Summary
Langtidsstudier er nødvendigt for at forstå processen med udviklingen og mekanismer for tilpasning. Disse undersøgelser kræver som regel, forpligtelser ud over levetid af forskere. Her, er en kraftfuld metode beskrevet som dramatisk forskud state-of-the-art dataindsamling for at generere tidsseriedata i naturlige systemer.
Abstract
Langtidsstudier aktiverer identifikation af øko-evolutionære processer, der finder sted over længere perioder. Derudover giver de centrale empiriske data, der kan bruges i prognosemodeller for at forudsige evolutionære svar af naturlige økosystemer til fremtidige miljøforandringer. Men bortset fra nogle få undtagelsestilfælde, langtidsstudier er knappe på grund af logistiske vanskeligheder forbundet med at få adgang til tidsmæssige prøver. Tidsmæssige dynamics er ofte studerede i laboratoriet eller i kontrolleret mesokosmoslangtidstest eksperimenter med særlige undersøgelser, at rekonstruere evolutionen af naturlige populationer i naturen.
Her, er en standard operating procedure (SOP) fastsat til at genoplive eller genoplive hvilende Daphnia magna, en udbredt zooplankton keystone arter i vandøkosystemer, at dramatisk fremme den state-of-the-art langsgående dataindsamling i naturlige systemer. Opstandelse månedvist var defineret i 1999 af Kerfoot og kollegaer, selvom første forsøg på rugeæg diapausing zooplankton æg dateres tilbage til slutningen af 1980erne. Siden Kerfoots skelsættende papir anvendes metodologi resurrecting zooplankton arter oftere og oftere, selvom formeret blandt laboratorier kun via direkte vidensoverførsel. Her, en SOP er beskrevet som giver en trinvis protokol på praksis af resurrecting hvilende Daphnia magna æg.
To vigtige undersøgelser er forudsat i som fitness svar genoplivet Daphnia magna befolkninger til opvarmning måles, capitalizing om muligheden for at studere historiske og moderne befolkninger i de samme indstillinger. Endelig diskuteres anvendelsen af næste generation sequencing teknologier til genoplivede eller stadig sovende faser. Disse teknologier giver hidtil uset magt i dissekere de processer og mekanismer, evolution hvis anvendes til befolkninger, der har oplevet ændringer i selektivt pres over tid.
Introduction
Langtidsstudier er afgørende for at forstå økologiske og evolutionære processer i naturen og i vurderingen af hvordan arter reagere på og fortsætter under miljøændringer1. Dette skyldes, at øko-evolutionære processer sker på tværs af generationer og sker der ændringer i miljøet over lang tid spænder. Desuden giver langsigtede undersøgelser centrale empiriske data, der forbedrer nøjagtigheden af prædiktiv modellering til prognose evolutionære svar af naturlige økosystemer til miljøforandringer2. Rigtigheden af disse modeller er af afgørende betydning at gennemføre forvaltnings- og bevarelsesforanstaltninger strategier for at bevare biodiversiteten og økosystemfunktionerne.
Bortset fra nogle få undtagelsestilfælde (f.eks., Galapagos Darwin finker3 og alger4) er langtidsstudier stort set begrænset til arter med kort generationstid, der kan overføres i laboratoriet5,6 , 7 , 8. dermed processer bag evolutionære dynamics fortsat undvigende. På grund af logistiske vanskeligheder forbundet med at få adgang til tidsmæssige prøver, empiriske data er undersøgt oftere i en rumlig end i en tidsmæssig sammenhæng, og tidsmæssige øko-evolutionære processer udledes eller modelleret fra geodata. Denne fremgangsmåde er kendt som plads-for-time substitution9, hvorved rummet er vedtaget som en surrogat at studere tidsmæssige evolutionære dynamics. Den største begrænsning af plads-for-time substitution er, at satserne for tilpasning på forskellige rumlige skalaer adskiller sig fra tidsmæssige variation i den samme population. dermed er slutninger baseret på udskiftning af tid med plads forudindtaget10.
Et stærkt alternativ, der giver mulighed for at studere evolutionære dynamics i naturlige økosystemer over tid er analysen af økologiske og genetiske ændringer i arter producerer inaktive faser11. Disse hvilende faser ophobes til form stratificeret biologiske arkiver, der kan dateres præcist og paleolimnologically karakteriseret12,13. Vigtigere, kan disse hvilende faser genoplivet og bruges i laboratorieforsøg, hvor deres evolutionære reaktion på ændringer i miljøet kan måles direkte. Historiske befolkninger kan være konkurrerede mod deres moderne udviklet efterkommere at studere fitness ændringer og funktionen af gener, der udvikler sig i takt med ændringer i miljøet14,15,16.
Hvilende faser omfatter frø, cyster, sporer, og æg banker. Selv om de første undersøgelser på genoplivet hvilende æg kan dateres tilbage til den sent 1980s17, og en håndfuld af undersøgelser har anvendt denne teknik i den tidlige 1990s18,19, har opstandelse månedvist været formelt etableret af skelsættende papiret af Kerfoot og kollegaer i 199920. Denne praksis har været anvendt hovedsageligt i paleolimnological rekonstruktioner af ferskvandsarter17,21,22. Dog er en SOP endnu ikke tilgængelige. Her, er en trinvis beskrivelse af opstandelsen protokollen anvendes til hvilende æg af zooplankton arter Daphnia magna fastsat, fra prøveudtagning af sediment til etablering af klonede kulturer fra hatchlings. Trin af SOP, der let kan overføres til andre arter af dafnier, samt foranstaltninger, der kan kræve yderligere optimering, der diskuteres.
Dafnier er ferskvand zooplankters stede i fleste af lotiske levesteder23 . Dafnier arter er enten obligat aseksuel eller cykliske parthenogens. D. magna er en cyklisk parthenogen, der gengiver alsidighed under gunstige miljømæssige forhold24. Når miljømæssige forhold forværres, opstår, mandlige produktion og seksuel rekombination fører til dannelsen af befrugtede æg, der komme i en tilstand af vækstdvale beskyttet fra miljøet af chitin tilfælde kaldet ephippium. En del af disse hvilende æg klækkes når gunstige miljømæssige forhold vender tilbage. En stor del af de hvilende egg bank har dog aldrig en chance for at luge og dermed opbygge biologisk arkiver over tid. Hvilende faser forblive begravet i sediment af søer og damme og kan genopstå for studiet af evolutionære dynamics over længere perioder. Fordi hvilende æg D. Magna er resultatet af seksuel rekombination, er de en god repræsentation af den naturlige genetiske mangfoldighed af arter25. De kan desuden opretholdes via klonede reproduktion i laboratoriet. Disse egenskaber giver den unikke fordel af isogene modelorganismer, samtidig bevare den naturlige genetiske mangfoldighed.
To vigtige undersøgelser præsenteres for at demonstrere fordelene ved direkte sammenligning af historiske og moderne efterkommere af den samme befolkning D. Magna oplever miljømæssige udvælgelse pres over tid. D. magna prøver blev genoplivet fra Lake Ring (Danmark), en lavvandet (5 m dybde; overflade 22 ha) blandet Dam, der har oplevet en stigning i gennemsnitlige temperatur og hedebølger forekomsten over tid. D. magna (sub) populationer blev genoplivet langs denne tidsmæssige forløb der strækker sig over 60 år (1960-2005) og studerede for at undersøge evolutionære reaktion på temperatur opvarmning. I den første undersøgelse i en fælles haven eksperiment, blev ændringer i fitness-linked livshistorie træk målt som reaktion på en stigning i temperatur på + 6 ° C, i overensstemmelse med forudsigelser af det Mellemstatslige Panel for klimaændringer for de kommende 100 år 26. i den anden undersøgelse, en mesokosmoslangtidstest eksperiment blev brugt til at måle tre konkurrencedygtige evner (under) populationer under opvarmning. Disse eksperimenter kombineret viser, at i tilstedeværelse af opvarmning som den eneste stress, alle livshistorie træk og befolkninger viser en høj grad af plasticitet og har lige konkurrencedygtige evner. Disse resultater tyder på, at opvarmning som en enkelt stress ikke pålægger signifikant fitness omkostninger, i det mindste i befolkningen studerede her.
Protocol
De følgende SOP gives en trinvis beskrivelse af den protokol, der bruges til at genoplive Daphnia magna hvilende æg, herunder en detaljeret beskrivelse af prøveudtagning, isolation af ephippier fra sedimenter og etablering af klonede kulturer ( Figur 1).
Figur 1: trin for trin guide til opstandelse Daphnia magna. Sediment fra en ferskvands naturtype (A) er stikprøven med et stempel corer (B). Sediment core (C) er skåret i trinvise lag af 1 eller 0,5 cm (D). Hvert lag af sediment er gemt i en stikprøve zip-lock pose (E) i mørke og kolde betingelser (4 ° C). Hvert lag af sediment, vejes og sigtes, ved hjælp af geologiske sier (1 mm og 125 µm maskestørrelser, F). Hvid baggrund bakker bruges til at isolere Daphnia magna ephippier (G). Decapsulated hvilende æg (H) er overført til petriskåle og udsat for lys og temperatur stimuli til at fremkalde rugeæg. Hatchlings er overført til separate krukker (jeg) for at etablere isoclonal linjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
1. stikprøveudtagning af Sediment kerner
- Eksempel sediment fra søer eller damme ved hjælp af et stempel corer. Denne protokol anvendes Big Ben27, en core tube ca 1,5 m i længden med en indre rørdiameter på 14 cm. Big Ben består af et stempel på et reb og en corer hoved, som stænger er knyttet til at køre røret ind i sedimentet. En core catcher aids støtte fra core tube når fuld af sediment. For at presse sedimentet, rammer holder core tube oprejst og stationære, og en modificeret flaskedonkraft bruges til at skubbe stemplet opad under ekstruderingsprocessen (supplerende Video 1).
- Lavvandede vandhuller på mindre end 1 m i dybden, bruge en plexiglas tyngdekraften corer på ikke mere end 6 cm i diameter manuelt blev skubbet i sedimentet.
- For dybe søer (> 6 m dybde), bruge Livingston stempel kernehusudtagere28 eller enkelt drev Griffith sediment kernehusudtagere med aids i en forankrede ponton båd. Livingstone-type drive rod stempel corer kan bruges i vand op til omkring 30 m dybt til at indsamle successive one-meter drev af blød til konsolideret sø sedimenter. Enkelt drev Griffith corer består af en simpel, men solid core hoved, der forbinder standard polycarbonat rør til Livingstone drev stænger. Kernehusudtagere er skubbet ind i sediment med stænger, og et stempel indeholder suge behov for genopretning af sediment (figur 2).
- Til hentning af kontinuerlig, bruge uforstyrret kerner, vibracoring. Disse kernehusudtagere arbejde på en række forskellige vanddybder og kan hente kerne prøver af forskellige længder, afhængigt af sediment litologi. Lav amplitude vibrationer, der overføres fra vibracore leder ned gennem den vedlagte tønde eller core tube væske sedimenter, aktivering core barrel knyttet til vibracore enheden at trænge ind i de flydende sedimenter. Nogle vibracorers er lille, let og transportabel, andre store tunge enheder, der kan kun installeres fra store fartøjer. Valg af kernehusudtagere afhænger litologi af sediment.
- Skær kernen vandret i trinvise lag 1 cm eller derunder ved hjælp af en flad metal overflade (supplerende Video 1). Sediment kernehusudtagere som den, der anvendes her er designet til at reducere hydrostatiske pres på ekstrudering, reducere forstyrrelse af sediment lag. Når andre kernehusudtagere bruges, kan den ydre skorpe af hver sediment lag fjernes med en cookie-cutter slags blade at begrænse forurening blandt lag.
- Indsamle hver sediment lag i en separat prøvetagningssæk (supplerende Video 1), og gemme i mørke og kulde (4 ° C) betingelser.
- Indsamle mindst 5 g af sediment fra alle lag til radiometrisk datering. Som radiometrisk datering er en etableret protokol til en detaljeret beskrivelse af de dating assay, henvise til eksisterende publikationer12,13.
Figur 2: tegneserie af stemplet coring procedure. Stempel corer, et hult rør med en indre glidende segl (stempel), der producerer en svag støvsuger. Når stemplet rører grænsefladen sediment-vand, vægt skubber core tønde i sedimentet og vakuum forårsager sedimentet bliver kernehus for at gå ind og gå op i røret uden at forstyrre sediment lag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. sigtning af Sediment lag
- Bruger en præcision skala, veje hver sediment lag for fremtidig reference. Bruge areal og vægt beregne arter tæthed i søen.
- Sigten hver sediment lag ved hjælp af to geologiske sier stablet oven på hinanden. Den første si har en maskestørrelse på 1 mm og ler, store hvirvelløse dyr og partikler, fx frø, planter og insekter, der adskiller fra resten af sedimentet. Den anden si har en maskestørrelse på 125 µm og adskiller D. manga ephippier og små partikler fra resten af sediment (supplerende Video 2).
-
Overføre små prøver af sediment brøkdel indsamlet på 125 µm mesh sigte til en hvid baggrund bakke. Afhængigt af sediment, kan mindre eller større delprøver af sediment overføres på hver gang.
- Tilføje små mængder (op til 200 mL) af medium til prøveudtagning hvid bakke til genopslæmmes overførte sediment brøkdel og lette øje spotting af ephippier (figur 3). Mediet bruges til resuspend sedimentet kan være dechlorinated vand fra hanen, boring vand, COMBO29eller ADaM medium (Aachener Daphnien)30. Herefter, vil begrebet 'medium' blive brugt til at henvise til enten eller alle de nævnte løsninger.
Figur 3: Daphnia magna ephippium. Hvilende Daphnia magna æg umiddelbart efter udpakning. Ephippium (A), den indre æg membran (B) og de sovende æg (C) vises. Skalalinjen = 500 µm.
3. udpakning af ephippier og rugeæg
- Med en engangs Pasteur pipette eller ved hjælp af microdissection pincet, overførsel individuelle ephippier til petriskåle fyldt med 10 mL af medium. Brug mindst en petriskål pr. lag af sediment.
- Under et stereo mikroskop, decapsulate hver ephippier, ved hjælp af microdissection pincet ved at tvinge åbne sagen kitin (supplerende Video 3). Fjerne den hvilende æg indre membran fint, være opmærksom ikke forstyrre æggene, og overføre dem til petriskålen fyldt med medium ved hjælp af Pasteurs pipette. Udpakning øger rugeæg succes i D. magna; men, det kan ikke være påkrævet eller det kan være udfordrende for andre dafnier arter producerer mindre ephippier.
- Udsætte decapsulated æg til en fuld spektrum lang dag lysperiode lys (16:8 lys: mørke) og høj temperatur (20 ± 1 ° C) til at fremkalde klækning i en kontrolleret temperatur enhed (inkubator) eller værelse. Klækningen sker mellem 48 h og flere uger (op til fire; Supplerende Video 4). I mangel af udpakning, udsætte direkte ephippier til udrugning stimuli (lang dag lysperiode lys (16:8 lys: mørke) og høj temperatur (20 ± 1 ° C)).
4. fastlæggelse af Isoclonal former for Daphnia magna
- Etablere isoclonal linjer fra enkelt hatchlings ved at overføre enkelte D. magna fra trin 3.3 at adskille krukker fyldt med 200 mL medium ved hjælp af en engangs Pasteur pipette. Hver enkelt er genetisk forskellige, bliver resultatet af seksuel rekombination.
- Opretholde isoclonal linjer på ubestemt tid i stock betingelser bestående af 10 ± 1 ° C, 16:8 lys: mørke regime, fodret ugentligt med 0,2 mg C/L af Chlorella vulgaris eller andre grønne alger (fx Scenedesmus obliquus). Forny mediet hver tredje uge. Stock betingelser kan ændre med temperatur, fodring regimer, og arter.
5. vigtige undersøgelser
Bemærk: En beskrivelse af to vigtige undersøgelser tilbydes i hvilke opstandne D.magna (sub) populationer af den sedimentære Arkiv af Lake Ring (Danmark) bruges til at vurdere den evolutionære reaktion på opvarmning. Tre (under) populationer var genopstået fra de følgende perioder: 1960-1970, 1970-1985, og > 1999. D. magna rugeæg succes fra arkivet sedimentære varierede mellem 11% og 58% (figur 4). Fra hatchlings fremstillet af hver fastsat tidsfrist, blev en tilfældig delmængde valgt for de to vigtigste undersøgelser beskrevet her. Disse undersøgelser blev designet til at vurdere om (under) populationer genopstå fra forskellige tidsperioder langs temperaturgradient viste forskelle i fitness-linked livshistorie træk (5.1), og om de havde forskellige konkurrencedygtige evner (5.2) efter eksponering for opvarmning.
Figur 4: rugeæg succes i en sedimentære Arkiv stikprøven fra Lake Ring. Andelen af succesfulde hatchlings langs den sedimentære arkiv over søen Ring bruges i de afgørende undersøgelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Fælles haven eksperimenter
- Overføre ti hatchlings pr. (sub) indbyggere fra stock kulturer til fælles haven betingelser: 16 ° C; lang lysperiode (16:8 lys: mørke regime); feed dagligt med 0,8 mg C/L af Chlorella vulgaris, og forny medium hver anden dag. Vedligeholde hatchlings i fælles haven betingelser for mindst to generationer (ca. 45 dage). Fælles haven betingelser reducere interferens fra moderens effekten og synkronisere reproduktion blandt hatchlings.
- Ved frigivelsen af den anden yngel i yngel kammer, overføre voksne hunner fra anden generation til 500 mL glas fyldt med medium indtil de frigive det andet kuld af ungfisk.
- Tilfældigt overføre enkelte ungfisk af 24 – 48 h, født fra det andet kuld af anden generation, til 100 mL glas fyldt med medium og udsat til de følgende forsøgsbetingelser: 18 ° C (nuværende temperatur i søen) og 24 ° C (opvarmning, temperatur forventede af IPCC 26 for de kommende 100 år), 16:8 lys: mørke regime, og foderet daglig 0,8 mg C/L af Chlorellavulgaris.
- På hvert eksperimentelle dyr, måle størrelsen på modenhed med et stereomikroskop som afstanden mellem hovedet og bunden af hale rygsøjlen (figur 5). Fotografere hvert dyr og efterfølgende analysere dens størrelse ved hjælp af et passende billede software.
- Måle alderen, modenhed: den dag, hvor æggene er observeret for første gang i yngel salen.
- Måle dødeligheden: antallet af uddøde enkeltpersoner under eksperimentet.
- Måle frugtbarheden: det totale antal afkom udgivet i første og anden klonal reproduktion.
- Måle befolkningstilvækst, anslået ved hjælp af Eulers ligning (1):
(1)
Hvor lx er andelen af overlevelse på alder x, er bx antallet af nyfødte produceres pr. overlevende person på alder x, og r er den naturlige iboende stigningstakt. - Udføre statistiske analyse ved hjælp af kommercielt tilgængelige software. Her brug Rasmussen31 afbilde reaktion normer (fænotypiske udtryk for en enkelt genotype på tværs af miljøer) for hver livshistorie træk, ved hjælp af pakken ggplot2. Beregne dødelighed pr. befolkning via overlevelses analyse (R pakke rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Endelig, udføre en variansanalyse (ANOVA, tabel 2) i Rasmussen31 at vurdere, om effekten af temperatur på træk kan forklares ved evolution (forskelle blandt befolkninger), plasticitet (respons på behandlingen) eller udvikling af plasticitet (befolkning x behandling).
-
Konkurrence eksperiment
- Overføre ti hatchlings pr. indbyggere fra stock kulturer til fælles haven betingelser: 20 ° C, lang lysperiode (16:8 lys: mørke regime), feed dagligt med 0,8 mg C/L af Chlorella vulgaris, og forny medium hver anden dag. Vedligeholde fælles haven betingelser for mindst to generationer (ca. 45 dage) til at reducere interferens fra moderens effekter.
- Tilfældigt tildele fem ungfisk af 24 til 48 h fra det andet kuld af de anden generationer af hver Nyudklækket til eksperimenterende mesocosms (20 L plast akvarier fyldt med medium), i tre, med en tæthed på 10 dyr/L.
- Udsætte mesocosms til 24 ° C, 16:8 L:D regime, og foder dagligt med 0,8 mg C/L af Chlorellavulgaris i en kontrolleret temperatur kammer eller inkubator for et minimum af fire uger (> 3 klonede generationer).
- Frasortering hver mesokosmoslangtidstest ugentligt, forfriskende 10% af medium til at simulere en befolkning dynamik, dafnier kan støde på i det naturlige miljø. Pålægge aflivning ved at fjerne en kendt mængde af medium og dyr fra hvert akvarium (1,2 L i dette tilfælde), og ved at erstatte de nedslagne volumen med friske medium. Start den nedslagning regime efter de eksperimentelle dyr bliver kønsmodne (dag 10).
- Ved udgangen af den fjerde uge prøve 32 dyr fra hver mesokosmoslangtidstest til at vurdere ændringer i genotypiske sammensætning i forhold til den oprindelige inokulum.
- Placere enkelte dafnier i microcentrifuge rør og fjerne overskydende væske ved hjælp af Pasteurs pipette.
- Flash fryse enkelte rør i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.
- Uddrag genomisk DNA fra enkelte individer ved hjælp af tilgængelige protokoller og efter fabrikantens anvisninger.
- Forstærke det ekstraherede DNA ved hjælp af en række genetiske markører tilstrækkeligt til at give en unik multilocus genotype pr. Nyudklækket. Her, blev 8 microsatellites anbragt i en enkelt multipleks (M01, tabel 1) brugt efter fastlagte protokoller32,33.
- Genotype forstærket fragmenter på en fragment analyzer.
- Gennemføre fragment analyser med en kommerciel eller frit tilgængelig software ved hjælp af en passende størrelse standard.
- Vurdere genotypiske sammensætning i slutningen af forsøget af genotypebestemmelse 32 personer med et sæt af microsatellite loci som beskrevet33, og beregning af hyppigheden af hver genotype i slutningen af forsøget i forhold til den oprindelige inokulum.
(1)
Figur 5: voksen kvinde Daphnia magna. Voksne kvindelige Daphnia magna med parthenogenetic æg i det kuld kammer. Afstanden mellem hovedet og bunden af hale rygsøjlen bruges til at måle størrelsen af dyret. De røde linjer angiver størrelse målinger. Skalalinjen = 500 µm.
Representative Results
Langsigtet empiriske data er afgørende for forståelsen af evolutionære dynamics og persistens af naturlige populationer. Sådanne data er generelt udfordrende at opnå på grund af logistiske vanskeligheder forbundet med at få adgang til tidsmæssige prøver og krav om at begå langsigtede til dataindsamling. I de to vigtigste undersøgelser præsenteres her, tilbydes empiriske beviser for reaktion på temperatur af en central zooplankter i ferskvand økosystemer over evolutionære gange. Dette er aktiveret ved hjælp af lagdelt hvilende æg banker, der giver mulighed for at studere svar af historiske befolkninger og deres moderne efterkommere til miljøstress i fælles eksperimentelle indstillinger.
Fælles haven eksperiment
Den fælles haven eksperiment viste at alle livshistorie træk reageret på temperatur (figur 6 og figur 7). ANOVA analyse viste, at alle (under) populationer reagere på temperatur via plasticitet (tabel 2), undtagen for dødelighed, som er unresponsive. Dokumentation af evolutionære forandringer (forskelle blandt (under) populationer) blev observeret kun i befolkningstilvækst (tabel 2), som steg betydeligt i to af tre (under) populationer på 24 ° C (figur 6).
Figur 6: fælles haven eksperiment. Reaktion normer for livshistorie træk (frugtbarhed, størrelse og alder, modenhed) og befolkningstilvækst (r) er vist for hver (sub) befolkning under temperatur opvarmning (24 ° C) i forhold til den fælles have og aktuelle temperatur regime (18 ° C). Befolkningstilvækst 'r' beregnes ved hjælp af Eulerian ligning (1). Konfidensintervaller er vist. (Under) populationer er farvekodet: (i) blå: 1960-1970; (ii) grøn: 1970-1985; (iii) red: > 1999. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: dødelighed. Dødelighed pr. (sub) indbyggere (1960-1970, 1970-1985; > 1999) er vist under opvarmning (24 ° C) i forhold til moderne temperatur regimer (18 ° C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Mesokosmoslangtidstest eksperiment
Efter fire uger af udvalg, repræsenteret ved opvarmning på 24 ° C, hyppigheden af tre (under) populationer ikke ændrer sig væsentligt (χ2 = 0,55, P = 0,76) i forhold til den oprindelige inokulum (figur 8). Blandt de 30 genotyper podes i mesokosmoslangtidstest eksperiment, var fleste identificeret efter fire ugers udvalg (figur 9). Specifikt, blev 70% af de podede genotyper genoprettet, kompatibel med Poissonian forventning om at inddrive mindst én repræsentant for hver genotype i en stikprøve på 32 personer.
Figur 8: konkurrence eksperiment - befolkning frekvens. Befolkning i gennemsnit median og kvartiler (25th og 75th), er vist for tre (under) populationer af D. magna efter fire uger efter valget i mesokosmoslangtidstest konkurrence eksperimenter (24 ° C), i forhold til en indledende lige frekvens (på start). (Under) populationer er farvekodede som vist i figur 6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: konkurrence eksperiment - genotype frekvens. Genotype frekvenser — gennemsnit median og kvartiler (25th og 75th), der vises efter fire ugers udsættelse for opvarmning (24 ° C) i forhold til en indledende lige hyppigheden af genotyper (stiplet linje). Navne på x-aksen er podede genotyper ID, grupperet pr. (sub) indbyggere (blå, 1960-1970, grøn, 1970-1985, rød, > 1999). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Locus | EN | Størrelsesområde (bp) | Primere (5' - 3') | Dye etiket | Gentag motiv | TM | |
| B008 | HQ234154 | 150-170 | F: TGGGATCACAACGTTACACAA | VIC | (TC) 9 | 56 | |
| R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC | |||||||
| B030 | HQ234160 | 154-172 | F: CCAGCACACAAAGACGAA | PET | (GA) 11 | 56 | |
| R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT | |||||||
| B045 | HQ234168 | 118-126 | F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC | NERET | (TG) 8 | 56 | |
| R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA | |||||||
| B050 | HQ234170 | 234-248 | F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC | 6FAM | (GAA) 6 | 56 | |
| R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG | |||||||
| B064 | HQ234172 | 135-151 | F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA | 6FAM | (TC) 8 | 56 | |
| R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA | |||||||
| B074 | HQ234174 | 196-204 | F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT | NERET | (GT) 9 | 56 | |
| R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG | |||||||
| B096 | HQ234181 | 234-240 | F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA | VIC | (AC) 15 | 56 | |
| R: TTGAACCACGTCGAGGATTT | |||||||
| B107 | HQ234184 | 250-274 | F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA | PET | (CT) 8 | 56 | |
| R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG | |||||||
Tabel 1: Microsatellite multiplex. NCBI tiltrædelse nummer (AN), multiplex oplysningerne, PCR primer sekvenser, PCR størrelsesområde, gentage motivet, farvestof bruges til at mærke den fremskudte primer og den udgloedning temperatur (Tm) er vist.
| Pop vækstrate (r) | DF | F | P | |
| Udvikling (Pop) | 2 | 30.309 | < 0,001 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 531.546 | < 0,001 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 65.137 | < 0,001 | |
| Dødelighed | DF | F | P | |
| Udvikling (Pop) | 2 | 2.234 | 0.1162 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 2.679 | 0.1071 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 1.8657 | 0.164 | |
| Frugtbarhed | DF | F | P | |
| Udvikling (Pop) | 2 | 1.8852 | 0.1633 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 6.8934 | 0.0117 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 1.6511 | 0.203 | |
| Størrelse på modenhed | DF | F | P | |
| Udvikling (Pop) | 2 | 0.211 | 0.8106 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 11.1361 | 0.0017 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 0.6586 | 0.5225 | |
| Alder ved udløb | DF | F | P | |
| Udvikling (Pop) | 2 | 0.7811 | 0.4637 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 8.0764 | 0.0066 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 0.088 | 0.9159 | |
Tabel 2: variansanalyse (ANAVA). Analyse af varians test om ændringer i livshistorie træk og befolkningstilvækst af de opstandne (under) populationer udsat for opvarmning er forklaret af evolutionær tilpasning (populationer), plasticitet (temperatur behandling), og deres interaktion sigt (evolution af plasticitet). Signifikant p-værdier (p< 0,05) er vist i fed skrift.
Supplerende Video 1: prøvetagning af sediment kerner. Brug af en Big Ben corer er vist. Big Ben er en core tube ca 1,5 m i længden med en indre rørdiameter på 14 cm. Det består af et stempel på et reb og en corer hoved, som stænger er knyttet til at køre røret ind i sedimentet. En core catcher bruges til at understøtte core røret, der er udstationeret fra et lille fartøj. Stemplet er skubbet i sedimentet af gravitationel pres. Rammer bruges til at understøtte core tube under ekstruderingsprocessen udført ved hjælp af en modificeret flaskedonkraft, der presser stemplet opad. Hver sediment lag er indsamlet på en flad metal overflade og overført til gennemsigtig opsamlingssække til langtidsopbevaring [mørkt og koldt (4 ° C) betingelser]. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 2: Sediment sigtning. Det udstyr, der kræves for sigtning sediment er en præcision skala, hvid prøveudtagning bakker og geologiske sier. Fra hvert sediment lag bevares mindst 5 g for radiometrisk datering. Den resterende del af sedimentet bruges til at isolere ephippier. Sedimentet sigtes gennem to geologiske sier, en med 1 mm og en anden med 125 µm maskestørrelse, stablet oven på hinanden. Medium hældes på 1 mm maske si at adskille ler, store hvirvelløse dyr og partikler. Medium hældes på det andet sigte med 125 µm mesh adskiller D. magna ephippier og små partikler. Delprøver af sediment er derefter overført til en hvid prøveudtagning bakke. D. magna ephippier er plettet af øjet i bakken hvid baggrund. Ephippier fra hvert lag er indsamlet i separate petriskåle. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 3: udpakning. Under et stereomikroskop D. magna ephippier åbnes med microdissection pincet ved at anvende pres på ryggen af chitin sag. Den indre æg membran fjernes forsigtigt og hvile æg forsigtigt overført med Pasteur pipette til en petriskål, som indeholder 10 mL af medium. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 4: rugeæg. Efter udsættelse for en lang lysperiode og 20 ° C genoptager embryo udvikling mellem 48 timer og uger. Når udvikling er komplet, embryoner bryde fri fra æg shell og svømmer frit i medium. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
På grund af den høje varmeledningsevne af vand ferskvand økosystemer på højere risiko for tab af biodiversitet end terrestriske økosystemer i lyset af global opvarmning34. Det er derfor afgørende at forstå svar af keystone arter i disse økosystemer og identificere overlevelsesmekanismer for at overleve termisk stress. Forståelsen af disse mekanismer på arter og Fællesskabets niveau kan hjælpe med at forudsige hvordan arter er påvirket af den globale opvarmning og hvordan effekten på enkelte arter kaskader til andre trofiske niveauer. I sidste ende, forstå mekanismer af svar til den globale opvarmning muliggør identifikation af oprydningsstrategier at afbøde udryddelser.
Casestudier præsenteres her viser at svar på D. magna temperaturstigning korrekt er medieret af plasticitet i livshistorie træk og reaktion på temperaturstigning alene ikke pålægger klart fitness omkostninger, i det mindste i den befolkningen studerede her. Høj plasticitet i livshistorie træk understøttes af ikke-væsentlige forskelle i konkurrerende evner af (under) populationer i overværelse af opvarmning. Langsigtede konkurrence forsøg på flere befolkninger kan dog nødvendigt at generalisere disse resultater.
Opstandelsen af hvilende etaper giver en hidtil uset ressource for at studere mekanismer for tilpasning og baner af en artens udvikling gennem tiden10. Zooplankton arter drage fordel af en hurtig generationstid (ca. 2 uger) og levedygtigheden af hvilende faser, som giver mulighed for en forfader til at konkurrere headtohead mod sine egne efterkommere eller 'replay' evolution, der starter fra forskellige tidligere stater. Opstandelse økologi giver væsentlige undersøgelse af, om en bestemt evolutionære resultatet er betinget af en forudgående begivenhed. Identifikation af de genetiske elementer af evolution er i øjeblikket muligt i laboratorieforsøg, der ved hjælp af mikroorganismer som 'forfædres lines' frosset og genoplivet for sammenlignende analyse med deres udviklede efterkommer6. En af de vigtigste begrænsninger for at arbejde med laboratoriet organismer er imidlertid, at fædrene staten er en allerede flyttet baseline. Studiet af hvilende etaper giver mulighed for udtagning af prøver fra tiden før nogen stress begivenhed (f.eks., uberørte miljøforhold) og til at måle evolutionære baner fra uforstyrret miljømæssige forhold til forskellige tidligere stater indtil moderne tid. I de seneste år, har studiet af DNA polymorfi i opstandne eller stadig sovende zooplankton faser givet vigtige indsigt i seneste demografiske og adaptive processer, der har bidraget til den genetiske makeup af nutidens befolkninger14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. med den højere tilgængelighed af høj overførselshastighed sekventering teknologier, genom og transkriptom opstandne eller stadig sovende etaper kan blive sekventeret og typen og antallet af genetiske ændringer akkumuleret i udviklende befolkninger tid målt.
Opstandelse SOP præsenteres her har vigtige applikationer inden for multi-omik på to niveauer. Multi-omik-teknologier kan anvendes til opstandne prøver, giver en udtømmende analyse af de molekylære elementer involveret i adaptive responser til miljømæssige udvælgelse pres. Derudover kan omik-teknologier anvendes til decapsulated men stadig sovende faser. Hidtil, har anvendelse af høje overførselshastighed sekventering teknologier til hvile faser været begrænset af kravet om en stor mængde af input materiale. Disse begrænsninger bliver løftet37. Sænke kravene til materialer og fremskridt i nanofluidics, hele genome sequencing (WGS) er nu muligt fra så lidt som 1 ng eller et par pg starte materielle38. Brug af hele genom forstærkning (WGA) og hele transkriptom forstærkning (WTA) teknikker, gør det muligt for berigelse af DNA og RNA fra meget små mængder af væv, har revolutioneret både metagenomics39,40 og medicinsk forskning41. Disse teknologier anvendt på decapsulated hvilende æg aktiverer overskridelse af begrænsninger i forbindelse med levedygtighed af hvilende faser og undersøge for længere perioder (fx, århundreder).
Opstandelsen af hvirvelløse samfund producerer hvilende faser muliggør tilpasning af Fællesskabets historier med kendte ændringer i de naturlige landskaber eller miljømæssige ændringer udledes fra analyser af sedimenter orsoils2. Analysen af Fællesskabets ændringer som reaktion på ændringer i miljøet giver os evnen til at kvantificere øko-evolutionære feedbacks42 at have betydelige konsekvenser for befolkningen persistens43, trofiske interaktioner44 , Fællesskabet forsamling45, og ændringer i økosystemets funktioner og tjenester,46. Endelig, nøjagtige forudsigelser om biologiske svar til miljøændringer er altafgørende at guide beskyttelse af biodiversitet47. Nuværende prognosemodeller er urigtige i denne henseende, fordi de ikke tager hensyn vigtige biologiske mekanismer som demografi, spredning, evolution og arter interaktioner. Forstå, hvordan disse processer ændrer sig med tiden og bruge disse oplysninger som en forudgående i prognose modellering vil forbedre vores evne til at forudsige arter og Fællesskabets vedholdenhed over for miljømæssige ændre2.
Anvendelse af SOP præsenteres her er ikke uden udfordringer. Den primære begrænsning af resurrecting hvilende faser er behovet for specialiseret udstyr til prøveudtagning. Derudover kræver hele processen, fra sediment sigtning til etablering af klonede kulturer, betydelig hands-on tid.
Nogle af de SOP skridt præsenteret her er let overføres til andre arter, dafnier . Disse er: prøvetagning, etablering af klonede linjer og eksperimenterende design. Men andre trin af SOP kan kræve yderligere optimering skræddersyet til arter under undersøgelsen. Udpakning er ofte anvendes til D. magna prøver at forbedre rugeæg succes. Denne fremgangsmåde kan dog ikke være egnet til mindre enheder. Rugeæg stimuli kan også variere blandt arter48 og conspecific prøven49. Derfor, en ad hoc- optimering af rugeæg trin af SOP kan være påkrævet før applikationer til andre krebsdyr. Mens rugeæg succes med befolkningens D. magna genopstå fra Lake Ring (30,5% på tværs af sedimentære arkivet) er i overensstemmelse med tidligere resultater49, varierer rugeæg succes med tilstanden bevarelse af sediment, art 50,51, og den geografiske oprindelse af sediment48. Fremtidige studier af de mekanismer, der regulerer løsning og progression gennem faserne i diapause er forpligtet til at identificere optimale rugeæg stimuli skræddersyet til forskellige arter.
Endelig baggrund kendskab til den undersøgelse system, især tilstedeværelsen af arter af interesse over tid, er tilrådeligt. Dette kan opnås via historiske optegnelser. Hvis historiske optegnelser, ikke er tilgængelige, er prøveudtagning og screening af de overflade lag af søen sediment inden core prøveudtagning tilrådeligt, selv om det kan give oplysninger kun om den seneste historie.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NERC højdepunkter grant (NE/N016777/1). Ensis Ltd, videnskabelige miljøtjenester, Environmental Change Research Centre, University College London stikprøven og dateret sediment kerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
| piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
| precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
| geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh |
| geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh |
| white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
| pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL |
| stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
| petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
| glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
| glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
| glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
| statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
| microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
| image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
| mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
| mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick - Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
| AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
| size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers |
| ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |
References
- Lindenmayer, D. B., et al. Value of long-term ecological studies. Austral Ecol. 37 (7), 745-757 (2012).
- Orsini, L., et al. The evolutionary time machine: using dormant propagules to forecast how populations can adapt to changing environments. TREE. 28, 274-282 (2013).
- Grant, P. R., Grant, B. R. Unpredictable evolution in a 30- year study of Darwin's finches. Science. 296, 707-711 (2002).
- Lohbeck, K. T., Riebesell, U., Reusch, T. B. H. Adaptive evolution of a key phytoplankton species to ocean acidification. Nature Biosci. 5, 346-351 (2012).
- Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
- Barrick, J. E., Lenki, R. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
- Kawecki, T. J., et al. Experimental evolution. TREE. 27, 547-560 (2012).
- Fukami, T., Wardle, D. A. Long-term ecological dynamics: reciprocal insights from natural and anthropogenic gradients. P Roy Soc B-Biol Sci. 272, 2105-2115 (2005).
- Merila, J., Hendry, A. P. Climate change, adaptation, and phenotypic plasticity: the problem and the evidence. Evol Appl. 7 (1), 1-14 (2014).
- Evans, M. E., Dennehy, J. J. Germ banking: bet-hedging and variable release from egg and seed dormancy. Q Rev Biol. 80 (4), 431-451 (2005).
- Appleby, P. G. Chronostratigraphic techniques in recent sediments. 1, Kluwer Academic Publisher. (2001).
- Appleby, P. G., et al. PB-210 dating by low background gamma-counting. Hydrobiologia. 143, 21-27 (1986).
- Bidle, K. D., Lee, S. H., Marchant, D. R., Falkowski, P. G. Fossil genes and microbes in the oldest ice on Earth. PNAS. 104, 13455-13460 (2007).
- Geerts, A. N., et al. Rapid evolution of thermal tolerance in the water flea Daphnia. Nat Clim Change. 5, 665-668 (2015).
- Jansen, M., et al. Thermal tolerance in the keystone species Daphnia magna-a candidate gene and an outlier analysis approach. Mol Ecol. 26 (8), 2291-2305 (2017).
- Hairston, N. G. Jr, De Stasio, B. T. Jr Rate of evolution slowed by a dormant propagule pool. Nature. 336, 239-242 (1988).
- Hairston, N. G. Jr, et al. Lake ecosystems: Rapid evolution revealed by dormant eggs. Nature. 401, 446 (1999).
- Weider, L. J., Lampert, W., Wessel, M., Colbourne, J. K., Limburg, P. Long-term genetic shifts in a microcrustacean egg bank associated with anthropogenic changes in the Lake Constance ecosystem. Proc. R. Soc. Lond. B. 264, 1613-1618 (1997).
- Kerfoot, W. C., Robbins, J. A., Weider, L. J. A new approach to historical reconstruction: Combining descriptive and experimental paleolimnology. Limnol Oceanogr. 44 (5), 1232-1247 (1999).
- Cousyn, C., et al. Rapid, local adaptation of zooplankton behavior to changes in predation pressure in the absence of neutral genetic changes. PNAS. 98, 6256-6260 (2001).
- Decaestecker, E., et al. Host-parasite Red Queen dynamics archived in pond sediment. Nature. 450, 870-874 (2007).
- Miner, B. E., De Meester, L., Pfrender, M. E., Lampert, W., Hairston, N. G. Linking genes to communities and ecosystems: Daphnia as an ecogenomic model. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1735), 1873-1882 (2012).
- Ebert, D. Ecology, epidemiology, and evolution of parasitism in Daphnia. , National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology. (2005).
- Orsini, L., et al. Temporal genetic stability in natural populations of the waterflea Daphnia magna in response to strong selection pressure. Mol Ecol. 25, 6024-6038 (2016).
- IPCC. Summary for policymakers. , Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA. 1-32 (2014).
- Patmore, I. R., et al. Big Ben: a new wide-bore piston corer for multi-proxy palaeolimnology. J Paleolimnol. 51 (1), 79-86 (2014).
- Wright, H. E. Jr A square-rod piston sampler for lake sediments. J Sedimentary Petrology. 37, 975-976 (1967).
- Kilham, S. S., Kreeger, D. A., Lynn, S. G., Goulden, C. E., Herrera, L. COMBO: a defined freshwater culture medium for algae and zooplankton. Hydrobiologia. 377, 147-159 (1998).
- Klüttgen, B., Kuntz, N. orbert, Ratte, H. T. Combined effects of 3,4-dichloroaniune and food concentration on life-table data of two related cladocerans, Daphnia magna and Ceriodaphnia quadrangula. Chemosphere. 32, 2015-2028 (1996).
- R: A language and environment for statistical computing. , Vienna, Austria. (2017).
- Jansen, B., Geldof, S., De Meester, L., Orsini, L. Isolation and characterization of microsatellite markers in the waterflea Daphnia magna. Mol Ecol Res. 11, 418-421 (2011).
- Orsini, L., Spanier, K. I., De Meester, L. Genomic signature of natural and anthropogenic stress in wild populations of the waterflea Daphnia magna: validation in space, time and experimental evolution. Mol Ecol. 21, 2160-2175 (2012).
- Verberk, W. C. E. P., et al. Does oxygen limit thermal tolerance in arthropods? A critical review of current evidence. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 192, 64-78 (2016).
- Frisch, D., et al. A millennial-scale chronicle of evolutionary responses to cultural eutrophication in Daphnia. Ecol Lett. 17 (3), 360-368 (2014).
- Yashina, S., et al. Regeneration of whole fertile plants from 30,000-y-old fruit tissue buried in Siberian permafrost. PNAS. 109, 4008-4013 (2012).
- Southam, A. D., Weber, R. J. M., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nat Protoc. 12 (2), 310-328 (2017).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. Plos One. 9 (11), (2014).
- Baym, M., et al. Inexpensive Multiplexed Library Preparation for Megabase-Sized Genomes. Plos One. 10 (5), 6 (2015).
- Bourcy, C. F. A., et al. A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome Amplification Methods. Plos One. 9 (8), (2014).
- Hasmats, J., et al. Assessment of whole genome amplification for sequence capture and massively parallel sequencing. PLoS One. 9 (1), e84785 (2014).
- Becks, L., Ellner, S. P., Jones, L. E., Hairston, N. G. Jr The functional genomics of an eco-evolutionary feedback loop: linking gene expression, trait evolution, and community dynamics. Ecol Lett. 15 (5), 492-501 (2012).
- Ellner, S. P., Geber, M. A., Hairston, N. G. Does rapid evolution matter? Measuring the rate of contemporary evolution and its impacts on ecological dynamics. Ecol Lett. 14 (6), 603-614 (2011).
- Yoshida, T., Jones, L. E., Ellner, S. P., Fussmann, G. F., Hairston, N. G. Jr Rapid evolution drives ecological dynamics in a predator-prey system. Nature. 424 (6946), 303-306 (2003).
- Urban, M., et al.
- Dokulil, M. T. Eutrophication: Causes, Consequences and Control. , Springer. Netherlands. 81-88 (2014).
- Urban, M. C., et al. Improving the forecast for biodiversity under climate change. Science. 353 (6304), (2016).
- Schwartz, S. S., Hebert, P. D. N. Methods for the activation of the resting eggs of Daphnia. Freshwater Biol. 17, 373-379 (1987).
- Vanderkerhove, J., et al. Hatching of cladoceran resting eggs: temperature and photoperiod. Freshwater Biol. 50, 96-104 (2005).
- Caceres, C. E. Temporal variation, dormancy, and coexistence: a field test of the storage effect. PNAS. 94 (17), 9171-9175 (1997).
- Caceres, C. E. Interspecific variation in the abundance, production, and emergence of Daphnia diapausing eggs. Ecology. 79 (5), 1699-1710 (1998).
