Summary
Långsiktiga studier är nödvändig för att förstå processen för evolution och mekanismerna för anpassning. Generellt kräver dessa studier åtaganden utöver livslängd av forskare. Här beskrivs en kraftfull metod att dramatiskt framsteg state-of-the-art datainsamling för att generera longitudinella data i naturliga system.
Abstract
Långsiktiga studier möjliggöra identifiering av eco-evolutionära processer som uppstår över längre tidsperioder. Dessutom ger de viktiga empiriska data som kan användas i prognosmodeller för att prognostisera evolutionära Svaren av naturliga ekosystem till framtida miljöförändringar. Men exklusive några undantagsfall är långtidsstudier knappa på grund av logistiska svårigheterna med att komma åt temporal prover. Temporal dynamics studeras ofta i laboratoriet eller i kontrollerade mesokosmos experiment med enastående studier att rekonstruera utvecklingen av naturliga populationer i vilt.
Här, föreskrivs ett normalförfarande (SOP) att återuppliva eller återuppliva vilande Daphnia magna, en utbredd djurplankton keystone arter i akvatiska ekosystem, för att dramatiskt avancera state-of-the-art longitudinella datainsamling i naturliga system. Fältet för uppståndelsen ekologi definierades 1999 av Kerfoot och medarbetare, även om första försöken på kläckning diapausing djurplankton ägg går tillbaka till slutet av 1980. Sedan Kerfoots nyskapande papper, har metodiken för uppväcker djurplankton arter allt oftare tillämpats, men sprids bland laboratorier endast via direkta kunskapsöverföring. Här, en SOP beskrivs som ger en steg för steg-protokollet på öva av uppväcker vilande Daphnia magna ägg.
Två viktiga studier tillhandahålls i som fitness svar uppståndna Daphnia magna befolkningar att uppvärmningen mäts, kapitalisera på förmågan att studera historiska och moderna populationer i samma inställningar. Slutligen diskuteras tillämpningen av nästa generations sekvensering tekniker på återupplivade eller fortfarande vilande stadier. Dessa tekniker ger oöverträffad makt i dissekera de processer och mekanismer som evolutionsteorin om tillämpas på populationer som har upplevt förändringar i urval tryck över tid.
Introduction
Långsiktiga studier är avgörande för att förstå ekologiska och evolutionära processer i naturen och i bedömningen av hur arter svarar på och kvarstår under miljöförändringar1. Detta beror på att eco-evolutionära processer inträffar över generationer och förändringar i miljön sker över lång tid intervallen. Långsiktiga studier ger dessutom viktiga empiriska data att förbättrar noggrannheten i förutsägande modellering att prognostisera evolutionära Svaren av naturliga ekosystem till miljöförändringar2. Riktigheten av dessa modeller är avgörande för förvaltning och bevarande strategier för att bevara biologisk mångfald och ekosystemtjänster.
Exklusive några undantagsfall (t.ex., Galapagos Darwin finkar3 och alger4) är långsiktiga studier i stort sett begränsade till arter med kort generationstid som kan spridas i laboratoriet5,6 , 7 , 8. därför de processer som underbygger evolutionära dynamics förbli svårfångade. På grund av logistiska svårigheterna med att komma åt temporal prover, empiriska data studeras oftare i en rumslig än i ett temporal sammanhang, och temporala eco-evolutionära processer är slutsatsen eller modellerad från spatialdata. Denna metod kallas 'utrymme-för-tid' substitution9, whereby utrymme antas som ett surrogat att studera temporal evolutionära dynamics. Den största begränsningen av 'utrymme-för-tid' substitution är att andelen anpassning på olika rumsliga skalor skiljer sig från temporal variation i samma population; Därför är slutsatser baserat på byte av tid med utrymme partisk10.
Ett kraftfullt alternativ som gör att studera evolutionära dynamics i naturliga ekosystem över tid är analysen av ekologiska och genetiska förändringar i arter producerar vilande stadier11. Dessa vilande stadier ackumuleras till formuläret stratifierat biologiska arkiv som kan dateras exakt och paleolimnologically kännetecknas12,13. Ännu viktigare, kan dessa vilande stadier återupplivat och användas i laboratorieexperiment, där deras evolutionära svar på miljöförändringar kan mätas direkt. Historiska populationer kan vara tävlade mot deras moderna utvecklade ättlingar att studera fitness förändringar och funktion av gener som utvecklas i takt med miljöförändringar14,15,16.
Vilande stadier inkluderar frön, cystor, sporer och ägg banker. Även om de första studierna på återupplivat vilande ägg går tillbaka till det sena 1980-talet17, och en handfull studier har tillämpat denna teknik i början av 1990-talet18,19, har fältet av uppståndelsen ekologi varit formellt etablerad av den inflytelserika tidningen Kerfoot och medarbetare 199920. Denna praxis har tillämpats främst i paleolimnological rekonstruktioner av sötvattensarter17,21,22. Dock finns en SOP inte ännu. Här erbjuds en stegvis beskrivning av uppståndelsen protokollet tillämpas på vilande ägg av djurplankton arten Daphnia magna , från provtagning av sediment till etableringen av klonala kulturer från ungarna. Steg av SOP som kan lätt överföras till andra arter av Daphnia, liksom åtgärder som kan kräva ytterligare optimering, diskuteras.
Daphnia är sötvatten zooplankters närvarande i flesta lotiska livsmiljöer23 . Daphnia -arter är antingen obligata asexuell eller cykliska parthenogens. D. magna är en cyklisk parthenogen som återger klonalt under gynnsamma miljöförhållanden24. När miljöförhållanden försämras, manliga produktion uppstår och sexuella rekombination leder till bildandet av befruktade ägg som anger ett tillstånd av dvala skyddas från miljön av chitinen fall kallas ephippium. En del av dessa vilande ägg kläcks när gynnsamma miljöförhållanden tillbaka. En stor del av vilande ägg banken har dock aldrig en chans att kläckas och därmed bygga upp biologiska arkiv över tid. Vilande stadier förbli begravda i sediment i sjöar och dammar och kan återuppstå för att studera evolutionära dynamics längre period. Eftersom vilande ägg av D. magna är resultatet av sexuella rekombination, är de en bra representation av den naturliga genetiska mångfalden av arter25. Dessutom kan de upprätthållas via klonal reproduktion i laboratoriet. Dessa egenskaper ger den unika fördelen med syngena modellorganismer, men behåller den naturliga genetiska mångfalden.
Två viktiga studier presenteras för att visa fördelarna med direkt jämföra historiska och moderna ättlingar av samma population av D. magna upplever miljön selektionstryck över tid. D. magna exemplar var uppstånden från sjön Ring (Danmark), ett grunt (5 m djup; yta 22 hektar) blandade damm som har upplevt en ökning i genomsnittlig temperatur och värmeböljor förekomst över tid. D. magna (under) populationer var uppståndna längs denna tidsmässiga lutning som spänner över 60 år (1960 – 2005) och studerade för att undersöka evolutionärt svar på temperatur uppvärmningen. I den första studien i en gemensam trädgård experiment mättes förändringar i fitness-länkade livshistoria drag som svar på en ökning av temperaturen på + 6 ° C, i linje med förutsägelser av den mellanstatliga panelen för klimatförändringar under de kommande 100 åren 26. i den andra studien användes ett mesokosmos experiment att mäta tre konkurrenskraftiga förmågor (under) populationer under uppvärmningen. Dessa experiment kombinerat visar att i närvaro av uppvärmningen som bara stress, alla livshistoria drag och populationer visar hög plasticitet och har lika konkurrenskraftiga förmågor. Dessa fynd tyder på att uppvärmningen som en inre stress medför betydande fitness kostnader, åtminstone i befolkningen studerats här.
Protocol
Följande SOP ger en stegvis beskrivning av protokollet som används för att återuppliva Daphnia magna vilande ägg, inklusive en detaljerad beskrivning av provtagning, isolering av ephippia från sediment och inrättandet av klonala kulturer ( Figur 1).
Figur 1: steg för steg guide till uppståndelsen av Daphnia magna. Sediment från en sötvatten livsmiljö (A) samplas med en kolv corer (B). Sediment kärnan (C) är skivad i inkrementella lager 1 eller 0,5 cm (D). Varje lager av sediment lagras i ett prov zip-lock påse (E) i mörka och kalla förhållanden (4 ° C). Varje lager av sediment vägs och siktas med geologiska såll (1 mm och 125 µm maskstorlekar, F). Vit bakgrund brickor används för att isolera Daphnia magna ephippia (G). Decapsulated vilande ägg (H) överförs till petriskålar och utsätts för ljus och temperatur stimuli att inducera kläckning. Hatchlings överförs till separata burkar (jag) för att fastställa isoclonal linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. provtagningen av sedimentkärnor
- Prov sediment från sjöar eller dammar med hjälp av en kolv corer. Detta protokoll används Big Ben27, en kärna rör på ca 1,5 m i längd med en inre rördiameter på 14 cm. Big Ben består av en kolv på ett rep och en corer huvud, som bifogas stavar för att driva röret in i sedimenten. En core catcher aids stöd av kärna ur röret när den är full av sediment. För att extrudera sediment, en ram håller core röret upprätt och stationära och en modifierad flaska jack används för att driva kolven uppåt under extruderingsprocessen (kompletterande Video 1).
- För grunda dammar av mindre än 1 m djup, använda en plexiglas gravitation corer mer än 6 cm i diameter manuellt trängde in i sedimenten.
- För djupa sjöar (> 6 m djup), använda Livingston kolv urkärnare28 eller enkel-driva Griffith sediment urkärnare med stöd av en förankrad ponton båt. I Livingstone-typ enheten rod kolv corer kan användas i vatten upp till ca 30 m djup för att samla successiva en-meters enheter av mjuk till konsoliderade sjösediment. Den enkel-driva Griffith corer består av en enkel men robust kärna huvud som ansluter standard polykarbonat rören till Livingstone bilresa stavar. Urkärnare trycks in sediment med stavar och en kolv ger sug behövs för återvinning av sediment (figur 2).
- För att hämta kontinuerlig, Använd ostörd kärnor, vibracoring. Dessa urkärnare fungerar på en mängd olika vattendjup och kan hämta borrkärnor av olika längder, beroende på sediment-bergarter. Låg amplitud vibrationen som överförs från vibracore huvudet ner genom den bifogade fat eller core tube liquefies sediment, aktivera core fat ansluten vibracore att tränga in i de kondenserade sedimentsna. Vissa vibracorers är liten, lätt och bärbar, andra är stora tunga enheter som kan endast distribueras från stora fartyg. Valet av urkärnare beror på bergarter av sediment.
- Skiva kärnan horisontellt i inkrementella lager av 1 cm eller mindre med hjälp av en platt metall yta (kompletterande Video 1). Sediment urkärnare som används här är utformade för att minska hydrostatiska trycket på extrudering, minska störning av sedimentlagrar. När andra urkärnare används, kan yttre skalet på varje sediment lager tas bort med ett kakmått slags blad för att begränsa kontaminering bland lager.
- Samla varje sediment lager i en separat provtagningssäck (kompletterande Video 1), och förvaras i mörka och kalla (4 ° C) förhållanden.
- Samla minst 5 g av sediment från alla lager för radiometrisk datering. Radiometrisk datering är ett etablerat protokoll för en detaljerad beskrivning av dating analysen, hänvisa till befintliga publikationer12,13.
Figur 2: tecknad av pistongen coring förfarande. Kolv corer, ett ihåligt rör med en inre skjutbara tätning (kolv) som producerar en svag dammsugare. När kolven rör gränssnittet sediment-vatten, vikt skjuter core fat i sedimenten och vakuum orsakar sedimenten som rörelektrod för att ange och flytta upp röret utan att störa sedimentlagrar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. siktning av Sediment lager
- Med en precision skala, väga varje sediment lager för framtida referens. Använd yta och vikt för att beräkna densiteten arter i sjön.
- Sikten varje sediment lager med två geologiska siktar staplade på varandra. Den första sikten har en maskstorlek på 1 mm och separerar lera, stora ryggradslösa djur och partiklar, t.ex. frön, växter och insekter, från resten av sediment. Den andra sikten har en maskstorlek på 125 µm och separerar D. manga ephippia och små partiklar från resten av sedimenten (kompletterande Video 2).
-
Överföra små delprover av andelen sediment samlas på 125 µm mesh sikten till en vit bakgrund facket. Beroende på vilken typ av sediment, kan mindre eller större portioner av sediment överföras på varje gång.
- Lägga till små volymer (upp till 200 mL) av medium till provtagning vit bricka att slamma den överförda sediment fraktionen och underlätta ögat spotting av ephippia (figur 3). Det medium som används för att resuspendera sediment kan vara dechlorinated vatten, borrhål vatten, COMBO29eller ADaM medium (Aachener Daphnien)30. Härefter, används termen 'medium' för att hänvisa till någon av eller alla de lista lösningarna.
Figur 3: Daphnia magna ephippium. Vilande Daphnia magna ägg omedelbart efter avkodning av inkapsling. Ephippium (A), inre ägg membranet (B) och vilande äggen (C) visas. Skalstapeln = 500 µm.
3. avkodning av inkapsling av Ephippia och kläckning
- Med en disponibel Pasteur-pipett eller använda lokalt pincett, överföring enskilda ephippia till petriskålar fylld med 10 mL medium. Använd minst en petriskål per lager av sediment.
- I stereo Mikroskop, decapsulate varje ephippia använder lokalt tången genom att tvinga öppna Chitinen fallet (kompletterande Video 3). Ta bort det vila ägget inre membranet delikat, uppmärksamma inte störa äggen, och överföra dem till petriskål fylld med medium använder en Pasteur-pipett. Avkodning av inkapsling ökar kläckning framgång i D. magna, emellertid, det kan inte krävas eller det kan vara svårt för andra Daphnia -arter producerar mindre ephippia.
- Exponera decapsulated äggen till ett fullt spektrum lång dag fotoperiod ljus (16:8 ljus: mörk) och hög temperatur (20 ± 1 ° C) att inducera kläckning i en kontrollerad temperatur enhet (inkubator) eller rum. Kläckningen sker mellan 48 h och flera veckor (upp till fyra; Kompletterande Video 4). I avsaknad av avkodning av inkapsling, direkt exponera ephippia till kläckning stimuli (lång dag fotoperiod ljus (16:8 ljus: mörk) och hög temperatur (20 ± 1 ° C)).
4. fastställande av Isoclonal fodrar av Daphnia magna
- Upprätta isoclonal rader från enda ungarna genom att överföra enskilda D. magna från steg 3.3 till separata burkar fyllda med 200 mL medium med en disponibel Pasteur-pipett. Varje individ är genetiskt distinkta, ett resultat av sexuella rekombination.
- Upprätthålla isoclonal linjer på obestämd tid i lager villkor som består av 10 ± 1 ° C, 16:8 ljus: mörk regim, matas veckovis med 0,2 mg C/L av Chlorella vulgaris eller andra grönalger (t.ex., Scenedesmus obliquus). Förnya mediet var tredje vecka. Beståndet villkor kan ändras med temperatur, utfodring regimer, och arter.
5. viktiga studier
Observera: En beskrivning av två viktiga studier finns i vilka uppståndne D.magna (sub) populationer från sedimentära arkivet av Ringsjön (Danmark) används för att bedöma den evolutionära svaren på uppvärmningen. Tre (under) populationer var uppstånden från de följande tidsperioderna: 1960-1970, 1970-1985, och > 1999. D. magna kläckning framgång från sedimentära arkivet varierade mellan 11 och 58% (figur 4). Från de ungar som erhålls från varje ämne, valdes en slumpmässig delmängd för de två viktigaste studierna som beskrivs här. Dessa studier utformades för att bedöma huruvida (under) populationer uppstånden från olika tidsperioder längs temperaturlutning visade skillnaderna i fitness-länkade livshistoria drag (5.1) och om de hade olika konkurrenskraftiga förmågor (5.2) efter exponering för uppvärmningen.
Figur 4: kläckning framgång i ett sedimentära arkiv som ingick i urvalet från Ringsjön. Andelen framgångsrika ungar längs sedimentära arkivet av Ringsjön som används i de viktiga studierna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Gemensam trädgård experiment
- Överföra tio ungar per (sub) befolkningen från lager kulturer till gemensamma trädgård villkor: 16 ° C; långa fotoperiod (16:8 ljus: mörk regimen). foder dagligen med 0,8 mg C/L av Chlorella vulgaris, och förnya medium varannan dag. Upprätthålla ungarna i gemensamma trädgård villkor i minst två generationer (ca 45 dagar). Gemensamma trädgård villkor minska störningar från moderns effekten och synkronisering reproduktion bland ungarna.
- Med lanseringen av den andra kullen in i avels kammaren, överföra vuxna kvinnor från andra generationen till 500 mL burkar fyllda med medium tills de släpper den andra kullen av ungfisk.
- Slumpmässigt överföra enskilda ungfisk av 24 – 48 h, född från den andra kullen av andra generationen, till 100 mL burkar fyllda med medium och utsätts för följande experimentella villkor: 18 ° C (nuvarande temperatur i sjön) och 24 ° C (uppvärmning, temperatur prognostiserade av IPCC 26 för de kommande 100 åren), 16:8 ljus: mörk regimen, och foder dagligen 0,8 mg C/L Chlorellavulgaris.
- På varje experimentella djur, mäta storleken på förfallodagen med ett stereomikroskop som avståndet mellan huvudet och basen av svansen ryggraden (figur 5). Fotografera varje djur och därefter analysera dess storlek med hjälp av en lämplig bild programvara.
- Mäta ålder vid mognad: dagen där ägg observeras för första gången i avels kammaren.
- Mäta dödligheten: antalet utdöda individer under experimentet.
- Mäta fruktsamhet: det totala antalet avkommor släppt i första och andra klonal reproduktion.
- Mäta den befolkningstillväxten, beräknad med hjälp av Eulers ekvation (1):
(1)
Där lx är andelen överlevnad vid ålder x, är bx antalet nyfödda produceras per överlevande individen vid ålder x, och r är naturliga inneboende ökningstakten. - Utföra statistiska analyser med hjälp av kommersiellt tillgängliga program. Här använda R31 att rita reaktion normer (fenotypisk expression av ett enda genotyp över miljöer) för varje liv historia egenskap, med hjälp av ggplot2-paketet. Beräkna dödlighet per invånare via överlevnadsanalys (R paketet rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Slutligen, utföra en variansanalys (ANOVA, tabell 2) i R31 att bedöma huruvida effekten av temperatur på egenskaper kan förklaras av evolution (skillnader bland populationer), plasticitet (svar på behandling) eller utvecklingen av plasticitet (befolkningen x behandling).
-
Konkurrens experiment
- Överföra tio ungar per invånare från lager kulturer till gemensamma trädgård villkor: 20 ° C, lång fotoperiod (16:8 ljus: mörk regimen), foder dagligen med 0,8 mg C/L av Chlorella vulgaris, och förnya medium varannan dag. Upprätthålla gemensamma trädgård villkor i minst två generationer (ca 45 dagar) för att minska störningar från maternella effekter.
- Slumpmässigt tilldela fem unga exemplar av 24 till 48 h från den andra kullen av andra generationer av varje hatchling experimentella mesokosmosstudier (20 L plast aquaria fylld med medium), i exemplar, med en täthet av 10 djur/L.
- Exponera mesokosmosstudier till 24 ° C, 16:8 l regim, och foder dagligen med 0,8 mg C/L av Chlorellavulgaris i en kontrollerad temperatur kammare eller inkubator för minst fyra veckor (> 3 klonal generationer).
- Slakta varje mesokosmos veckovis, uppfriskande 10% av mediet att simulera en befolkning dynamik som Daphnia kan stöta på i den naturliga miljön. Införa utslaktning genom att ta bort en känd volym av medium och djur från varje akvarium (1,2 L i detta fall), och genom att ersätta utgallrade volymen med färska medium. Starta culling regimen efter försöksdjuren nå mognad (dag 10).
- Vid slutet av den fjärde veckan, prova 32 djur från varje mesokosmos att bedöma förändringar i genotypiska sammansättning jämfört med det ursprungliga inokulatet.
- Placera enskilda Daphnia i mikrocentrifugrör och ta bort överflödig vätska med hjälp av en Pasteur-pipett.
- Blixt frysa enskilda rören i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C.
- Extrahera genomiskt DNA från enskilda individer med tillgängliga protokoll och följa tillverkarens instruktioner.
- Förstärka den extraherat DNA med hjälp av ett antal genetiska markörer tillräckligt för att ge en unik multilocus genotyp per hatchling. Här, användes 8 mikrosatelliter ordnade i en enda multiplex (M01, tabell 1) efter etablerade protokoll32,33.
- Genotyp förstärks fragment på ett fragment analyzer.
- Genomföra fragment analys med en kommersiell eller fritt tillgänglig programvara använder en lämplig storlek standard.
- Bedöma genotypisk sammansättning i slutet av experimentet genom genotypning 32 individer med en uppsättning mikrosatellit loci som beskrivs33och beräkna frekvensen av varje genotyp i slutet av experimentet jämfört med det ursprungliga inokulatet.
(1)
Figur 5: vuxen hona Daphnia magna. Vuxna kvinnliga Daphnia magna med partenogenetiska ägg i avels kammaren. Avståndet mellan huvudet och basen av svansen ryggraden används för att mäta storleken på djuret. De röda linjerna indikerar storleken mätningarna. Skalstapeln = 500 µm.
Representative Results
Långsiktiga empiriska data är avgörande för förståelsen av evolutionära dynamics och persistens i naturliga populationer. Sådana uppgifter är generellt utmanande att få på grund av logistiska svårigheterna med tillgång till temporal prover och kravet på att begå långsiktiga insamlingen. I de två viktigaste studierna presenteras här, tillhandahålls empiriska bevis av svar till temperaturen av en central Zooplankteren i sötvatten ekosystem över evolutionära gånger. Detta är aktiverat genom användning av skiktad vilande ägg banker som ger möjlighet att studera historiska populationer och deras moderna ättlingar svar till miljöbelastning i gemensamma experimentella inställningar.
Gemensam trädgård experiment
Gemensam trädgård experimentet visade att alla livshistoria drag svarade till temperatur (figur 6 och figur 7). ANOVA analysen visade att alla (under) populationer bemöta temperatur via plasticitet (tabell 2), med undantag för dödlighet, som inte svarar. Tecken av evolutions-ändringar (skillnader bland (under) populationer) observerades endast i befolkningstillväxten (tabell 2), som ökade signifikant i två av tre (under) populationer på 24 ° C (figur 6).
Figur 6: gemensam trädgård experiment. Reaktion normer för livshistoria drag (fruktsamhet, storlek och ålder på förfallodagen) och befolkningstillväxten (r) visas för varje (under) befolkning under temperatur uppvärmningen (24 ° C) jämfört med den gemensamma trädgården och nuvarande temperatur regimen (18 ° C). Befolkningstillväxten 'r' beräknas med hjälp av Eulerian ekvation (1). Konfidensintervall visas. (Under) populationer är färgkodade: (i) blå: 1960-1970; (ii) grön: 1970 – 1985; (iii) röd: > 1999. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: dödlighet. Dödligheten per (sub) invånare (1960-1970, 1970-1985; > 1999) visas under uppvärmningen (24 ° C) jämfört med moderna temperatur regimer (18 ° C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mesokosmos experiment
Efter fyra veckor av urval, företrädd av uppvärmningen vid 24 ° C, frekvensen av tre (under) populationer förändrades inte betydligt (χ2 = 0.55, P = 0,76) jämfört med den ursprungliga inokulatet (figur 8). Bland de 30 genotyper inokuleras i mesokosmos experimentet, identifierades flesta efter fyra veckor av urval (figur 9). Specifikt var 70% av de inokulerade genotyperna återvinnas, kompatibel med Poissonian förväntan att återvinna åtminstone en företrädare för varje genotyp i ett prov av 32 individer.
Figur 8: konkurrens experiment - befolkningen frekvens. Befolkningen i det genomsnittliga median och kvartiler (25: e och 75: e), visas för tre (under) populationer av D. magna efter fyra veckor av markeringen i mesokosmos konkurrens experiment (24 ° C), jämfört med en inledande lika frekvens (vid i början). (Under) populationer är färgkodade som visas i figur 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: konkurrens experiment - genotyp frekvens. Genotyp frekvenser — i genomsnitt median och kvartiler (25: e och 75: e), visas efter fyra veckor av exponering för uppvärmningen (24 ° C) jämfört med en inledande lika frekvens av genotyper (streckad linje). Namnen på x-axeln är inokulerade genotyper ID, grupperade per (sub) invånare (blå, 1960-1970; grön, 1970-1985; röd, > 1999). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Locus | EN | Storlekar (bp) | Grundfärger (5' - 3') | Dye etikett | Upprepa motiv | TM | |
| B008 | HQ234154 | 150 – 170 | F: TGGGATCACAACGTTACACAA | VIC | (TC) 9 | 56 | |
| R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC | |||||||
| B030 | HQ234160 | 154 – 172 | F: CCAGCACACAAAGACGAA | HUSDJUR | (GA) 11 | 56 | |
| R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT | |||||||
| B045 | HQ234168 | 118 – 126 | F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC | NED | (TG) 8 | 56 | |
| R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA | |||||||
| B050 | HQ234170 | 234 – 248 | F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC | 6FAM | (GAA) 6 | 56 | |
| R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG | |||||||
| B064 | HQ234172 | 135 – 151 | F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA | 6FAM | (TC) 8 | 56 | |
| R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA | |||||||
| B074 | HQ234174 | 196 – 204 | F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT | NED | (GT) 9 | 56 | |
| R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG | |||||||
| B096 | HQ234181 | 234 – 240 | F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA | VIC | (AC) 15 | 56 | |
| R: TTGAACCACGTCGAGGATTT | |||||||
| B107 | HQ234184 | 250 – 274 | F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA | HUSDJUR | (CT) 8 | 56 | |
| R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG | |||||||
Tabell 1: mikrosatellit multiplex. Den NCBI anslutningen nummer (AN), PCR primer sekvenser, upprepa motivet, intervallet PCR storlek, multiplex informationen, det färgämne som används till label framåt primer och glödgning temperaturen (Tm) visas.
| Pop tillväxttakt (r) | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 30.309 | < 0,001 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 531.546 | < 0,001 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 65.137 | < 0,001 | |
| Dödlighet | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 2.234 | 0.1162 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 2.679 | 0.1071 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 1.8657 | 0.164 | |
| Fruktsamhet | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 1.8852 | 0.1633 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 6.8934 | 0,0117 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 1.6511 | 0.203 | |
| Storlek på förfallodagen | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 0.211 | 0.8106 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 11.1361 | 0.0017 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 0.6586 | 0.5225 | |
| Ålder på förfallodagen | DF | F | P | |
| Evolution (Pop) | 2 | 0.7811 | 0.4637 | |
| Plasticitet (Temp) | 1 | 8.0764 | 0.0066 | |
| Evol. Plasticitet (Pop x Temp) | 2 | 0,088 | 0.9159 | |
Tabell 2: variansanalys (ANOVA). Variansanalys testa om förändringar i livshistoria drag och befolkningstillväxten av de uppståndne (under) populationer utsätts för uppvärmningen förklaras av evolutionär anpassning (populationer), plasticitet (temperatur behandling), och deras interaktionsterm (utveckling av plasticitet). Betydande p-värden (p< 0,05) visas i fetstil.
Kompletterande Video 1: provtagning av sedimentkärnor. Användning av en Big Ben corer visas. Big Ben är en core tub ca 1,5 m i längd med en inre röret diameter på 14 cm. Den består av en kolv på ett rep och en corer huvud, som bifogas stavar för att driva röret in i sedimenten. En core catcher används för att stödja core röret som distribueras från ett litet fartyg. Kolven trycks i sedimenten genom gravitationella trycket. En ram används för att stödja core röret under extruderingsprocessen utföras med hjälp av en modifierad flaska jack som driver kolven uppåt. Varje sediment lager är samlat på en platt metall yta och överförs till transparent säckarna för långtidsförvaring [mörkt och kallt (4 ° C) förhållanden]. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Video 2: Sediment siktning. Den utrustning som krävs för siktning sediment är en precision skala, vit provtagning brickor och geologiska såll. Från varje sediment lager bevaras minst 5 g för radiometrisk datering. Återstoden av sediment används för att isolera ephippia. Sedimenten siktas genom två geologiska siktar, en med 1 mm och en andra med 125 µm maskstorlek, staplade ovanpå varandra. Medium hälls på sikt med maskstorlek på 1 mm att skilja lera, stora ryggradslösa djur och partiklar. Medium som hälls på andra sikten med 125 µm mesh separerar D. magna ephippia och små partiklar. Alikvoter av sediment överförs sedan till en vit provtagning bricka. D. magna ephippia är fläckig av ögat i vit bakgrund facket. Ephippia från varje lager samlas i separat petriskålar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Video 3: avkodning av inkapsling. Under ett stereomikroskop, D. magna ephippia öppnas med lokalt tången genom att applicera tryck på ryggen av chitinen fallet. Inre ägg membranet avlägsnas försiktigt och vilar äggen försiktigt överförs med en Pasteur-pipett till en petriskål innehållande 10 mL medium. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Video 4: kläckning. Efter exponering för en lång fotoperiod och 20 ° C återupptar embryots utveckling mellan 48 h och några veckor. När utvecklingen är färdig, embryon bryta sig loss från äggskal och simma fritt i mediet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
På grund av den höga värmeledningsförmågan av vatten, sötvatten ekosystem på högre risk för förlust av biologisk mångfald än terrestra ekosystem inför globala uppvärmningen34. Det är därför avgörande för att förstå svaret av keystone arter i dessa ekosystem och identifiera coping mekanismer för att överleva termisk stress. Förståelsen av dessa mekanismer på arter och gemenskapens nivå kan hjälpa till att förutsäga hur arter påverkas av den globala uppvärmningen och hur inverkan på enskilda arter kaskader till andra trofiska nivåer. Slutändan, förstå mekanismerna bakom Svaren till den globala uppvärmningen möjliggör identifiering av saneringsstrategier att mildra utdöenden.
De fallstudier som presenteras här visar att D. magna svar på temperaturökning pervasively medieras av plasticitet i livshistoria drag och att svar på temperaturökning ensam inte ålägger tydlig fitness kostnader, åtminstone i den befolkningen studerats här. Hög plasticitet i livshistoria egenskaper stöds av icke-signifikanta skillnader i konkurrerande kapaciteterna av de (under) populationerna i närvaro av uppvärmningen. Längre sikt konkurrens experiment på flera populationer kan dock nödvändigt att generalisera dessa fynd.
Uppståndelsen av vilande stadier ger en oöverträffad resurs för att studera mekanismer för anpassning och banor för en Arts evolution genom tiden10. Djurplankton arter gynnas en snabb generationstid (ca 2 veckor) och livskraft vilande stadier, vilket gör att en förfader till konkurrera headtohead mot dess egna ättlingar eller till 'replay' evolution som startar från olika tidigare stater. Uppståndelsen ekologi kan i huvudsak utredning av huruvida ett visst evolutionära resultat är beroende av någon tidigare händelse. Identifiering av de genetiska element av evolution är för närvarande möjligt i laboratorieexperiment med mikroorganismer som 'fäderneärvda linjer' är fryst och återupplivat för jämförande analys med deras utvecklade ättling6. Dock är en av de viktigaste begränsningarna av att arbeta med laboratorium organismer att 'fäderneärvda staten' är en redan skiftat baslinjen. Studien av vilande stadier tillåter provtagning av exemplar från tiden som föregick helst stress (t.ex., orörda miljöförhållanden) och att mäta evolutionära banor från opåverkade miljömässiga förhållanden till olika tidigare stater fram till moderna tider. Under senare år har gett studier av DNA polymorfism i uppståndne eller fortfarande vilande djurplankton stadier viktiga insikter i senaste demografiska och adaptiva processer som bidragit till den genetiska makeupen av nuvarande populationerna14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. med hög genomströmning sekvensering teknik högre tillgänglighet, det genomet och transkriptom uppståndne eller fortfarande vilande stadier kan sekvenseras och typ och antal genetiska förändringar ackumuleras i utvecklas populationer över tid mäts.
Uppståndelsen SOP som presenteras här har viktiga tillämpningar inom multi-omics på två nivåer. Multi-omics teknik kan tillämpas på uppståndne exemplar, ger en uttömmande analys av de molekylära faktorer inblandade i adaptiv Svaren till miljömässiga selektionstryck. Dessutom kan omics teknik tillämpas på decapsulated men fortfarande vilande stadier. Tillämpningen av hög genomströmning sekvensering teknik till vilande stadier har hittills begränsats av kravet på en stor mängd insatsmaterial. Dessa begränsningar är att vara upplyft37. Sänka kraven för insatsmaterial och framsteg i nanofluidik, hela Genomsekvensering (WGS) är nu möjligt från så lite som 1 ng eller några pg av start material38. Användning av hela genomet amplifiering (WGA) och hela transkriptom amplifiering (WTA) tekniker, aktivera anrikningen av DNA och RNA från mycket små mängder av vävnad, har revolutionerat både metagenomik39,40 och sjukvård forskning41. Dessa tekniker som tillämpas på decapsulated vilande ägg aktivera överskrida av begränsningar som är associerade med livskraft vilande stadier och utrednings för längre period (t.ex., århundraden).
Uppståndelsen av ryggradslösa samhällen producerar vilande stadier kan anpassningen av gemenskapens historier med kända förändringar i landskap, eller med miljöförändringar som innebäras från analyser av sediment orsoils2. Analys av gemenskapens förändringar i svar på miljöförändringar ger oss möjlighet att kvantifiera eco-evolutionära återkopplingar42 som har betydande konsekvenser på befolkningens uthållighet43, trofiska interaktioner44 , gemenskapen montering45, och förändringar i ekosystem funktioner och tjänster46. Slutligen, korrekta förutsägelser om biologiska Svaren till miljöförändringar är avgörande att vägleda skyddet av biologisk mångfald47. Nuvarande prediktiva modeller är felaktig i detta avseende eftersom de inte tar in i konto viktiga biologiska mekanismer såsom demografi, spridning, evolution och arter interaktioner. Förstå hur dessa processer förändras över tid och använda denna information som en tidigare prognos modellering kommer att förbättra vår förmåga att förutse arter och gemenskapens uthållighet inför miljömässiga ändra2.
Tillämpningen av SOP presenteras här saknar inte utmaningar. Primära begränsning av uppväcker vilande stadier är behovet av specialutrustning för provtagning. Dessutom kräver hela processen, från sediment siktning till etableringen av klonala kulturer, betydande praktiska tid.
Några av de SOP-stegen som presenteras här kan lätt överföras till andra Daphnia -arter. Dessa är: provtagning, etablering av klonala linjer och experimentell design. Andra steg i SOP kan dock kräva ytterligare optimering anpassad till arten under studien. Avkodning av inkapsling är ofta tillämpas på D. magna prover att förbättra kläckning framgång. Detta tillvägagångssätt kan dock inte lämplig för mindre prover. Kläckning stimuli kan också variera mellan arter48 och hawaiimonark preparatet49. Därför krävas en ad hoc- optimering av kläckningen stegen i SOP före applikationer till andra kräftdjur. Kläckning framgången av D. magna befolkningen uppstånden från Ringsjön (30,5% över sedimentära arkivet) är i linje med tidigare resultat49, varierar kläckning framgång med bevarandet av sediment, arterna 50,51, och sediment48geografiska ursprung. Framtida studier på de mekanismer som reglerar inresa och progression genom faser av diapause krävs att identifiera optimala kläckning stimuli anpassade till olika arter.
Slutligen, bakgrund kunskap om studien, särskilt förekomsten av arter av intresse över tid, är tillrådligt. Detta kan åstadkommas via historiska dokument. Om historiska poster inte är tillgängliga, är provtagning och screening av ytbehandlalagrarna av sedimenten i sjön före core provtagningen lämpligt, även om det kan ge information endast om den senaste historia.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NERC höjdpunkter bidraget (NE/N016777/1). Ensis Ltd, vetenskapliga miljötjänster, Environmental Change Research Centre, University College London provtas och daterad sediment kärnan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
| piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
| precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
| geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh |
| geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh |
| white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
| pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL |
| stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
| petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
| glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
| glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
| glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
| statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
| microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
| image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
| mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
| mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick - Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
| AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
| size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers |
| ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |
References
- Lindenmayer, D. B., et al. Value of long-term ecological studies. Austral Ecol. 37 (7), 745-757 (2012).
- Orsini, L., et al. The evolutionary time machine: using dormant propagules to forecast how populations can adapt to changing environments. TREE. 28, 274-282 (2013).
- Grant, P. R., Grant, B. R. Unpredictable evolution in a 30- year study of Darwin's finches. Science. 296, 707-711 (2002).
- Lohbeck, K. T., Riebesell, U., Reusch, T. B. H. Adaptive evolution of a key phytoplankton species to ocean acidification. Nature Biosci. 5, 346-351 (2012).
- Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
- Barrick, J. E., Lenki, R. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
- Kawecki, T. J., et al. Experimental evolution. TREE. 27, 547-560 (2012).
- Fukami, T., Wardle, D. A. Long-term ecological dynamics: reciprocal insights from natural and anthropogenic gradients. P Roy Soc B-Biol Sci. 272, 2105-2115 (2005).
- Merila, J., Hendry, A. P. Climate change, adaptation, and phenotypic plasticity: the problem and the evidence. Evol Appl. 7 (1), 1-14 (2014).
- Evans, M. E., Dennehy, J. J. Germ banking: bet-hedging and variable release from egg and seed dormancy. Q Rev Biol. 80 (4), 431-451 (2005).
- Appleby, P. G. Chronostratigraphic techniques in recent sediments. 1, Kluwer Academic Publisher. (2001).
- Appleby, P. G., et al. PB-210 dating by low background gamma-counting. Hydrobiologia. 143, 21-27 (1986).
- Bidle, K. D., Lee, S. H., Marchant, D. R., Falkowski, P. G. Fossil genes and microbes in the oldest ice on Earth. PNAS. 104, 13455-13460 (2007).
- Geerts, A. N., et al. Rapid evolution of thermal tolerance in the water flea Daphnia. Nat Clim Change. 5, 665-668 (2015).
- Jansen, M., et al. Thermal tolerance in the keystone species Daphnia magna-a candidate gene and an outlier analysis approach. Mol Ecol. 26 (8), 2291-2305 (2017).
- Hairston, N. G. Jr, De Stasio, B. T. Jr Rate of evolution slowed by a dormant propagule pool. Nature. 336, 239-242 (1988).
- Hairston, N. G. Jr, et al. Lake ecosystems: Rapid evolution revealed by dormant eggs. Nature. 401, 446 (1999).
- Weider, L. J., Lampert, W., Wessel, M., Colbourne, J. K., Limburg, P. Long-term genetic shifts in a microcrustacean egg bank associated with anthropogenic changes in the Lake Constance ecosystem. Proc. R. Soc. Lond. B. 264, 1613-1618 (1997).
- Kerfoot, W. C., Robbins, J. A., Weider, L. J. A new approach to historical reconstruction: Combining descriptive and experimental paleolimnology. Limnol Oceanogr. 44 (5), 1232-1247 (1999).
- Cousyn, C., et al. Rapid, local adaptation of zooplankton behavior to changes in predation pressure in the absence of neutral genetic changes. PNAS. 98, 6256-6260 (2001).
- Decaestecker, E., et al. Host-parasite Red Queen dynamics archived in pond sediment. Nature. 450, 870-874 (2007).
- Miner, B. E., De Meester, L., Pfrender, M. E., Lampert, W., Hairston, N. G. Linking genes to communities and ecosystems: Daphnia as an ecogenomic model. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1735), 1873-1882 (2012).
- Ebert, D. Ecology, epidemiology, and evolution of parasitism in Daphnia. , National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology. (2005).
- Orsini, L., et al. Temporal genetic stability in natural populations of the waterflea Daphnia magna in response to strong selection pressure. Mol Ecol. 25, 6024-6038 (2016).
- IPCC. Summary for policymakers. , Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA. 1-32 (2014).
- Patmore, I. R., et al. Big Ben: a new wide-bore piston corer for multi-proxy palaeolimnology. J Paleolimnol. 51 (1), 79-86 (2014).
- Wright, H. E. Jr A square-rod piston sampler for lake sediments. J Sedimentary Petrology. 37, 975-976 (1967).
- Kilham, S. S., Kreeger, D. A., Lynn, S. G., Goulden, C. E., Herrera, L. COMBO: a defined freshwater culture medium for algae and zooplankton. Hydrobiologia. 377, 147-159 (1998).
- Klüttgen, B., Kuntz, N. orbert, Ratte, H. T. Combined effects of 3,4-dichloroaniune and food concentration on life-table data of two related cladocerans, Daphnia magna and Ceriodaphnia quadrangula. Chemosphere. 32, 2015-2028 (1996).
- R: A language and environment for statistical computing. , Vienna, Austria. (2017).
- Jansen, B., Geldof, S., De Meester, L., Orsini, L. Isolation and characterization of microsatellite markers in the waterflea Daphnia magna. Mol Ecol Res. 11, 418-421 (2011).
- Orsini, L., Spanier, K. I., De Meester, L. Genomic signature of natural and anthropogenic stress in wild populations of the waterflea Daphnia magna: validation in space, time and experimental evolution. Mol Ecol. 21, 2160-2175 (2012).
- Verberk, W. C. E. P., et al. Does oxygen limit thermal tolerance in arthropods? A critical review of current evidence. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 192, 64-78 (2016).
- Frisch, D., et al. A millennial-scale chronicle of evolutionary responses to cultural eutrophication in Daphnia. Ecol Lett. 17 (3), 360-368 (2014).
- Yashina, S., et al. Regeneration of whole fertile plants from 30,000-y-old fruit tissue buried in Siberian permafrost. PNAS. 109, 4008-4013 (2012).
- Southam, A. D., Weber, R. J. M., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nat Protoc. 12 (2), 310-328 (2017).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. Plos One. 9 (11), (2014).
- Baym, M., et al. Inexpensive Multiplexed Library Preparation for Megabase-Sized Genomes. Plos One. 10 (5), 6 (2015).
- Bourcy, C. F. A., et al. A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome Amplification Methods. Plos One. 9 (8), (2014).
- Hasmats, J., et al. Assessment of whole genome amplification for sequence capture and massively parallel sequencing. PLoS One. 9 (1), e84785 (2014).
- Becks, L., Ellner, S. P., Jones, L. E., Hairston, N. G. Jr The functional genomics of an eco-evolutionary feedback loop: linking gene expression, trait evolution, and community dynamics. Ecol Lett. 15 (5), 492-501 (2012).
- Ellner, S. P., Geber, M. A., Hairston, N. G. Does rapid evolution matter? Measuring the rate of contemporary evolution and its impacts on ecological dynamics. Ecol Lett. 14 (6), 603-614 (2011).
- Yoshida, T., Jones, L. E., Ellner, S. P., Fussmann, G. F., Hairston, N. G. Jr Rapid evolution drives ecological dynamics in a predator-prey system. Nature. 424 (6946), 303-306 (2003).
- Urban, M., et al.
- Dokulil, M. T. Eutrophication: Causes, Consequences and Control. , Springer. Netherlands. 81-88 (2014).
- Urban, M. C., et al. Improving the forecast for biodiversity under climate change. Science. 353 (6304), (2016).
- Schwartz, S. S., Hebert, P. D. N. Methods for the activation of the resting eggs of Daphnia. Freshwater Biol. 17, 373-379 (1987).
- Vanderkerhove, J., et al. Hatching of cladoceran resting eggs: temperature and photoperiod. Freshwater Biol. 50, 96-104 (2005).
- Caceres, C. E. Temporal variation, dormancy, and coexistence: a field test of the storage effect. PNAS. 94 (17), 9171-9175 (1997).
- Caceres, C. E. Interspecific variation in the abundance, production, and emergence of Daphnia diapausing eggs. Ecology. 79 (5), 1699-1710 (1998).
