B., Geldof, S., De Meester, L., Orsini, L. Isolation and characterization of microsatellite markers in the waterflea Daphnia magna. Mol Ecol Res. 11, 418-421 (2011).
- Orsini, L., Spanier, K. I., De Meester, L. Genomic signature of natural and anthropogenic stress in wild populations of the waterflea Daphnia magna: validation in space, time and experimental evolution. Mol Ecol. 21, 2160-2175 (2012).
- Verberk, W. C. E. P., et al. Does oxygen limit thermal tolerance in arthropods? A critical review of current evidence. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 192, 64-78 (2016).
- Frisch, D., et al. A millennial-scale chronicle of evolutionary responses to cultural eutrophication in Daphnia. Ecol Lett. 17 (3), 360-368 (2014).
- Yashina, S., et al. Regeneration of whole fertile plants from 30,000-y-old fruit tissue buried in Siberian permafrost. PNAS. 109, 4008-4013 (2012).
- Southam, A. D., Weber, R. J. M., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nat Protoc. 12 (2), 310-328 (2017).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. Plos One. 9 (11), (2014).
- Baym, M., et al. Inexpensive Multiplexed Library Preparation for Megabase-Sized Genomes. Plos One. 10 (5), 6 (2015).
- Bourcy, C. F. A., et al. A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome Amplification Methods. Plos One. 9 (8), (2014).
- Hasmats, J., et al. Assessment of whole genome amplification for sequence capture and massively parallel sequencing. PLoS One. 9 (1), e84785 (2014).
- Becks, L., Ellner, S. P., Jones, L. E., Hairston, N. G. Jr The functional genomics of an eco-evolutionary feedback loop: linking gene expression, trait evolution, and community dynamics. Ecol Lett. 15 (5), 492-501 (2012).
- Ellner, S. P., Geber, M. A., Hairston, N. G. Does rapid evolution matter? Measuring the rate of contemporary evolution and its impacts on ecological dynamics. Ecol Lett. 14 (6), 603-614 (2011).
- Yoshida, T., Jones, L. E., Ellner, S. P., Fussmann, G. F., Hairston, N. G. Jr Rapid evolution drives ecological dynamics in a predator-prey system. Nature. 424 (6946), 303-306 (2003).
- Urban, M., et al.
- Dokulil, M. T. Eutrophication: Causes, Consequences and Control. , Springer. Netherlands. 81-88 (2014).
- Urban, M. C., et al. Improving the forecast for biodiversity under climate change. Science. 353 (6304), (2016).
- Schwartz, S. S., Hebert, P. D. N. Methods for the activation of the resting eggs of Daphnia. Freshwater Biol. 17, 373-379 (1987).
- Vanderkerhove, J., et al. Hatching of cladoceran resting eggs: temperature and photoperiod. Freshwater Biol. 50, 96-104 (2005).
- Caceres, C. E. Temporal variation, dormancy, and coexistence: a field test of the storage effect. PNAS. 94 (17), 9171-9175 (1997).
- Caceres, C. E. Interspecific variation in the abundance, production, and emergence of Daphnia diapausing eggs. Ecology. 79 (5), 1699-1710 (1998).
