Summary
Долгосрочные исследования имеют важное значение для понимания процесса эволюции и механизмов адаптации. Как правило эти исследования требуют обязательств за время жизни исследователей. Здесь мощный метод описан что резко авансы-менным данным коллекции генерации продольных данных в природных систем.
Abstract
Долгосрочные исследования для определения эко эволюционных процессов, которые могут произойти в течение длительного времени. Кроме того они предоставляют основные эмпирические данные, которые могут быть использованы в прогнозного моделирования для прогнозирования эволюционной ответы на будущих экологических изменений природных экосистем. Однако за исключением нескольких исключительных случаев, долгосрочные исследования ограничены ввиду логистических трудностей, связанных с доступом к височной образцы. Временная динамика часто изучаются в лаборатории или контролируемых мезокосмах экспериментов с исключительной исследования, которые реконструировать развитие естественных популяций в природе.
Здесь стандартные оперативные процедуры (СОП) предоставляется оживить или воскресить спящие Daphnia magna, Кистоун видов широко зоопланктона в водных экосистемах, резко продвинуться коллекции-искусство продольных данных в природных систем. Области экологии воскресение был определен в 1999 году Керфут и коллег, даже несмотря на то, что первым попыткам инкубационные diapausing зоопланктона яйца датируются конце 80-х годов. С Керфут семенных бумаги методология Воскрешая видов зоопланктона чаще применялась, хотя распространено среди лабораторий только через передачу прямых знаний. Здесь, СОП описан, предоставляющий пошаговые протокола на практике Воскрешая спящие Daphnia magna яйца.
Два ключевых исследований предоставляются в котором ответ фитнес воскрес Daphnia magna населения измеряется потепление, спекулируя на способности для изучения исторических и современных популяций в те же параметры. Наконец обсуждается применение технологий виртуализации следующего поколения возродил или еще спящие этапов. Эти технологии обеспечивают беспрецедентную власть в рассекает процессы и механизмы эволюции, если применяется к народам, которые претерпели изменения в отбора давления со временем.
Introduction
Долгосрочные исследования имеют решающее значение для понимания экологических и эволюционные процессы в природе и в оценке как видов реагировать и сохраняться во время изменения окружающей среды1. Это потому, что эко эволюционных процессов произойдет через поколения и более длинные промежутки времени происходят изменения в окружающей среде. Кроме того долгосрочные исследования обеспечивают ключевые эмпирических данных, которые повышают точность прогнозирующего моделирования для прогнозирования эволюции ответы на экологические изменения2природных экосистем. Точность этих моделей имеет решающее значение для осуществления стратегии управления и сохранения для сохранения биоразнообразия и экосистемных услуг.
За исключением нескольких исключительных случаев (например, Darwin Галапагосские Финчес3 и водорослей4) долгосрочные исследования во многом ограничены для видов с время коротких поколения, который может передаваться в лаборатории5,6 , 7 , 8. Таким образом, процессы, лежащие в основе Эволюционная динамика остаются недостижимой. Ввиду логистических трудностей, связанных с доступом к височной образцы эмпирические данные изучаются более часто в пространственной чем в временной контекст, и височной эко эволюционных процессов выведенных или образцу от пространственных данных. Этот подход известен как «космос для время» замена9, whereby пространства принимается в качестве суррогатной матери для изучения временных эволюционной динамики. Основное ограничение пространства для время замещения является, что темпы адаптации в различных пространственных масштабах отличаются от временной вариации в той же самой популяции; Следовательно выводы, основанные на замене времени с пространством, предвзятым10.
Мощная альтернатива, которая позволяет изучать Эволюционная динамика в природных экосистемах с течением времени является анализ экологических и генетических изменений в производство спящие этапов11видов. Эти спящие этапы накапливать формы стратифицированной биологических архивы, которые могут быть точно датированы и paleolimnologically характеризуется12,13. Важно отметить, что эти спящие этапов можно реанимированным и используется в лабораторных экспериментах, где можно непосредственно измерить их эволюционный ответ на изменения окружающей среды. Исторические населения может быть соревновались их современных потомков развивались для изучения изменения фитнес и функции генов, эволюционируя в ногу с изменения окружающей среды14,,1516.
Спящие этапы включают семена, кисты, споры и яйцо банков. Хотя первые исследования по реанимации спящие яйца восходит к конце 80-х17и несколько исследований применения этой техники в начале 90-х годов18,19, воскресение экологии был официально учреждена семенных бумаги Керфут и коллег в 1999 году20. Эта практика применялась главным образом в палеолимнологических реконструкций пресноводных видов17,21,22. Однако SOP пока недоступна. Здесь предоставляется пошаговое описание протокола Воскресения, применяется к спящие яйца видов зоопланктона Daphnia magna , от проб осадков к созданию клоновых культур от молодь. Рассматриваются шаги СОП, которые легко передаваться в другие виды дафний, а также шаги, которые могут потребовать дополнительной оптимизации.
Дафнии являются пресноводные zooplankters присутствует в большинстве lotic обитания23 . Дафнии видов являются либо облигатные бесполое или циклических parthenogens. D. magna это циклический parthenogen, который воспроизводит клонально под24благоприятных экологических условий. Когда ухудшения экологических условий, мужской производства возникает и сексуальной рекомбинации приводит к образованию оплодотворенных яиц, которые переходят в состояние покоя, защищена от окружающей среды хитин случае называется ephippium. Доля этих спящих яйца люк, когда благоприятные экологические условия возвращения. Однако большая часть банка спящие яйцо никогда не имеет шанс люк и таким образом создать биологических архивы с течением времени. Спящие этапы оставаться похоронены в отложениях озер и прудов и может быть восстановлен для изучения эволюционной динамики в течение длительного времени. Потому что спящие яйца D. magna являются результатом сексуальных рекомбинации, они являются хорошее представление природного генетического разнообразия видов25. Кроме того они могут поддерживаться через клонального размножения в лаборатории. Эти характеристики обеспечивают уникальное преимущество isogenic модельных организмов, сохраняя при этом естественный генетического разнообразия.
Два ключевых исследований представлены продемонстрировать преимущества непосредственно сравнивать исторические и современные потомки же населения D. magna испытывают давление окружающей среды отбора с течением времени. D. magna образцы были воскрешены от озера кольца (Дания), мелкой (5 м глубиной; поверхность 22 га) смешанного пруд, который пережила увеличение средней температуры и волн тепла вхождение с течением времени. D. magna (суб) населения были воскрешены вдоль этой временной градиент, охватывающих 60 лет (1960-2005) и изучал расследовать эволюционный ответ на потепление температуры. В первом исследовании в общий сад эксперимент изменения в истории жизни Фитнес связаны черты были измерены в ответ на увеличение температуры + 6 ° c, в соответствии с прогнозы Межправительственной группы экспертов по изменению климата в ближайшие 100 лет 26. во втором исследовании, мезокосмах эксперимент был использован для измерения конкурентоспособности трех (суб) населения в условиях потепления. Эти эксперименты комбинированный показывают, что в присутствии потепления как только стресс, все черты истории жизни и населения показывают высокий уровень пластичности и иметь равные конкурентные возможности. Эти результаты показывают, что потепление как один стресс не навязывать фитнес значительные расходы, по крайней мере в популяции учился здесь.
Protocol
Следующие СОП содержит пошаговое описание протокола, используемого для воскресить Daphnia magna спящие яйца, включая подробное описание выборки, изоляции ephippia от отложений и создание клоновых культур ( Рисунок 1).
Рисунок 1: шаг за шагом руководство для воскресения Daphnia magna. Осадков от ареала пресной воды (A) пробы с поршневой бура (B). Осадочных кернов (C) нарезанный в дополнительных слоях 1 или 0,5 см (D). Каждый слой осадка хранится в образце zip lock мешок (E) в темных и холодных условиях (4 ° C). Каждый слой осадка взвешивают и просеивают, используя геологические сита (1 мм и 125 мкм сетки размерами, F). Белый фон лотки используются для изоляции Daphnia magna ephippia (G). Спящие очищенные яйца (H) переданы чашки Петри и воздействию света и температуры стимулы, чтобы побудить штриховкой. Молодь передаются отдельные банки (я) для установления линии isoclonal. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
1. отбор проб осадочных кернов
- Образцы отложений от озерах или прудах с помощью бура поршня. Этот протокол используется Биг Бен27, ядро трубки длиной около 1,5 м с внутренней трубки диаметром 14 см в. Биг Бен состоит из поршня на веревке и Бур головы, к которому прикреплены стержней управлять трубки в отложениях. Ядро ловца СПИДа поддержку основных труб при полном отложений. Для выдавливания в отложениях, рамки держит основной трубе вертикально и стационарных, и изменение домкрат используется для толкать поршень вверх во время процесса экструзии (Дополнительные видео 1).
- Для мелких прудов менее 1 м в глубину используйте оргстекла бура гравитации не более 6 см, диаметр вручную толкнул в отложениях.
- Для глубоких озер (> 6 м глубины), используйте Ливингстон поршневые пробоотборников28 или одного диска Гриффит отложений пробоотборников со СПИДом якорь Понтон лодки. Ливингстон типа диск штока поршня Бур может использоваться в воде до около 30 м глубоко для сбора последовательных один метр диски мягких отложениях сводный озеро. Бура Гриффит одного диска состоит из простых, но надежных ядро головы, что соединяет стандартные поликарбоната трубки Ливингстон штанги. Пробоотборников толкнул в отложениях с стержней, и поршень обеспечивает всасывание, необходимые для восстановления отложений (рис. 2).
- Для получения непрерывной, спокойно ядер, используйте vibracoring. Эти пробоотборников работают на различных глубинах и может получить образцы керна разной длины, в зависимости от отложений литологии. Низкая амплитуда вибрации, которая передается от vibracore головы вниз через прилагаемый ствол или ядро трубки разжижает отложений, позволяя основной ствол, прилагается к блоку vibracore проникать в сжиженный отложений. Некоторые vibracorers маленький, легкий и портативный, другие большие тяжелые блоки, которые могут быть развернуты только из крупных судов. Выбор пробоотборников зависит литологии отложений.
- Срез ядро горизонтально в дополнительных слоя 1 см или меньше с помощью плоской металлической поверхности (Дополнительные видео 1). Отложений пробоотборников как используется здесь предназначены для снижения гидростатического давления при экструзии, снижение помех слоев осаждений. Когда используются другие пробоотборников, наружная кожура каждой осадочного слоя могут быть удалены с маркеры резак рода лезвия для ограничения загрязнения между слоями.
- Собирать каждый осадочного слоя в отдельных проб (Дополнительные видео 1) и хранить в темной и холодной (4 ° C) условий.
- Соберите как минимум 5 g осадка от всех слоев для радиометрического датирования. Как радиометрического датирования протокол для подробного описания знакомств assay, обратитесь к существующей публикации12,13.
Рисунок 2: мультфильм поршня керна процедуры. Пробоотборник поршневой, полые трубки с внутренним раздвижные печати (поршневой), которая производит слабый вакуум. Когда поршень касается интерфейс осадков воды, вес толкает основной ствол в осадочный слой и вакуум вызывает отложений, порошковой войти и двигаться вверх по трубе не нарушая слоях отложений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. Просеивание осадочных слоев
- С помощью точность шкалы, взвесьте каждый осадочного слоя для будущей справки. Используйте площадь поверхности и вес вычислить плотность пород в озере.
- Сито каждый осадочного слоя, с помощью двух геологических сита, свалили друг на друга. Первое сито имеет размер сетки 1 мм и отделяет глины, крупных беспозвоночных и твердых частиц, например семян, растений и насекомых, от остальной части осадка. Второе сито имеет сеткой 125 мкм и отделяет D. манга ephippia и мелких частиц от остальной части отложений (Дополнительные видео 2).
-
Передача небольших аликвоты фракции отложений, собранных на 125 мкм сетки сито на белом фоне лоток. В зависимости от типа отложений меньше или больше аликвоты осадка могут быть переданы на каждый раз.
- Добавить небольшой объем (до 200 мл) средних проб белый лоток вновь приостановить часть переданных отложений и облегчения глаз кровянистые выделения из ephippia (рис. 3). Средство, используемое для Ресуспензируйте отложений может быть дехлорируемым водопроводной воды, вода скважина, комбо29или Адам среднего (Аахенер Daphnien)30. Далее термин «средние» будет использоваться для обозначения любой или все перечисленные решения.
Рисунок 3: Daphnia magna ephippium. Спящие Daphnia magna яйца сразу после деинкапсуляции. Ephippium (A), внутренний яйцо мембраны (B) и спящие яйца (C) отображаются. Шкалы бар = 500 мкм.
3. деинкапсуляции Ephippia и штриховки
- С помощью microdissection щипцами или одноразовые пипетки Пастера передачи отдельных ephippia на чашки Петри заполнены с 10 мл среды. Используйте по крайней мере Петри блюдо на слой осадка.
- Под микроскопом стерео, decapsulate каждый ephippia с помощью microdissection щипцы, заставив открыть дело хитин (Дополнительные видео 3). Деликатно удалить отдыхая яиц внутренняя мембрана, обращая внимание, чтобы не нарушить яйца и передавать их на Петри блюдо заполнены с носитель с помощью пипетки Пастера. Деинкапсуляции увеличивает успех вылупления в D. magna; однако, оно не может быть потребовано или это может быть сложным для других видов дафнии , производит меньше ephippia.
- В контролируемой температуры устройства (инкубатор) или номер предоставлять очищенные яйца полный спектр длинный день фотопериода света (16:8 свет: темный) и высокой температуре (20 ± 1 ° C), чтобы побудить штриховкой. Отрождение происходит между 48 h и несколько недель (до четырех; Дополнительные видео 4). В отсутствие деинкапсуляции напрямую предоставляют ephippia до вылупления раздражители (длинный Фотопериод свет (16:8 свет: темный) и высокой температуре (20 ± 1 ° C)).
4. Создание линий Isoclonal Daphnia magna
- Установите isoclonal линии от одного молодь путем передачи отдельных D. magna из шага 3.3 отделить банки заполнены с 200 мл среды, используя одноразовые пипетки Пастера. Каждый человек отличается генетически являясь результатом сексуальных рекомбинации.
- Сохранить isoclonal линии на неопределенный срок в складе условий, состоящий из 10 ± 1 ° C, свет: Темный режим 16:8, кормили за неделю с 0,2 мг C/Л Chlorella vulgaris или других зеленых водорослей (например, косой внутренней сценедесмуса). Обновление среды каждую третью неделю. Складе условия могут меняться с температурой, кормления режимов и видов.
5. Основные исследования
Примечание: Описание двух основных исследований приводится в котором воскрес D.magna (суб) населения из осадочных архива озера кольца (Дания) используются для оценки эволюционный ответ на потепление. Три (суб) популяции были воскрешены в следующие периоды времени: 1960-1970, 1970-1985, и > 1999. D. magna инкубационные успех из осадочных архива варьировались между 11 и 58% (Рисунок 4). Из молодь, полученные от каждого timeperiod случайный набор был выбран для двух ключевых исследований, описанных здесь. Эти исследования были разработаны для оценки ли (суб) населения воскрес из различных периодов времени вдоль градиента температуры показали различия в истории жизни Фитнес связаны черты (5.1), и имели ли они различные конкурентной способности (5.2) после воздействия потепления.
Рисунок 4: инкубационные успех в осадочных Архив, отобранных из озера кольцо. Доля успешных молодь вдоль осадочных Архив озера кольца, используемых в ключевых исследований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
-
Общий сад эксперименты
- Передать условий общей сад десять молодь на (суб) населения от штока культур: 16 ° C; длинный Фотопериод (16:8 свет: Темный режим); ежедневно кормить с 0,8 мг C/Л Chlorella vulgarisи вновь среднего каждый второй день. Поддерживать молодь в общих условиях сад для по крайней мере двух поколений (ОК. 45 дней). Общий сад условия уменьшить помехи от материнского эффекта и синхронизировать воспроизведение среди молодь.
- После выпуска второго расплод в зале расплода передавать взрослых самок из второго поколения в 500 мл банки заполнены среднего до тех пор, пока они выпускают второй выводок несовершеннолетних.
- Случайно передачи отдельных подростков 24-48 ч, родился от второго выводок второго поколения, 100 мл банки заполнены среднего и подвергаются следующие экспериментальные условия: 18 ° C (текущая температура в озере) и (потепления, температура 24 ° C в ближайшие 100 лет прогнозируемый МГЭИК 26 ), 16:8 режим света: темно и комбикормов ежедневно 0,8 мг C/Л Chlorellavulgaris.
- На каждом экспериментальных животных Измерьте размер в зрелости с стереомикроскопом как расстояние между головой и основание хвоста позвоночника (рис. 5). Фотография каждого животного и впоследствии анализировать его размер с помощью подходящих изображений программное обеспечение.
- Измеряют возраст зрелости: день, в котором наблюдаются яйца в первый раз в зале расплода.
- Оценить смертность: количество исчезнувших лиц в ходе эксперимента.
- Измерить плодовитость: общее количество потомства, выпущенный в первой и второй клонального размножения.
- Измерять темпы прироста населения, по оценкам, с помощью уравнения Эйлера (1):
(1)
Где процент выживания в возрасте x, lx bx — количество новорожденных, созданных на сохранившихся человека в возрасте xи r это внутренние темпы естественного прироста. - Выполните статистический анализ с использованием имеющегося программного обеспечения. Здесь используйте R31 для участка нормы реакции (фенотипические выражения одного генотипа в средах) для каждого признака жизни история, с помощью пакета ggplot2. Рассчитайте показатели смертности на населения через анализ выживаемости (R пакет rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Наконец, выполните дисперсионный анализ (ANOVA, Таблица 2) R31 оценить ли влияние температуры на черты могут быть объяснены эволюции (различия среди населения), пластичности (ответ на лечение), или эволюция пластичность (население x лечения).
-
Конкурс эксперимент
- Передать условий общей сад десять молодь на населения от штока культур: 20 ° C, длинный Фотопериод (16:8 свет: Темный режим), ежедневно кормить с 0,8 мг C/Л Chlorella vulgaris и возобновить среднего каждый второй день. Поддержание общей сад условий для по крайней мере двух поколений (ОК. 45 дней) для уменьшения помех от эффектов со стороны матери.
- Случайным образом назначьте пять несовершеннолетних 24-48 ч из второго выводок второго поколения каждый детеныш экспериментальной мезокосмы (20 Л пластиковых аквариумов заполнены среднего), в triplicates, на плотность 10 животных/л.
- Разоблачить мезокосмы до 24 ° C, 16:8 L:D режима и ежедневно кормить с 0,8 мг C/Л Chlorellavulgaris в контролируемой температурой камере или инкубаторе для как минимум четыре недели (> 3 клоновых поколений).
- Отбирать каждый мезокосмах еженедельно, освежающий 10% средних моделировать динамику населения, которая дафнии могут столкнуться в естественной среде. Навязать забой, удалив известный объем среднего и животных от каждого аквариум (1,2 Л в данном случае) и заменив выбраковки объем свежие среднего. После экспериментальных животных достигают зрелости (день 10) запуск режима выбраковки.
- В конце четвертой недели образец 32 животных от каждого мезокосмах для оценки изменений в генотипической структуре по сравнению с первоначальной посевным материалом.
- Отдельных дафний в microcentrifuge трубы и удалите избыток жидкости с помощью пипетки Пастера.
- Вспышки заморозить отдельные трубы в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
- Извлечь геномной ДНК из отдельных лиц с использованием имеющихся протоколов и следуя инструкциям производителя.
- Усилить ДНК с помощью ряда генетических маркеров позволяют обеспечить уникальный генотип multilocus за детеныш. Здесь 8 микроспутников, расположенных в одном мультиплексе (M01, Таблица 1) были использованы следующие установленные протоколы32,33.
- Генотип усиленный фрагментов на фрагмент анализатора.
- Провести анализ фрагмента с коммерческой или свободно доступных программного обеспечения с использованием стандарта подходящего размера.
- Оценка генотипической композиции в конце эксперимента лицами генотипирования 32 с набором локусов микроспутника как описано33и расчета частоты каждого генотипа в конце эксперимента по сравнению с первоначальной посевным материалом.
(1)
Рисунок 5: взрослая самка Daphnia magna. Взрослых женщин Daphnia magna с партеногенетических яйца в зале расплода. Расстояние между головой и основание хвоста позвоночника используется для измерения размера животного. Красные линии показывают размер измерения. Шкалы бар = 500 мкм.
Representative Results
Долгосрочный эмпирические данные имеют решающее значение для понимания эволюционной динамики и сохранением природных популяций. Такие данные обычно сложно получить силу логистических трудностей, связанных с доступом к височной образцов и требование о совершении долгосрочного сбора данных. В двух ключевых исследований, представленные здесь эмпирические данные ответа до температуры центрального zooplankter в пресноводных экосистемах обеспечивается по эволюционной раз. Это возможно путем использования слоистых спящие яйцо банков, которые предоставляют возможность изучить ответ исторических популяций и их современных потомков экологического стресса в общих настройках экспериментальной.
Общий сад эксперимент
Общий сад эксперимент показал, что все черты истории жизни ответил температуры (Рисунок 6 и Рисунок 7). ANOVA анализ показал, что все население (суб) реагировать температуры через пластику (Таблица 2), за исключением смертности, которая не отвечает. Свидетельства эволюционных изменений (различия среди населения (суб)) было отмечено только в темпы роста численности населения (Таблица 2), который значительно возрос в два из трех популяций (суб) при 24 ° C (рис. 6).
Рисунок 6: общий сад эксперимент. Реакция норм для истории жизни черты (плодовитости, размер и возраст зрелости) и темпы прироста населения (r) отображаются для каждой популяции (суб) при температуре потепления (24 ° C) по сравнению с общим садом и текущий температурного режима (18 ° C). Темпы роста населения «r» рассчитывается с помощью уравнения Эйлера (1). Показаны доверительные интервалы. (Суб) населения имеют цветовую кодировку: (i) синий: 1960-1970; (ii) зеленый: 1970 – 1985 г.; (iii) красный: > 1999. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: смертность. Показатели смертности на (суб) населения (1960-1970; 1970-1985; > 1999) отображаются под потепления (24 ° C) по сравнению с современными температурных режимов (18 ° C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Мезокосмах эксперимент
После четырех недель отбора, представленный потепления на 24 ° C, частота трех (суб) населения существенно не изменяется (χ2 = 0,55, P = 0,76) по сравнению с первоначальной посевным материалом (рис. 8). Среди 30 генотипов, привитых в мезокосмах эксперименте большинство было определено после четырех недель отбора (рис. 9). В частности 70% привитых генотипов были восстановленные, совместимый с реализуется ожидание восстановления по крайней мере одного представителя от каждого генотипа в выборке из 32 человек.
Рисунок 8: конкурс эксперимент - населения частоты. В среднем население медиана и квартили (25-й и 75-й), показан для трех популяций (суб) D. magna после четырех недель отбора в мезокосмах конкуренции экспериментов (24 ° C), по сравнению с первоначальной одинаковой частотой (на Старт). Население (суб), цветом, как показано на рисунке 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: конкурс эксперимент - частоты генотипов. Генотип частоты — Средняя медиана и квартили (25-й и 75-й), отображаются после четырех недель воздействия потепления (24 ° C) по сравнению с первоначальной равные частоты генотипов (пунктирная линия). Имена на оси x являются идентификатор привитых генотипов, сгруппированных на (суб) населения (синий, 1960-1970; зеленый, 1970-1985; красный, > 1999). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Локус | В | Размер диапазона (bp) | Грунтовки (5' - 3') | Краситель этикетка | Повторить мотив | TM | |
| B008 | HQ234154 | 150 – 170 | F: TGGGATCACAACGTTACACAA | ВИК | (ТК) 9 | 56 | |
| R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC | |||||||
| B030 | HQ234160 | 154-172 | F: CCAGCACACAAAGACGAA | PET | (GA) 11 | 56 | |
| R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT | |||||||
| B045 | HQ234168 | 118-126 | F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC | NED | (ТГ) 8 | 56 | |
| R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA | |||||||
| B050 | HQ234170 | 234-248 | F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC | 6FAM | (ГАА) 6 | 56 | |
| R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG | |||||||
| B064 | HQ234172 | 135-151 | F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA | 6FAM | (ТК) 8 | 56 | |
| R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA | |||||||
| B074 | HQ234174 | 196-204 | F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT | NED | (GT) 9 | 56 | |
| R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG | |||||||
| B096 | HQ234181 | 234-240 | F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA | ВИК | (AC) 15 | 56 | |
| R: TTGAACCACGTCGAGGATTT | |||||||
| B107 | HQ234184 | 250 – 274 | F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA | PET | (CT) 8 | 56 | |
| R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG | |||||||
Таблица 1: микроспутника Мультиплекс. NCBI присоединения число (), мультиплекс информации, последовательностей праймера PCR, диапазон размеров PCR, повторить мотив, краситель, используемый для метки, проявленную вперед грунт и отжига температура (Tm).
| Поп темпы роста (r) | DF | F | P | |
| Эволюция (Pop) | 2 | 30.309 | < 0,001 | |
| Пластичность (Temp) | 1 | 531.546 | < 0,001 | |
| EVOL. Пластичность (поп x Temp) | 2 | 65.137 | < 0,001 | |
| Смертность | DF | F | P | |
| Эволюция (Pop) | 2 | 2.234 | 0,1162 | |
| Пластичность (Temp) | 1 | 2.679 | 0.1071 | |
| EVOL. Пластичность (поп x Temp) | 2 | 1.8657 | 0.164 | |
| Плодовитость | DF | F | P | |
| Эволюция (Pop) | 2 | 1.8852 | 0.1633 | |
| Пластичность (Temp) | 1 | 6.8934 | 0,0117 | |
| EVOL. Пластичность (поп x Temp) | 2 | 1.6511 | 0,203 | |
| Размер в срок погашения. | DF | F | P | |
| Эволюция (Pop) | 2 | 0.211 | 0.8106 | |
| Пластичность (Temp) | 1 | 11.1361 | 0,0017 | |
| EVOL. Пластичность (поп x Temp) | 2 | 0.6586 | 0.5225 | |
| Возраст зрелости | DF | F | P | |
| Эволюция (Pop) | 2 | 0.7811 | 0.4637 | |
| Пластичность (Temp) | 1 | 8.0764 | 0,0066 | |
| EVOL. Пластичность (поп x Temp) | 2 | 0,088 | 0.9159 | |
Таблица 2: анализ дисперсии (ANOVA). Дисперсионный анализ тестирования ли изменения в истории жизни черты и темпы роста населения воскресший (суб) групп населения, подвергавшихся потепления объясняется эволюционная адаптация (населения), пластичность (температура лечение) и их Понятие взаимодействия (Эволюция пластичности). Значительные p-значения (p< 0,05) отображаются жирным шрифтом.
Дополнительные видео 1: отбор проб осадочных кернах. Показано использование Биг Бен бура. Биг Бен является основной трубки длиной около 1,5 м с внутренней трубки диаметром 14 см. Он состоит из поршня на веревке и Бур головы, к которому прикреплены стержней управлять трубки в отложениях. Ловец ядро используется для поддержки основных трубка, которая развертывается из небольшой сосуд. Поршень выталкивается в отложениях гравитационного давления. Рамки используется для поддержки основной трубе во время процесса экструзии, осуществляется с использованием модифицированных домкрат, которая толкает поршень вверх. Каждый слой осадка собираются на плоской металлической поверхности и переданы для прозрачной проб для длительного хранения [темные и холодные условия (4 ° C)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные видео 2: отложений просеивание. Оборудование, необходимое для просеивания осадков является точность масштаба, белый выборки лотки и геологических сита. От каждого осадочного слоя по крайней мере 5 g сохраняются для радиометрического датирования. Остальная часть осадков используется для изоляции ephippia. Осадок просеивают через два геологических сита, один с 1 мм и второй с 125 мкм размер ячеи, свалили друг на друга. Средний вылил на 1 мм сетки сито, чтобы отделить глины, крупных беспозвоночных и твердых частиц. Средний, вылил на втором сито с сеткой 125 мкм отделяет D. magna ephippia и мелких частиц. Аликвоты отложений затем передаются на подносе белый выборки. D. magna ephippia были замечены на глаз в трее белый фон. Ephippia от каждого слоя собраны в отдельный Петри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные видео 3: деинкапсуляции. Под стереомикроскопом D. magna ephippia открыты с microdissection щипцами, применяя давление на позвоночник дело хитин. Деликатно удаляется внутренняя яйцо мембраны и отдыха яйца аккуратно переведены с пипетка Пастера в чашку Петри, содержащие 10 мл среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные видео 4: инкубационные. После воздействия длинный Фотопериод и 20 ° C развитие эмбриона возобновляет между 48 h и несколько недель. Когда разработка завершена, эмбрионы освободиться от яичной скорлупы и свободно плавать в среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Благодаря высокой теплопроводности воды пресноводные экосистемы более высокому риску утраты биоразнообразия чем наземных экосистем перед лицом глобального потепления34. Таким образом, важно, чтобы понять реакцию Кистоун видов в этих экосистемах и определить механизмы выжить тепловой стресс. Понимание этих механизмов на уровне видов и сообщество может помочь предсказать, как виды подвергаются воздействию глобального потепления и как влияние на отдельных видов каскадами с другими трофическими уровнями. В конечном счете понимание механизмов ответы на глобальное потепление позволяет идентифицировать восстановительных стратегий для смягчения вымирания.
Тематические исследования, представленные здесь показывают, что ответ д magna на повышение температуры pervasively опосредовано пластичности в истории жизни черты и что ответ на повышение температуры в одиночку не навязывать ясно фитнес расходы, по крайней мере в население учился здесь. Высокая пластичность в истории жизни черты поддерживается не существенные различия в конкурирующих способности населения (суб), в присутствии потепления. Однако долгосрочные эксперименты конкуренции на несколько популяций может быть необходимо обобщить эти выводы.
Воскресения спящие этапов обеспечивает беспрецедентный ресурс для изучения механизмов адаптации и траектории эволюции видов через время10. Видов зоопланктона выгоду от быстрого поколения времени (около двух недель) и жизнеспособности спящие этапов, что позволяет предка конкурировать headtohead против своих собственных потомков, или «воспроизведение» эволюция, которая начинается от различных последних государств. Воскресения экологии по существу позволяет расследование ли особое эволюционный результат зависит от некоторых предыдущих событий. В лабораторных экспериментов с использованием микроорганизмов, для которых заморожены и реанимированным «предков линии» для сравнительного анализа с их развивались потомков6в настоящее время возможна идентификация генетических элементов эволюции. Однако один из основных недостатков работы с организмов лаборатории является состояние «предков» уже перешли базовой линии. Изучение спящие этапов позволяет выборки образцов от времени, предшествовавший любой стресс событие (например, неиспорченная экология) и измерить эволюционных траекторий различных последних государств из ненарушенных экологических условий до современности. В последние годы Исследование полиморфизма ДНК в воскресшего или еще спящие зоопланктона этапов предоставила важную информацию в прошлых демографических и адаптивные процессы, которые способствовали генетической современного населения14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. с более высокой доступностью технологий виртуализации высокой пропускной способности, можно упорядочивать генома и транскриптом воскрес или еще спящие этапов и тип и количество генетических изменений накапливается в меняющихся населения над время измеряется.
Воскресения СОП, представленные здесь имеет важные применения в области мульти омику на двух уровнях. Multi омику технологии могут применяться для воскрес образцов, позволяя исчерпывающий анализ молекулярных элементов, участвующих в Адаптационное реагирование на экологические отбора давления. Кроме того омику технологии могут применяться для очищенные, но по-прежнему спящие этапов. До настоящего времени применение технологий виртуализации высокой пропускной способности для отдыха этапов было ограничено требованием большой объем материала. Эти ограничения в настоящее время поднял37. С снижение требований для входного материала и прогресс в Нанофлюидика, всего генома (РГ) теперь можно от всего лишь 1 нг или несколько pg начиная материала38. Использование всего генома амплификации (WGA) и весь транскриптом амплификации (WTA) методы, позволяя обогащение ДНК и РНК от очень небольшого количества ткани, революционизировало метагеномики39,40 и медицинские исследования41. Эти технологии, применяемые для неактивных очищенные яйца включить превышает ограничения, связанные с жизнеспособность спящие этапов и расследования расширенных периодов (например, ВВ).
Воскресения беспозвоночных общин производить покоя этапов позволяет выравнивание сообщества историй с известные изменения в природных ландшафтов, или экологических изменений, вывод из анализа отложений orsoils2. Анализ изменений сообщества в ответ на изменения окружающей среды предоставляет нам возможность количественно эко эволюционной отзывов42 , имеют существенные последствия на население сохраняемости43, трофических взаимодействия44 , сообщество Ассамблеи45и изменения в экосистемных функций и услуг46. Наконец точные прогнозы о биологической реакции на изменения окружающей среды имеют первостепенное значение для защиты биоразнообразия47. Текущие модели прогнозирования являются неточными в этом отношении, потому что они не принимают во внимание важные биологические механизмы например, демографии, разгон, эволюция и видов взаимодействия. Понимая, как эти процессы меняться с течением времени и использование этой информации в качестве предварительного прогноза моделирования повысит нашу способность прогнозировать видов и сообщества стойкости перед лицом экологических изменения2.
Применение СОП, представленные здесь, не без проблем. Основным ограничением воскресить спящие этапов является необходимость специализированного оборудования для отбора проб. Кроме того весь процесс, от отложений просеивание создание клоновых культур, требует значительного практического времени.
Некоторые из шагов СОП, представленные здесь легко передаваться от других видов дафнии . Таковы: отбор проб, создание клоновых линий и экспериментальный дизайн. Однако другие шаги SOP может потребовать дальнейшей оптимизации с учетом исследованных видов. Деинкапсуляции часто применяется к D. magna образцов для улучшения успех вылупления. Однако этот подход может быть не подходит для небольших по размеру особей. Штриховка стимулы могут также варьироваться среди видов48 и49conspecific образца. Таким образом Специальная оптимизация штриховкой шаги SOP может потребоваться до приложений для других ракообразных. В то время как успех вылупления D. magna населения воскрес из озера кольцо (30,5% через осадочные Архив) с учетом предыдущих результатов49, инкубационные успех зависит от сохранения состояния осадочного слоя, вида 50,51и географическое происхождение отложений48. Будущие исследования механизмов, которые регулируют въезд и прогрессии через фазы диапауза необходим для определения оптимальных инкубационных стимулы, с учетом различных видов.
Наконец, фоновые знания о системе обучения, в частности рекомендуется наличие видов интерес с течением времени. Это может быть достигнуто через исторические записи. Если не доступны исторические записи, желательно отбора проб и проверки поверхностных слоях отложений озера до керна, хотя он может предоставить информацию только по новейшей истории.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Эта работа была поддержана НКРЭ моменты Грант (NE/N016777/1). Энсис Ltd, экологические услуги научных, научно-исследовательский центр экологических изменений, Университетский колледж Лондона пробы и от осадочных кернов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
| piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
| precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
| geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh |
| geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh |
| white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
| pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL |
| stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
| petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
| glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
| glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
| glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
| statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
| microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
| image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
| mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
| mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick - Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
| AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
| size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers |
| ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |
References
- Lindenmayer, D. B., et al. Value of long-term ecological studies. Austral Ecol. 37 (7), 745-757 (2012).
- Orsini, L., et al. The evolutionary time machine: using dormant propagules to forecast how populations can adapt to changing environments. TREE. 28, 274-282 (2013).
- Grant, P. R., Grant, B. R. Unpredictable evolution in a 30- year study of Darwin's finches. Science. 296, 707-711 (2002).
- Lohbeck, K. T., Riebesell, U., Reusch, T. B. H. Adaptive evolution of a key phytoplankton species to ocean acidification. Nature Biosci. 5, 346-351 (2012).
- Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
- Barrick, J. E., Lenki, R. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
- Kawecki, T. J., et al. Experimental evolution. TREE. 27, 547-560 (2012).
- Fukami, T., Wardle, D. A. Long-term ecological dynamics: reciprocal insights from natural and anthropogenic gradients. P Roy Soc B-Biol Sci. 272, 2105-2115 (2005).
- Merila, J., Hendry, A. P. Climate change, adaptation, and phenotypic plasticity: the problem and the evidence. Evol Appl. 7 (1), 1-14 (2014).
- Evans, M. E., Dennehy, J. J. Germ banking: bet-hedging and variable release from egg and seed dormancy. Q Rev Biol. 80 (4), 431-451 (2005).
- Appleby, P. G. Chronostratigraphic techniques in recent sediments. 1, Kluwer Academic Publisher. (2001).
- Appleby, P. G., et al. PB-210 dating by low background gamma-counting. Hydrobiologia. 143, 21-27 (1986).
- Bidle, K. D., Lee, S. H., Marchant, D. R., Falkowski, P. G. Fossil genes and microbes in the oldest ice on Earth. PNAS. 104, 13455-13460 (2007).
- Geerts, A. N., et al. Rapid evolution of thermal tolerance in the water flea Daphnia. Nat Clim Change. 5, 665-668 (2015).
- Jansen, M., et al. Thermal tolerance in the keystone species Daphnia magna-a candidate gene and an outlier analysis approach. Mol Ecol. 26 (8), 2291-2305 (2017).
- Hairston, N. G. Jr, De Stasio, B. T. Jr Rate of evolution slowed by a dormant propagule pool. Nature. 336, 239-242 (1988).
- Hairston, N. G. Jr, et al. Lake ecosystems: Rapid evolution revealed by dormant eggs. Nature. 401, 446 (1999).
- Weider, L. J., Lampert, W., Wessel, M., Colbourne, J. K., Limburg, P. Long-term genetic shifts in a microcrustacean egg bank associated with anthropogenic changes in the Lake Constance ecosystem. Proc. R. Soc. Lond. B. 264, 1613-1618 (1997).
- Kerfoot, W. C., Robbins, J. A., Weider, L. J. A new approach to historical reconstruction: Combining descriptive and experimental paleolimnology. Limnol Oceanogr. 44 (5), 1232-1247 (1999).
- Cousyn, C., et al. Rapid, local adaptation of zooplankton behavior to changes in predation pressure in the absence of neutral genetic changes. PNAS. 98, 6256-6260 (2001).
- Decaestecker, E., et al. Host-parasite Red Queen dynamics archived in pond sediment. Nature. 450, 870-874 (2007).
- Miner, B. E., De Meester, L., Pfrender, M. E., Lampert, W., Hairston, N. G. Linking genes to communities and ecosystems: Daphnia as an ecogenomic model. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1735), 1873-1882 (2012).
- Ebert, D. Ecology, epidemiology, and evolution of parasitism in Daphnia. , National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology. (2005).
- Orsini, L., et al. Temporal genetic stability in natural populations of the waterflea Daphnia magna in response to strong selection pressure. Mol Ecol. 25, 6024-6038 (2016).
- IPCC. Summary for policymakers. , Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA. 1-32 (2014).
- Patmore, I. R., et al. Big Ben: a new wide-bore piston corer for multi-proxy palaeolimnology. J Paleolimnol. 51 (1), 79-86 (2014).
- Wright, H. E. Jr A square-rod piston sampler for lake sediments. J Sedimentary Petrology. 37, 975-976 (1967).
- Kilham, S. S., Kreeger, D. A., Lynn, S. G., Goulden, C. E., Herrera, L. COMBO: a defined freshwater culture medium for algae and zooplankton. Hydrobiologia. 377, 147-159 (1998).
- Klüttgen, B., Kuntz, N. orbert, Ratte, H. T. Combined effects of 3,4-dichloroaniune and food concentration on life-table data of two related cladocerans, Daphnia magna and Ceriodaphnia quadrangula. Chemosphere. 32, 2015-2028 (1996).
- R: A language and environment for statistical computing. , Vienna, Austria. (2017).
- Jansen, B., Geldof, S., De Meester, L., Orsini, L. Isolation and characterization of microsatellite markers in the waterflea Daphnia magna. Mol Ecol Res. 11, 418-421 (2011).
- Orsini, L., Spanier, K. I., De Meester, L. Genomic signature of natural and anthropogenic stress in wild populations of the waterflea Daphnia magna: validation in space, time and experimental evolution. Mol Ecol. 21, 2160-2175 (2012).
- Verberk, W. C. E. P., et al. Does oxygen limit thermal tolerance in arthropods? A critical review of current evidence. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 192, 64-78 (2016).
- Frisch, D., et al. A millennial-scale chronicle of evolutionary responses to cultural eutrophication in Daphnia. Ecol Lett. 17 (3), 360-368 (2014).
- Yashina, S., et al. Regeneration of whole fertile plants from 30,000-y-old fruit tissue buried in Siberian permafrost. PNAS. 109, 4008-4013 (2012).
- Southam, A. D., Weber, R. J. M., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nat Protoc. 12 (2), 310-328 (2017).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. Plos One. 9 (11), (2014).
- Baym, M., et al. Inexpensive Multiplexed Library Preparation for Megabase-Sized Genomes. Plos One. 10 (5), 6 (2015).
- Bourcy, C. F. A., et al. A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome Amplification Methods. Plos One. 9 (8), (2014).
- Hasmats, J., et al. Assessment of whole genome amplification for sequence capture and massively parallel sequencing. PLoS One. 9 (1), e84785 (2014).
- Becks, L., Ellner, S. P., Jones, L. E., Hairston, N. G. Jr The functional genomics of an eco-evolutionary feedback loop: linking gene expression, trait evolution, and community dynamics. Ecol Lett. 15 (5), 492-501 (2012).
- Ellner, S. P., Geber, M. A., Hairston, N. G. Does rapid evolution matter? Measuring the rate of contemporary evolution and its impacts on ecological dynamics. Ecol Lett. 14 (6), 603-614 (2011).
- Yoshida, T., Jones, L. E., Ellner, S. P., Fussmann, G. F., Hairston, N. G. Jr Rapid evolution drives ecological dynamics in a predator-prey system. Nature. 424 (6946), 303-306 (2003).
- Urban, M., et al.
- Dokulil, M. T. Eutrophication: Causes, Consequences and Control. , Springer. Netherlands. 81-88 (2014).
- Urban, M. C., et al. Improving the forecast for biodiversity under climate change. Science. 353 (6304), (2016).
- Schwartz, S. S., Hebert, P. D. N. Methods for the activation of the resting eggs of Daphnia. Freshwater Biol. 17, 373-379 (1987).
- Vanderkerhove, J., et al. Hatching of cladoceran resting eggs: temperature and photoperiod. Freshwater Biol. 50, 96-104 (2005).
- Caceres, C. E. Temporal variation, dormancy, and coexistence: a field test of the storage effect. PNAS. 94 (17), 9171-9175 (1997).
- Caceres, C. E. Interspecific variation in the abundance, production, and emergence of Daphnia diapausing eggs. Ecology. 79 (5), 1699-1710 (1998).
