Summary
Dieser Artikel beschreibt experimentelle Protokolle zur Untersuchung von ex-Vivo Kontraktionen der menschlichen Gebärmutter und deren Anwendung in der Drogeentdeckung. Diese Technik wird verwendet, um die Verbesserung des Verständnisses der Myometrial Physiologie und Pathophysiologie sowie über pharmakologische Daten aus neuartigen Forschung Sonden zu überprüfen oder Drogen führt.
Abstract
Entdeckung und Charakterisierung der neuartige pharmazeutische Substanzen oder biochemischen Sonden verlassen sich auf robuste und physiologisch relevanten Test-Systeme. Wir beschreiben Methoden zur Messung der ex Vivo Gebärmutter Kontraktilität. Dieser Test kann verwendet werden, um Faktoren zu untersuchen und Moleküle beteiligt die Modulation der Myometrial Kontraktion und ihre erregenden oder hemmenden Handlungen zu bestimmen und damit ihre therapeutische Potenzial in Vivo. Biopsien sind Frauen Sectio Lieferung mit Einwilligung eingeholt. Feine Streifen der Gebärmutter sind seziert, abgeschnitten und an einem Kraftaufnehmer innerhalb 1 mL Orgel Bäder unterkühlte mit physiologischer Kochsalzlösung bei 37 ° C. Streifen spontane Kontraktionen innerhalb von 2 – 3 h unter eingestellte Spannung zu entwickeln und für viele Stunden stabil bleiben (> 6 h). Streifen können auch zum Vertrag, wie durch die körpereigenen Hormone Oxytocin und Vasopressin, die Konzentration abhängig Modulation der Kontraktion Frequenz verursachen, Kraft und Dauer mehr ähneln Kontraktionen in der Arbeit angeregt werden. Daher kann die Wirkung von bekannten und neuartigen Medikament führt auf spontane und Agonist-induzierten Kontraktionen getestet werden.
Dieses Protokoll beschreibt speziell wie dieser Assay verwendet werden kann, die Potenz der bekannte und neuartige Wirkstoffe durch Messung ihrer Auswirkungen auf verschiedene Parameter der menschlichen Myometrial Kontraktion zu bestimmen. Wir verwenden die Oxytocin- und V-1a -Rezeptor-Antagonisten, Atosiban und SR49059 als Beispiele von bekannten Verbindungen die Oxytocin und Vasopressin-induzierten Kontraktionen zu hemmen, und demonstrieren, wie diese Methode verwendet werden kann, zu ergänzen und zu validieren pharmakologische Daten zellbasierte Assays zur Unterstützung der Entwicklung von Medikamenten. Die Auswirkungen der neuartigen Agonisten im Vergleich zu Oxytocin und Vasopressin können auch charakterisiert werden. Während wir das Beispiel der Oxytocin verwenden / Vasopressin-System, diese Methode kann auch zur Untersuchung anderer Rezeptoren und Ionenkanäle, die bei uterine Kontraktion und Entspannung, das Verständnis der menschlichen Gebärmutter Physiologie und Pathophysiologie fördern eine Rolle spielen.
Introduction
Arzneimittelforschung soll Roman, potent, und hoch selektive Liganden, die eine therapeutische Reaktion erzeugen durch Aktivierung oder Hemmung der zellulären Signalwege zu produzieren. Dies erfordert eine entsprechende Testsystem in die Bleiverbindungen mit zuverlässigen, robusten und relevante Ergebnisse1zu testen. Pharmakologische Techniken wie Ligand-Rezeptor-Bindung und funktionelle Assays setzen häufig heterologe zellbasierte Systeme entwickelt, um Overexpress Rezeptoren, die sonst nicht vorhanden2wäre. Diese Techniken bieten wertvolle Erkenntnisse für Rezeptor Pharmakologie und frühe Arzneimittelentwicklung, reflektieren die gewonnenen Daten möglicherweise keine echte in-Vivo -Szenario. Es ist daher wichtig, dass pharmakologische Daten aus zellbasierte Assays auch physiologisch relevanten Modelle validiert werden.
Uterine glatte Muskulatur (Gebärmutter) bildet die Muskelschicht der Gebärmutter die Kontraktionen während der Wehen, die auszulöschen verantwortet und den Gebärmutterhals zu dehnen und liefern den Fötus3. Kontraktion der Gebärmutter ist spontan; Es erfordert keine hormonelle oder nervös Eingang4Vertrag. Kontraktionen sind herbeigeführt durch spontane Depolarisation der Zellmembran Myometrial führt zur Öffnung der Spannung betriebenen Ca2 +-Kanäle (L-Typ) und Zustrom von Ca2 + in die Zelle5. Kalzium-komplexe mit Calmodulin und Myosin Leichtketten-Kinase, die wiederum Myosin ermöglichen Cross Brückenbildung Zyklus mit Aktin und Kontraktion phosphorylates aktiviert. Entspannung ist in der Regel durch de-Phosphorylierung der Myosin von Myosin Phosphatase und eine Verringerung der Konzentration von Ca2 + über die Extrusion von der Zelle und/oder Sequestrierung in dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR)5,6 vermittelt. ,7.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um Myometrial Funktion und Dysfunktion, von in Vivo interner und externer Tocography und intrauterine Druck Katheter zur Generation der transformierten oder verewigt Zellen Myometrial Ursprungs8 studieren ,9,10,11,12. Während Zellkultursysteme erkennen können, ob eine Substanz auf zellulärer Ebene tätig werden kann, können Streifen Gewebe im Organ Bäder, um funktionelle Reaktionen des gesamten Gewebes auf pharmakologische Reagenzien zu messen als Werkzeuge verwendet werden. Das traditionelle Orgel-Bad ist in der Regel einen großen beheizten Glas-Kammer, die in der Lage zwischen 5 und 50 mL physiologischer Kochsalzlösung (PSS) ist. Streifen in dieser großen Kammern verlangen in der Regel Belüftung mit Sauerstoff und große Mengen an PSS. Streifen des Gewebes werden seziert und innerhalb der Kammer Baden ausgesetzt und an ein Kraftaufnehmer, Änderungen in der Spannung, wie z. B. während einer Kontraktion misst. Streifen der Gebärmutter von Menschen und Tieren wie Meerschweinchen13, Maus14, Ratte15, Kaninchen16und andere17,18, durch eine Reihe von Forschungsgruppen verwendet wurden, um zu prüfen viele Fragen rund um Myometrial Physiologie und Pathologie, einschließlich Frühgeburten und dysfunktionale arbeiten. Zum Beispiel Myometrial Streifen wurden verwendet, um die Faktoren zu identifizieren, die zu regulieren und ändern myogen Aktivität19,20,21, bestimmen Organelle Funktion wie die SR-22sowie Untersuchung von Modulatoren des Ion Kanäle23,24,25,26, Pumpen und Wärmetauscher27 um ihre Rolle in der Physiologie der Myometrial zu bestimmen.
Diese ex-Vivo -Technik ermöglicht Gewebe Kontraktion Leistungsbewertung und die unmittelbare Wirkung der verschiedenen Agenten auf die Parameter der Kontraktion zu messenden einschließlich, Kontraktion Kraft (Stärke), Häufigkeit und Dauer, sowie die Integration dieser Werte, um einen Index der gesamten Arbeit getan (mittlere integraler Kraft oder Fläche unter der Kurve, AUC) zu generieren. Da die isolierte Gewebe Streifen Vorbereitung ein Modells von mehr als einer Zelle Art darstellt, kann die physiologische Reaktion des gesamten Gewebes gemessen werden. Die Orgel Bad und isolierte Gewebe Streifen sind daher ein nützliches Werkzeug bei der Bereitstellung von der Brücke zwischen Zelle Kultur Arbeit und Ganztier /in Vivo zu arbeiten. Daher auf dem Gebiet der Arzneimittelforschung, die Auswirkungen der neuartige Wirkstoffe in Bezug auf ihre exzitatorischen (d. h.anregend) oder hemmende (d.h., Entspannung) potenzielle in Vivo genauer beurteilt werden kann. Diese Technik wurde erfolgreich im Einsatz bei der Entwicklung von Oxytocin und V1a-Rezeptor (OTR und V1aR) Antagonist Atosiban als Tocolytic Mittel um vorzeitige Wehen zu hemmen und Frühgeburt zu verzögern. In-vitro- Tests von Atosiban auf Myometrial Streifen gefunden der Antagonist signifikant senken Oxytocin (OT)-induzierten Kontraktionen28,29,30. Vor allem diese Studien dazu beigetragen, die translationalen Wert von Atosiban validieren und generiert die Proof-of-Concept-Daten nehmen an klinischen Studien31,32,33,34 weiter erforderlich . Atosiban ist jetzt als das Mittel der Wahl verbreitet, um Arbeit in Europa zu verzögern. Ähnliche Proof-of-Concept-Studien wurden für die Oxytocin analoge Carbetocin sein therapeutische Potenzial zeigen bei der Verhinderung postpartale Blutungen35,36,37durchgeführt. Anderen Bleiverbindungen derzeit in der Entwicklung mit diesem Assay gehören Retosiban (GSK221149A)38 und Nolasiban (unveröffentlichte Daten). Diese Methoden haben auch erfolgreich verwendet worden, Vergleich zwischen Patientengruppen39,40,41,42,43,44, 45,46,47 und prüfen für Intra-Arten unterschieden.
Hier beschreiben wir die Verwendung von isolierten ex Vivo Gewebe Streifen von schwangeren menschliche Gebärmutter in kleinen (1 mL) maßgeschneiderte Orgel Bäder zu veranschaulichen, wie diese Methode verwendet werden kann, zu ergänzen und zu validieren pharmakologische Daten aus zellbasierte assays . Biopsien stammen überwiegend aus Frauen Pre-labor elektiven Sectio (CS) Lieferung zu unterziehen, wie sie sind geplante Operation und sind daher leichter zu planen Biopsie Kollektion, haben leichten Zugang zu der Gebärmutter, und Gewebe nicht zu einem gemacht worden werden Uterotonic Stimulanzien oder Beruhigungsmittel vor der Operation. Jedoch Biopsien erhalten Sie ebenfalls von Frauen ungeplant (not-) CS-Lieferung in der Arbeit, vorausgesetzt, es ist genügend Zeit für den Patienten voll und ganz zustimmen. Die meisten Biopsien werden während der Operation von der unteren Uterinsegments auf dem Gelände der chirurgischen Inzision gewonnen, aber es auch möglich ist, Proben aus dem gehobenen Segment48,49erhalten. In einigen Fällen nach Entbindung wurden Stanzbiopsien aus der Plazenta Bett50ermittelt. Aber dies ist nicht die meisten herkömmlichen Route und die Myometrial Gewebe abgerufen ist gering. Nicht-schwangeren Gebärmutter kann vor oder nach der Menopause Frauen unterziehen Hysterektomie für gutartige gynäkologische Bedingungen entnommen werden. Eine volle dicke Biopsie ist gesampelten Post-Pathologie-Prüfung aus dem unteren Korpus von der Zervix und Gebärmutter stammt aus der Mitte von der Gebärmutterwand serosal und endometrialen Oberflächen zu vermeiden.
Protocol
Entsprechende institutionelle, ethische Prüfung Board und Sicherheit Genehmigung für Experimente mit menschlichen Geweben muss vor dem arbeiten mit jeder menschlichen Geweben. Alle Arbeiten beschrieben hierin empfangene Zustimmung der lokalen Ethikkommission Forschung (East Liverpool, REC Ref 10/H1002/49) und institutionellen Fachkollegien der Forschungs- und Entwicklungsabteilung, Liverpool Women Hospital und University of Liverpool.
Hinweis: Alle Biopsien beschrieben in diesem Protokoll wurden von Frauen vor Arbeit gab elektiven CS Lieferung bei Liverpool Frauenklinik und jede Frau schriftliche Einwilligung zur Teilnahme erhalten.
(1) Lösungen
- Bereiten Sie modifizierte Krebs physiologischer Kochsalzlösung (PSS) mit folgender Zusammensetzung: 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 7,8 mM Glukose, 10,9 mM HEPES und 2,0 mM CaCl2.
Hinweis: Die Lautstärke erfolgen richtet sich nach der Anzahl der Gewebe Bäder in Betrieb, die Durchflussmenge des Systems (1 mL/min) und Länge des Experiments einschließlich Gleichgewichtherstellung und Auswaschung der geschätzt. - Einstellen Sie pH auf 7,4 mit 4 M NaOH.
(2) Gewebe Bad einrichten
- Heizen Sie das Gewebe Bad System Reservoir auf ~ 45 ° C mit einem umlaufenden Wasserbad setzen bei 55-60 ° c vor
Hinweis: Die Wasser-Reservoir in der Basis des Apparates auf ~ 45 ° C, was nach Abzug der Wärmeaustausch mit der PSS in der peristaltischen Schlauch durchzieht, wird sichergestellt, dass die PSS im Gewebe Bad bei 37 ° c erhitzt Gewisse Anpassung an Temperaturen eingestellt kann erforderlich sein, um sicherzustellen, dass die Temperatur des PSS im Gewebe Bad 37 ° c erreicht Dies variiert je nach Gerät verwendet und Durchflussmengen. - Jede andere notwendige Ausrüstung einschließlich Verstärker, Datenerfassung und Aufzeichnungssystem und Saugpumpen manuell einschalten.
- Positionieren Sie jede peristaltischen Einleitungsrohr (eine Röhre pro Bad) um die Rollen der peristaltischen Pumpenkopf. Mit der Sicherungsring hält und durch Anziehen der Kompression Nocken und Verriegelung Schlüssel um die Rohre zu sichern. Legen Sie die freien Enden der peristaltischen Zuführschläuchen in ein 1 L Gefäß von PSS und starten der Pumpe, damit das PSS, kontinuierlich in die Gewebe Bäder durchspülen kann.
- Stellen Sie sicher die Saugpumpen einwandfrei sind und, dass das Niveau der Lösung in der Badewanne konstant ist, so dass die Rate von Strömung in die Wanne der Entfernung gleich. Die Höhe der PSS in das Gewebe Bad kann durch die Manipulation der Tiefe des Saugrohres in der Badewanne mit dem Modellierer Ton eingestellt werden.
- Kraftaufnehmer zu kalibrieren, indem du ein bekanntes Gewicht an den Haken Wandler (entspricht 1 Millinewton (mN, Einheit der Kraft)) und Aufnahme der Ablenkung von der Datenerfassungs-Software erkannt.
Hinweis: Werte können in der Software eingestellt werden, so dass die Werte automatisch in mN negiert die Notwendigkeit, weitere Umbauten während der Analyse durchzuführen konvertiert werden. Kalibrierung von Kraftaufnehmern muss vor der Montage Gewebe durchgeführt werden.
(3) Gewebe Vorbereitung und Präparation der Streifen
- Sammeln Sie Biopsien von schwangeren menschliche Gebärmutter (1 – 2 cm3) nach der Geburt von Baby und Plazenta am CS. Zu erhalten (typisch) volle dicke Biopsien, in denen das Perimetrium (äußere Darmhaut Schicht der Gebärmutter) und Dezidua (innerste Schicht der Gebärmutter) vorhanden sind. Verwenden Sie nur Myometrial Gewebe (zentrale Muskelschicht). Siehe Abbildung 1A-B.
- Da diese Gewebe bekannt sind, Stoffe zu produzieren, die Myometrial Kontraktilität verändern können entfernen Sie (wesentlich) Decidua und jede anhaftenden fetalen Membranen (falls vorhanden).
Hinweis: In der Chirurgie sind Proben in Hanks ausgewogen Salz-Lösung (HBSS) oder frische PSS gelegt und bei 4 ° c gelagert Im Idealfall sollten Gewebe innerhalb von 12-16 h der Chirurgie, verwendet werden, jedoch keine Beeinträchtigung der Kontraktilität nach 18 Uhr-Auflistung mit Lagerung bei 4 ° C51Studien. Entsprechende Kontrollen bestätigen Gewebe Lebensfähigkeit und Funktion nach längerer Lagerung bei 4 ° c Die Beispiele hier stammen von der Oberkante des unteren Uterinsegments Einschnitt Standortes und nicht aus dem oberen Segment. Die untere und obere Segmente des Uterus, ebenso48Vertrag gezeigt wurden, gelten daher unteren Segment Biopsien als ein gutes Spiegelbild der oberen Segment Myometrial Aktivität.
- Da diese Gewebe bekannt sind, Stoffe zu produzieren, die Myometrial Kontraktilität verändern können entfernen Sie (wesentlich) Decidua und jede anhaftenden fetalen Membranen (falls vorhanden).
- Bereiten Sie die Dissektion Bereich und die erforderlichen Instrumente einschließlich: große Dissektion Scheren, kleine Vannas sezierenden Schere zwei sezierenden Pinzetten, Dissektion Stifte und Alu-Gewebe-Clips, um eine Dissektion Mikroskop mit beiden fixiert und Zoom Vergrößerung.
- Ort der Biopsie-Probe auf einem klaren Silastic-basierte Dissektion Teller (siehe Tabelle der Materialien) gefüllt mit PSS und sorgfältig die Biopsie zu orientieren, so dass die Darmhaut und Dezidua Kanten identifiziert werden Abbildung 1 b.
- Verwenden Sie Stifte zum Sichern der Biopsie auf der Basis der Schale. Sicherstellen Sie, dass das Gewebe mit PSS Verlauf der Dissektion hydratisiert bleibt.
- Manuell schalten Sie das Mikroskop Lichtquelle und inspizieren Sie das Gewebe unter dem Mikroskop bei 10facher Vergrößerung, Regionen der Gebärmutter frei von Narbengewebe, Darmhaut, Decidua und jede anhaftenden fetalen Membranen falls vorhanden zu identifizieren.
- Führen Sie stumpfe Dissektion mit großen Dissektion Schere zwei angrenzenden Gewebeschichten, enthüllt zwei Flugzeuge oder Blätter des Muskels zu trennen.
Hinweis: Es ist oft einfacher, eine kleine Tasche zwischen Gewebeschichten zu beginnen, die Trennung zu finden, sondern muss darauf geachtet werden, kleine Schiffe am Rande Biopsie zu vermeiden, da sie für "Taschen" verwechselt werden können. - Ort zu sezieren pins auf jeder Ecke des Gewebes zu sichern. Überprüfen Sie die Blätter des Muskels, die auf der Suche nach Regionen des Muskels mit Fasern laufen parallel.
Hinweis: Region Identifikation kann durch Anschluss an die Richtung der kleinen Kapillaren Vorrichtung durch das Gewebe unterstützt werden. Sanftes ziehen am Rande Gewebe kann auch helfen, die Richtung zu identifizieren, in der die Fasern unterwegs sind. - Schneiden Sie Streifen des Gewebes ~ 2 mm Breite X 8 mm lang X 1 mm dick entlang der Längsachse ausgerichtet mit der Richtung der Muskelfasern mit kleinen Dissektion Schere.
Hinweis: Vorsicht ist geboten, nur halten das Gewebe durch die anfängliche Schnittkante um Schäden zu vermeiden. - Wiederholen Sie den Vorgang, die Anzahl der erforderlichen Streifen für das Experiment zu zergliedern.
- Heften Sie jeden Streifen an beiden Enden zu glätten und das Gewebe in die Schale, kümmert sich nicht um Strecke zu sichern.
- Alu-Gewebe-Clips an den Enden befestigen, so dass das Gewebe zwischen ihnen ist ~ 5 mm lange und sorgfältig weggeschnitten jede überschüssiges Gewebe (Abbildung 1).
- Übertragen Sie auf ein sauberes Geschirrtuch mit PSS einbaufertig gefüllt.
4. Montage der Gewebe in den Bädern
- Übertragen Sie die Streifen auf die experimentelle Gewebe Bäder. Montieren Sie die Streifen horizontal anstatt vertikal (wie in traditionellen Orgel Bäder) (Abb. 2 b).
- Schließen Sie ein Ende des jeden Streifen durch den Clip Kraftaufnehmers, die das Gewebe zusammenziehen misst, und der andere zu einem festen Haken sowohl innerhalb der Gewebe-Kammer.
Hinweis: Die Kapazität des Bades Gewebe ist ~ 1 mL was ist groß genug, um sicherzustellen, dass die Streifen vollständig in das Bad eingetaucht sind. - Stellen Sie sicher, dass die Streifen an der Basis der einzelnen Haken im Bad sind.
- Öffnen Sie die Aufnahmesoftware durch einen Doppelklick auf das Icon.
- Einstellen Sie die Aufnahme für jeden Kanal so, dass es in der Ansicht im Fenster "Kanal" ist.
- Passen Sie die Y-Achse-Skala zwischen 0-10 V (entspricht 0-10 mN-Post-Kalibrierung) mit der rechten Maustaste auf die y-Achse, wählen Sie "Skalierung", und Eingabe minimale und maximale Werte von 0 bis 10, bzw. zu lesen. Wählen Sie "OK". Wiederholen Sie für jeden Kanal-Aufzeichnung.
- Drücken Sie "Record" auf die Software live-Aufnahme zu beginnen.
Hinweis: Wenn Streifen an der Basis jeder Haken nicht gesichert sind, könnten sie während der Kontraktion rutschen die als eine "Kerbe" auf der Aufnahme angezeigt wird. Die eingestellte Spannung ändert und daher nach dem Schlupf Kontraktionen kann abweichen. - Dehnen Sie das Gewebe in jedem Bad, durch manuelles Drehen der Mikromanipulatoren an jeder Wandler angeschlossen. Die Bewegung nach oben Gewebe vom Ausgangswert auf dem Bildschirm folgen und weiterhin die Mikromanipulatoren drehen, bis die Grundlinie Spannung 0,2 g (~ 2 mN) erreicht.
Hinweis: Das Gewebe beginnt sofort zu entspannen (festgestellt durch einen Abfall der Grundlinie Spannung), in der Regel erreichen eine stetige Spannung zwischen 0,5 – 1 mN. Diese definierten Spannung wurde für Gewebe Streifen dieser Größe in unserem experimentellen Bedingungen optimiert. Wenn andere große Gewebe eingesetzt werden sollen, ist es wichtig, dass geeignete Länge-Spannung Beziehung Untersuchungen durchgeführt werden, um die ruhende Kraft angewendet werden zu optimieren. - Ermöglichen die Gewebe für equilibrate ~ 2 h bis spontane Kontraktionen entstehen.
Hinweis: eine kleine Anhöhe in der Grundlinie Spannung wird in der Regel beobachtet und ist ein guter Indikator für Gewebe Lebensfähigkeit und daß es kontraktilen werden.
(5) eine Herausforderung des Gewebes mit 40 mM Kalium (hohe K+)
- Wenn keine spontane Kontraktionen nach 2 h der Montage auftreten, fordern Sie die Streifen mit einer hohen Kalium-Salzlösung in der Kalium-40 mM durch isosmotic Substitution von NaCl für KCl erhöht ist. Für die hohe K+, fügen Sie die folgenden (in mM): 119.6 NaCl, 40 KCl, 1,2 MgSO4, 7,8 Glukose, 10,9 HEPES und 2.0 CaCl2.
Hinweis: In glatte Muskulatur wie Gebärmutter, Anwendung von hohen K+ verursacht Kontraktion durch indirekt öffnen Spannung betrieben Calciumkanäle führt zu maximalen Zustrom von Ca2 + in den Gewebezellen. Hohe K+ daher als Maßnahme lässt sich der allgemeine Index Gewebe Integrität sowie die Erreichung einer Maßnahme maximal Tissue Response testen.- Legen Sie den Einfüllstutzen für das Bad mit den Streifen in einer Glasflasche Labor mit hohen K+ für 1 – 2 min. herausgefordert zu werden.
- Den Einfüllstutzen in den Container der PSS zurück.
- Eine Antwort auf hohe K+ erreicht wird, weiter Überwachung des Streifens für weitere 1 h. Wenn es keine kontraktile Antwort auf hohe K+ oder keine spontane Aktivität ausgelöst stellen hohe K+ Antwort, verwerfen Sie die Streifen.
Hinweis: Der Experimentator muss auch bewusst von der dead Space (Zeitaufwand für die Lösung für die Gewebe-Bad zu erreichen) in den Feeder-Schlauch vor der Beurteilung der Reaktion auf hohe K+. Dies dauert ca. 2-3 min und Durchflussmenge hängt. - Dafür komplett auswaschen des hohen K+ aus der Badewanne und Feeder Röhren, die nachfolgende Manöver beeinflussen könnten, zu warten, bis spontane Kontraktionen wieder vor hohe K+ Amplitude, bevor Sie fortfahren mit dem Experiment weiter.
6. testen die Auswirkungen von bekannten und neuartigen Verbindungen auf Myometrial Kontraktion
Hinweis: Experimente, testen Sie die Wirkung von neuen Medikamenten und Reagenzien auf die Myometrial Funktion können auf spontane (Abbildung 3A) oder Agonist stimuliert Zusammenziehungen (Abb. 3 b-C) durchgeführt werden. Für Agonist stimuliert Kontraktionen, OT oder Arginin Vasopressin (VP) wird hinzugefügt, um die PSS zu einer Konzentration von 0,5 nM und dient während des Experiments (Abb. 3 b-C). Die Konzentration von OT ist für dieser Assay optimiert worden, da sie Kontraktionen bietet die Natur40,52phasisch sind. Konzentrationen von Agonisten größer als dies zu lang anhaltende, nachhaltige (Tonika) Kontraktionen (siehe Ref41,44 für Beispiele) führen kann, unter die die Wirkung der verschiedenen Akteure schwer abzuschätzen ist und den experimentellen Zeitrahmen erheblich verlängert werden muss, um die erhöhte Dauer der einzelnen Kontraktionen und Reduktion in der Frequenz unterzubringen. In diesem Beispiel Experiment OT oder VP ist hinzugefügt, um die Kontraktionen so stimulieren, dass Antagonismus durch bekannte OTR und V1aR Antagonisten, Atosiban und SR49059 oder durch unsere neuartige Verbindung [D-Arg8]-Inotocin (INT [D-Arg8]), beurteilt werden können.
- Konzentrationen von Test widerrufen in PSS vorbereiten (mit oder ohne 0,5 nM OT/VP) verdünnt auf ein Minimum von 1/1.000 Verdünnung, gewährleisten der unterschiedlichsten Konzentrationen sind wie diejenigen, die keine Antwort auf Konzentrationen entlocken zu tun, die die maximale überschreiten Antwort.
- Bereiten Sie eine gleichwertige Reihe von Verdünnungen mit gleichen Volumina des Fahrzeugs (z.B., Dimethyl Sulfoxid, Acetonitril oder destilliertes Wasser).
Hinweis: Es ist oft am einfachsten, die höchste Konzentration, d.h.10-6 M (aus einem Bestand von 10-3 M) vorbereiten und führen Sie dann Verdünnungsreihen entlang einer logarithmischen Skala (z. B.10-6–10-10 M). Das Volumen bereit sein richtet sich nach Zeitpunkt der Antragstellung, Durchfluss der Apparat, und Anzahl der Streifen untersucht werden, z.B.für eine 25 min Anwendung des Reagenz und einer Durchflussmenge von 1 mL/min, ein Minimum von 25 mL jede Konzentration pro Gewebe Bad ist requir Ed. - Gelten Sie die ersten Konzentration Verbindung des Gewebes durch die Platzierung der Feeder-Schläuche für die Gewebe-Bad in einer Glasflasche, Labor, enthält das Reagenz in der gewünschten Konzentration.
Hinweis: Dies sollte eine stetige Baseline für spontane oder OT/VP-stimulierten Kontraktionen erreicht. - Gelten Sie die entsprechenden Fahrzeug-Control-Lösung auf die gleiche Weise zu einem zweiten Bad.
- Notieren Sie die Zeit der Anwendung (d. h., wenn die Zufuhr-Schläuche geändert wurde).
- Wiederholen Sie den Vorgang für jede Konzentration, indem man nacheinander die Feeder-Schläuche in die Labor-Glasflasche, die mit der nächsten Konzentration in der Serie und wiederholen Sie, bis alle Konzentrationen angewendet wurden.
Die Anwendung jeder Konzentration kann zwischen 15 und 30 min aber sollte für jede Konzentration aufgetragen und zwischen Experimente im Einklang sein. OT oder VP-stimulierten Kontraktionen neigen dazu, die längeren Fristen (z.B. 25 min), für die Reduzierung in Kontraktion Frequenz beobachtet unter Stimulation zu berücksichtigen müssen. Vorversuchen zu bestimmen, die optimale Anwendungsdauer sollte vorher mit jeder neuen Reagens getesteten durchgeführt werden. - Auswaschung den Einfüllstutzen an PSS (mit oder ohne OT/VP) zurückzukehren.
- Klicken Sie auf "beenden", um die live-Aufnahme zu beenden. Sofort die Daten in einen entsprechenden Ordner speichern und eine Version als ".mat" Datei exportieren.
7. die Datenanalyse
Hinweis: Datenerfassung und Analyse kann durch eine beliebige Anzahl von im Handel erhältlichen Daten Akquisition Software-Paketen durchgeführt werden. Siehe Tabelle der Materialien in diesem Protokoll verwendeten Software. Für eine genaue Beurteilung der kontraktilen Aktivität, die Parameter der Kontraktionen zu messenden enthalten: (i) die Amplitude der Kontraktion, Ii) Häufigkeit der Kontraktion, Iii) Dauer der Kontraktion und iv) mittlere Kraft Integral (Abbildung 4). Integrale mittlere Kraft entspricht der Fläche unter der Kurve der Kontraktion und ist daher ein Index der gesamten Arbeit getan durch die Gewebe Streifen in einem bestimmten Zeitraum. Einige oder alle Parameter können analysiert werden. Als Minimum wird empfohlen, dass die mittlere integraler Kraft und Amplitude der Kontraktion analysierten53. In den hier beschriebenen Experimenten haben wir Änderungen in der Amplitude der Kontraktion und Fläche unter der Kurve gemessen.
- Importieren Sie the.mat Datei in die Analysesoftware.
- Passen Sie die Spalte auf die x-Achse, entsprechen die experimentelle Zeit, unter Berücksichtigung der Abtastfrequenz Intervall entspricht. Experimente sind in der Regel bei 10 Hz entspricht 10 Proben/s bzw. 600 Proben/min aufgezeichnet.
- Plot-Daten als eine X-Y koordinieren Diagramm mit "Plot | Line"-Funktion.
- Null der Grundlinie der Kontraktion mit Hilfe der Funktion "übersetzen vertikalen" auf die Software.
- Wählen Sie einen entsprechenden Zeitraum.
Hinweis: Dies ist der Zeitraum unmittelbar vor der Anwendung der ersten Konzentration von Regent aber gleich der Dauer der Anwendung des Reagenz (Abb. 4A). Beispielsweise ist die Anwendung der Droge X 25 min, verwenden Sie 25 min, die vor der ersten Anwendung des Medikaments X wie das Steuerelement. - Der y-Achse abgelesen, die Amplitude (Kraft) der Kontraktion auf dem max Höhepunkt jeder Kontraktion Auftritt im ausgewählten Zeitraum aufzeichnen und einen Mittelwert zu berechnen.
- Messen Sie die Dauer der Kontraktion bei 50 % dieser maximalen Peak durch Ablesen der x-Achse am Anfang und Ende jeder Kontraktion zu und zeichnen Sie einen Mittelwert.
- Die Anzahl der Kontraktionen in den zeitlichen Rahmen zur Generierung eines Werts für Frequenz auftreten.
- Über die Funktion "Integration", um AUC zu berechnen (in beliebigen Einheiten a.u) für den Zeitraum ausgewählt.
Hinweis: Um AUC genau zu erfassen, ist es unerlässlich, dass sich die Grundlinie der Kontraktionen bei Null auf der y-Achse befindet. - Nacheinander durch die einzelnen Konzentrationen bewegen Sie und zeichnen Sie die verschiedenen Parameter der Kontraktion.
- Legen Sie die Steuerdaten als 100 % und express unter jede Konzentration von Reagenz als Prozentsatz dieser ermittelten Werte steuern, d.h., Werte für die Stimulation sollte > 100 % Entspannung soll < 100 %.
Hinweis: Normalisierung der Daten auf diese Weise sollte der Benutzer Ergebnisse über Streifen und pharmakologischen Behandlungen vergleichen kann. - Wiederholen Sie für jedes Experiment und übertragen Sie die Daten in einem grafischen Paket.
Representative Results
Mit diesem Modell kann die Antwort auf Agonisten und Antagonisten der Kontraktion sowie neuartige Wirkstoffe von bekannten oder unbekannten Funktion untersucht und quantifiziert werden. Pharmakologische Standardparameter wie EG50 und IC50 Werte errechnet werden, wenn Reagenzien sind in den unterschiedlichsten Konzentrationen, z.B., 10-5– 10-9 M verwendet und hinzugefügt in steigenden Konzentrationen entlang einer logarithmischen Skala.
Oxytocin-Rezeptor-Antagonist Konzentration-Wirkungs-Experimente
In diesem Experiment gekoppelte Streifen der menschlichen Gebärmutter wurden geschnitten wie oben beschrieben und in Abbildung 1, montiert in den Bädern von Gewebe, wie in Abbildung 2dargestellt und equilibrate um stabile Kontraktionen der gleicher Amplitude zu produzieren und Frequenz. Streifen wurden dann zu den endogenen OTR-Agonist, OT ausgesetzt (0,5 nM) zu Kontraktionen anregen. Nach einer Periode der stabile Aktivität unter OT (in der Regel 45 min) war Atosiban auf einem Streifen in steigenden Konzentrationen entlang einer logarithmischen Skala (10-9– 10-6 M) angewendet. Der zweite Streifen war im OT wie Zeitsteuerung allein gelassen. Ein Beispiel für die Reaktion auf Atosiban sehen in Abbildung 5A. Nehmen die Kontraktionen, die unmittelbar vor der ersten Konzentration von Atosiban als Kontrolle (100 %), wurde die Amplitude und AUC für jede Konzentration angewendet berechnet wie in Abbildung 4dargestellt. Zeitsteuerung Experimente war die Zeit-Äquivalent von experimentellen Manöver gemessen. Die Daten wurden anschließend geplottet und Kurven ausgestattet, über die nicht-lineare Regression-Funktion in eine grafische Software-Paket (Abbildung 5 b-C). Bei der Berechnung der inhibitorischen Wirkung, wurde die relative Wirkstärke von Atosiban berechnet, durch die Messung der IC50 , die die Konzentration verursacht eine halbe maximale (50 %) hemmende Reaktion ist. Das gleiche kann für Agonisten oder Stimulatoren der Kontraktion erfolgen. In diesem Fall wird die Potenz der Verbindung von der EG-50 (die Konzentration verursacht eine halbe maximale Stimulationsantwort) berechnet.
Die Reaktion der neuartige Substanzen zu untersuchen und testen ihre Rezeptor-Selektivität
Diese physiologisch relevante Modell der ex Vivo menschlichen Myometrial Kontraktionen verwendet, um zu prüfen, die antagonistische Effekte einer neu synthetisierte Verbindung, [D-Arg8]-Inotocin ([D-Arg8] INT) auf Kontraktionen angeregt entweder mit die nativen V1a R-Agonist, VP oder native OTR-Agonist, OT. Wir verwendeten Assays, um die Rezeptor-Selektivität der [D-Arg8] INT, zu validieren, die zuvor durch pharmakologische Zell-basierte Methoden festgestellt wurde hatte ein Antagonist an V1aR aber nicht um die OTR-54.
In diesem Experiment wurden menschliche Myometrial Streifen 0,5 nM VP oder 0,5 nM OT für rund 1 h Kontraktionen zu stimulieren, wie in Abbildung 3dargestellt, bevor Sie unsere neuartige Verbindung [D-Arg8] INT in steigenden Konzentrationen (Abb. 6A und Abbildung hinzufügen ausgesetzt 6 C). Dies war dann im Vergleich zu der im Handel erhältlichen, bekannte V1aR-Antagonist, SR49059 (Abb. 6 b). Abbildung 6A zeigt Konzentration abhängige Rückgang der VP-stimulierten menschlichen Myometrial Kontraktionen mit steigenden Konzentrationen [D-Arg8] int. Die Daten für die Amplitude der Kontraktion und AUC für jede Konzentration sind in Abbildung 6Aii-Iiizusammengefasst. Der Effekt ist ähnlich dem zur Erhöhung der Konzentrationen von den bekannten V1aR Inhibitor, SR49059, dargestellt in Abbildung 6Bi-Iiigezeigt. Die Selektivität der [D-Arg8] INT gegenüber V1aR aber nicht gegenüber der OTR wird durch die Tatsache gezeigt, dass [D-Arg8] INT tut nicht Verringerung menschlichen Myometrial Kontraktionen, die mit OT (Abbildung 6) angeregt worden als Amplitude und AUC blieb stabil (Abbildung 6Cii-Iii).
Abbildung 1: menschliche Myometrial Biopsie Dissektion. (A) A Diagramm des menschlichen Uterus zeigt die drei Gewebeschichten, aus die die Gebärmutterwand besteht. Die innerste Schicht ist das Endometrium (Dezidua in Schwangerschaft, roter Pfeil), die mittlere Schicht ist der Gebärmutter (Muskelschicht, schwarzer Pfeil) die Kontraktionen erzeugt und die äußerste Schicht ist die Perimetrium (serosal Membran, blauer Pfeil) welche Formen ein schützenden Mantel um die Gebärmutter. Die Region von Interesse für die Biopsie Probenahme wird durch das schwarze Rechteck dargestellt. (B) zeigt eine Beispiel Biopsie von einer schwangeren Frau, die während der Kaiserschnitt mit der Decidua und Myometrial Schichten hervorgehoben (Darmhaut nicht sichtbar). Es ist wichtig, dass die verschiedenen Gewebeschichten identifiziert werden, so dass Streifen der Gebärmutter für Experimente richtig zerlegt werden. (C) zeigt ein Beispiel-Streifen der Gebärmutter, seziert und abgeschnitten. In der Regel 2 – 6 Streifen geschnitten und abgeschnitten, wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Multi-Organ Bad experimentelle Reihe bis zur Messung der Kontraktionen der menschlichen Gebärmutter. (A) Streifen der Gebärmutter befinden sich in kleinen (1 mL) Orgel Bad Kammern auf einem beheizten Reservoir (i) platziert und sind unterkühlte mit physiologischer Kochsalzlösung (PSS) im Wege einer peristaltischen Pumpe (Ii). Das Reservoir wird bei einer bestimmten Temperatur durch zirkulierende Wasserbad (Iii) beibehalten. Jeder Streifen ist ein Kraftaufnehmer (iv), die Änderungen in der Spannung während der Kontraktion Datensätze beigefügt. Dies ist durch ein Transbridge Verstärker (V) verstärkt und umgewandelt in ein digitales Signal (vi), die auf einem Computersystem (Vii) läuft der damit verbundenen Datenerfassungs-Software aufgezeichnet ist. (B) vergrößerte Bild von einer Orgel Bad Kammer mit einem Streifen der menschlichen Gebärmutter in Situ (roter Pfeil), gebadet in PSS mit einem Ende an ein Kraftaufnehmer und andererseits zu einer festen Haken befestigt. ()C) schematische Übersicht über die Einrichtung. Gewebe-Kammern gefüllt mit PSS sind ständig mit erwärmten PSS bei 37 ° C durchströmt die über Wärmeaustausch mit einem beheizten Wasserreservoir unter den Bädern (gehalten bei 45 ° C) und einer Umwälzpumpe Wasser auf 55 ° c eingestellt Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: spontane und Agonist stimuliert Kontraktionen der menschlichen Gebärmutter in-vitro-. In Agonist-freien Bedingungen stabil für mehr als 3 h Aufnahme ohne erheblichen Verlust der Amplitude oder Bereich-unter-der-Kurve (AUC) (Aii, Aiii), spontane Kontraktionen demonstriert die Robustheit dieses Modells zur Untersuchung der Anwendung der verschiedenen Akteure auf spontane Kontraktion. Physiologischer Kochsalzlösung (PSS) wurde nach der Gründung stabiler, spontaner Kontraktionen, 0,5 nM Oxytocin (B, OT) oder Vasopressin (C, VP) hinzugefügt. Kontraktionen unter Stimulation auch stabil bleiben für mehrere Stunden ohne erheblichen Verlust der Kontraktion Amplitude (Bii, Cii) oder AUC (Biii, Ciii) die Wirkung der verschiedenen kontraktilen Agenten zu aktivieren in Anwesenheit von Myometrial Agonisten untersucht. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) vorgestellt. Hinweis, für Agonist stimuliert Kontraktionen (B, C), Kontrollzeitraum (100 %) erfolgt nach den ersten 45 min Anwendung der Agonist, sobald Kontraktionen stabilisiert zu haben. In allen Fällen wurden Streifen unterkühlte mit PSS bei 37 ° C, pH-Wert 7,4 (vervielfältigt von Arrowsmith Et al. 40 mit freundlicher Genehmigung von Reproduktiven Wissenschaften und Di Giglio Et al. 54 mit freundlicher Genehmigung von Wissenschaftlichen Berichten unter der Lizenz Creative Common Open Access). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Datenanalyse. (A) Einen entsprechenden Kontrollzeitraum rot dargestellt wurde durch die Auswahl von Kontraktionen, die unmittelbar vor der Anwendung der Testsubstanz (Medikament X) festgelegt. Dieser Kontrollzeitraum entspricht auch rechtzeitig zur Anwendung des Medikaments X (z.B.40 min in diesem Beispiel). Sobald die Messwerte für die Kontrollzeitraum werden als 100 % gesetzt. Alle nachfolgende Messungen sind dann ausgedrückt als Prozentsatz des Steuerelements. (B) gibt es 4 verschiedene Parameter der Kontraktion, die gemessen werden können: (i) die Amplitude der Kontraktion der Kontraktionskraft (Kraft, mN), (Ii) die Häufigkeit der Kontraktion misst die Rate der Kontraktion, (Iii) die Dauer der Kontraktion misst die auf halben maximalen Höhepunkt der Kontraktion und (iv) Fläche unter der Kurve (auch bekannt als integraler, willkürliche Krafteinheiten) verleiht ein Maß für die allgemeine Arbeit gemessen wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Aufnahme der antagonistischen Wirkung von Atosiban auf Oxytocin-induzierten Kontraktionen in menschliche Gebärmutter. Wenn spontane Kontraktionen hergestellt wurden, wurden mit Oxytocin Rezeptor Agonist, Oxytocin (OT) Kontraktionen angeregt. Kontraktionen durften unter Stimulation für eine weitere 45 min. (A) V1a und OT-Rezeptor-Antagonisten zu stabilisieren, Atosiban wurde dann in steigenden Konzentrationen entlang einer logarithmischen Skala (10-9-10-5M) angewendet. Die Kontraktionen in der Zeit vor der ersten Konzentration von Atosiban wurden gemessen und als Kontrolle (100 %). Die Aktivität unter jede spätere Konzentration wurde gemessen und ausgedrückt als Prozentsatz des Steuerelements. Das gleiche wurde für Streifen ausgesetzt OT allein mit dem Zeit-Äquivalent von experimentellen Manöver durchgeführt. Daten wurden in grafische Software gezeichnet: (B, C) zeigen die Konzentration-Wirkungs-Kurven für die antagonistische Wirkung von Atosiban (blau) und entsprechende Verdünnung des Fahrzeugs (grau, Zeitsteuerung) auf OT-induzierte Myometrial Kontraktion Amplitude und Fläche unter der Kurve (AUC), beziehungsweise. Daten werden als der Mittelwert ± Standardfehler der Mittelwert (SEM) Prozentsatz der Amplitude und AUC der Kontrolltätigkeit (vor der Anwendung von Atosiban) dargestellt. IC50 Werte wurden dann berechnet die geben der Konzentration, bei der die halbe maximale hemmende (50 %) Antwort für die Amplitude der Kontraktion und Kraft Integral (AUC) ist, erreicht (vervielfältigt von Arrowsmith Et al. 40 mit freundlicher Genehmigung von Reproduktiven Wissenschaften). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: testen die Wirkung und Rezeptor Selektivität eines Romans Verbindung auf menschlichen Myometrial Kontraktion. Nachdem spontane Kontraktionen der menschlichen Gebärmutter hergestellt wurden, wurden mit der Vasopressin-Rezeptor-Agonisten, Vasopressin (VP) (Ai, Bi) oder die Oxytocin-Rezeptor-Agonisten, Oxytocin (OT) (Ci) Kontraktionen angeregt. Die Wirkung der [D-Arg8]-Inotocin (INT [D-Arg8]) und der im Handel erhältlichen V1aR Antagonist, SR49059 auf Kontraktionen angeregt durch VP wurde durch die steigende Konzentrationen von Verbindungen Anwendung bewertet. Typische Antworten erscheinen (Ai, Bi). Die damit verbundene analysierten Daten für Amplitude und Fläche unter der Kurve (AUC) in (Ii) angezeigt werden und (Iii), bzw. wo die Wirkung als Prozentsatz des Steuerelements zum Ausdruck gebracht wurde-Aktivität (100 %). [D-Arg8] INT und der bekannten V-1aR-Antagonist, verursacht SR49059 eine Dosis abhängigen Abnahme der Amplitude und AUC, die Rolle des [D-Arg8] INT als ein V-1aR-Rezeptor-Antagonisten in menschliche Gebärmutter zu unterstützen. Im Gegensatz dazu [D-Arg8] INT hatte keinen Einfluss auf Kontraktionen angeregt von OT (Ci-Iii), daher ebenso auf unsere Ergebnisse aus zellbasierte Assays, [D-Arg8] INT zeigt auch Selektivität gegenüber V1aR in menschliche Gebärmutter (Daten von Di reproduziert Giglio Et al. 54 mit freundlicher Genehmigung von Wissenschaftlichen Berichten unter der Lizenz Creative Common Open Access). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Während die meisten Entwicklung von Medikamenten für die Behandlung von menschlichen Erkrankungen bestimmt ist, erfolgt die Grundlagenforschung hauptsächlich in tierischen Geweben. Hier beschreiben wir Methoden zur Untersuchung von ex-Vivo Kontraktionen der menschlichen Gebärmutter erhalten von der Operation, die eine Reihe von wichtigen Fragen im Zusammenhang mit uterinen Physiologie und Pathologie sowie funktionale Antworten validieren verwendet werden können für bekannte und neuartige pharmakologische Wirkstoffe zur Unterstützung der Entwicklung von Medikamenten. Insbesondere stellen wir die Verwendung des Assays zu untersuchen, die antagonistische Antwort ein bekannter OTR und V1aR kompetitiver Antagonist, Atosiban auf OT-induzierte schwanger Myometrial Kontraktionen, sowie die Reaktion und Rezeptor zu bestimmen Selektivität von einem neu entwickelten selektive V1aR Antagonisten, [D-Arg8] INT. Wir zeigen, dass wichtige pharmakokinetischen Parameter wie EG50 und IC50 berechnet werden können, die gut mit der Zell-basierte Pharmakologie Daten ausrichten.
Die gleichzeitige Benutzung mehrere Streifen ermöglicht direkten Vergleich mehrerer Agenten Effekte, Wettbewerb Experimente mit Antagonisten sowie entsprechende Zeit und das Fahrzeug. Als Streifen oft in Gruppen von 2, 4 oder 8 vorbereitet sind, bietet diese Technik moderate Durchsatz ermöglichen das Testen von 2 – 4 Verbindungen bei 6 – 8 (kumulativ) Konzentrationen (pro Biopsie). Diese Methode bietet auch Echtzeit-Daten, so dass die Wirkung schnell beurteilt werden können und Protokolle eingestellt werden. Darüber hinaus ist diese Technik kann verwendet werden, um eine Verbindung von Interesse zu testen und wurde durch eine Reihe von Forschungsgruppen konzentrierte sich auf Myometrial Physiologie und in der Drogeentdeckung erfolgreich eingesetzt. Neben reinen Verbindungen zu analysieren, wie in diesem Dokument beschrieben, die uterinen Kontraktilität Modell wurde auch und erfolgreich genutzt werden können, um Bildschirm für neuartige Uterotonic Verbindungen aus Mischungen, wie z. B. pflanzliche Zubereitungen aus traditionellen Medizin7 , 55 , 56.
Obwohl dieses Modell technisch robust ist und gute Reproduzierbarkeit zeigt, es muss einige Einschränkungen: Dissektion kann schwierig sein für diejenigen, die nicht mit dem Gewebe oder mit Dissektion Ausrüstung, damit neue Benutzer werden einige Zeit benötigen, um Gewebe zu optimieren Vorbereitung und Protokolle. Anzumerken ist, dass menschliche Gebärmutter deutlich unterscheidet sich im Aussehen zu anderen Modellen wie Ratte und Maus. Die meisten Nager Uteri bestehen aus zwei schlauchförmige uterine Hörner, jeweils komplett mit einem Eierstock an einem Ende und trat mit der Zervix. Jedes Horn hat klar definierte längs- und kreisförmige Muskelschichten, die bei Dissektion leicht getrennt werden können, während die verschiedenen Fasertypen in menschliche Gebärmutter oft miteinander verflochten sind, bilden ein "Netz". Darüber hinaus sind die Kontraktion Profile der menschlichen Gebärmutter ganz anders als Nagetiere. Vor allem sind Kontraktionen in der menschlichen Gebärmutter weniger häufige, aber längere Dauer. Experimentelle Zeitrahmen für die Arbeit mit menschlichen Gebärmutter sind daher oft viel länger als Nager-Modelle. Unterschiede zwischen den Arten-Rezeptor-Expression können auch zur recht deutliche Unterschiede in den Antworten zu Agonisten beitragen und dies sollte berücksichtigt werden wenn Hochrechnung der Ergebnisse über Artgrenzen.
Es gibt auch die Anzahl der Schritte, die Rücksicht auf die von diesem System zu maximieren. Wichtige Schritte umfassen die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Gewebe wie kümmert sich beim Umgang mit Gewebe zur Vermeidung von unnötigen Schäden während Dissektion oder bei der Montage. Eine qualifizierte Auge ist erforderlich, um feine Streifen des uterinen Muskels, sicherstellen, dass die Ausrichtung der Muskelfasern in Längsrichtung und Anschluss an die Ebene des Gewebes, und die Vermeidung von Narbengewebe, Decidua und kleine Schiffe zu sezieren. Um Orientierung helfen, sobald die Probe im Labor ist, ist es möglich, einen Tag (z. B. kleine chirurgische Naht) auf der einen Seite der Biopsie, serosal Rand vom deziduale Rand abzugrenzen zum Zeitpunkt der Sammlung hinzufügen.
Gewebe sind stetige 36 – 37 ° c während der Experimente aufzubewahren, wie Gewebefunktion Temperaturschwankungen unterworfen ist. Dies kann mit einer robusten Klimagerät im Labor erreicht werden. Konstante Durchblutung des erwärmten PSS stellt sicher, dass die Temperatur gehalten wird, sowie die Spülung aus Abfallprodukten von Kontraktion. Temperatur innerhalb der Organ-Bäder kann durch Durchflussmenge ändern oder einstellen der Temperatur des Wassers-Bad direkt verändert werden. Die kleine Bad Größe im Vergleich zu traditionellen 5-50 mL Bäder sorgt für einen relativ schnellen Umsatz von PSS und Auswaschung von Reagenzien. Die miniaturisierte Orgel Bad reduziert wie hier beschrieben auch das Volumen der PSS und Reagenzien von Interesse erforderlich, damit Minimierung der Kosten und schonen wertvolle, neu entwickelte Chemikalien. Darüber hinaus aufgrund der kleinen Bad-Größe und mit einem HEPES-Puffer, erfordert dieses System Oxygenierung z.B.nicht von PSS mit Carbogen sprudeln. Wichtig ist auch die Standardisierung der Spannung auf den Streifen aufgetragen. Dies sollte für Streifen dieser Größe (5 x 2 x 1 mm) ca. 2 Mio. (entspricht ~0.2 g). Alternative Methoden umfassen Anwendung eine hohe Kalium-Lösung um maximale Kontraktion und Dehnung auf die Hälfte dieser maximale Kontraktion zu induzieren. Es muss jedoch darauf hingewiesen, diese Spannung in Vivo können abweichen.
Die wichtigsten Herausforderungen Gewebe von Versuchspersonen erhalten unter anderem zwar anstrengend, menschliche Gewebe deutlich vertreten die physiologisch relevante (und lohnende) Modell für das Studium Uteruskontraktion in menschliche Krankheit und Drug Discovery. Das isolierte Gewebe, die Streifen jedoch nicht unbedingt auf Gewebe in Vivo gleichsetzen wie sie z. B. von hormonellen befreit sind und nervös, die geben zwar nicht unbedingt erforderlich für die Kontraktion, werden Kontraktionen in Vivomodulieren. Dieser Test bietet jedoch die Möglichkeit, Myometrial Kontraktionen kontrolliert, von solchen Einflüssen getrennt analysieren. Es ermöglicht auch die Wirkung von Faktoren wie hormonelle Steuerung der Kontraktion (z. B.über OT, VP, Prostaglandine, etc.) untersucht werden, mit Hinweisen auf die Regulierung der Myometrial Funktion. Wie Gewebe von verschiedenen Frauen bezogen werden, gibt es natürlich einige Unterschiede in den spontanen kontraktilen Profilen zwischen Proben. Daher ist es oft notwendig, Experimente auf eine große Anzahl (~ n = 10) der Proben, die Variation in einige Datensätze53zu minimieren. Dies ist am wichtigsten, wenn kontraktilen Aktivität zwischen verschiedenen Patientengruppen zu vergleichen. Normalisieren die Reaktion des Agonisten und Antagonisten, Aktivität zu kontrollieren (d.h., zum Ausdruck zu bringen als ein Prozentsatz der Kontrolltätigkeit oder hohe K+) einige dieser Variante reduziert. Um Inter Streifen Variante zu reduzieren, können darüber hinaus Daten normalisiert werden, um Querschnittsfläche Streifen durch die Messung ihrer Länge und Gewicht Post Experimente41. Dies ist besonders nützlich, wenn Sie Kontraktion Muster zwischen den verschiedenen Patientengruppen zu vergleichen.
Einschränkungen dieser Technik auch Zugang zu frischem Gewebe erfordert gute Arbeitsbeziehungen mit Krankenhauspersonal, vor allem Theater Personal und an die Einwilligung-Prozess Beteiligten. Außerdem müssen ethische Berechtigungen aus der lokalen Ethik-Forschungsethikkommission und Institute oder Krankenhaus Review Board vorhanden sein. Sammlung der menschlichen Gebärmutter ist am ehesten während CS Lieferung durchgeführt, wenn der Spender operiert wird. Die Biopsie ist aus dem gleichen uterinen Schnittführung-Ort für die Bereitstellung des Babys gemacht und der Patient muss daher keine weitere zusätzlichen Verfahren zu unterziehen. Theater Personal und der Chirurg, die Durchführung der Biopsie müssen für die spätere Nutzung des Gewebes sensibilisiert werden und dass sie nicht in Fixativ Lösungen so platziert werden, wie bei einer Pathologie Abteilung senden. Der lange experimentelle Zeitrahmen ist ein weiterer Aspekt. Experimente mit menschlichen Geweben viele Stunden dauern (in der Regel > 6 h) (im Gegensatz zu 2 – 3 h für ein ähnliches Experiment in Ratte oder Maus Gebärmutter), aufgrund der langsamer Frequenz der Kontraktion und der 2 – 3 h Zeitabstand zwischen Gewebe Montage und Einrichtung von spontan Kontraktionen. Aber, wie wir gezeigt haben, menschliches Gewebe Kontraktionen sind robust, und können viele Stunden ohne erhebliche Müdigkeit40Vertrag.
Dieses System erlaubt auch andere Herausforderungen für die in-Vivo -Arbeit überwunden werden, einschließlich der Fähigkeit, pharmazeutische Reagenzien auf Schwangere Gewebe zu testen. Diese Technik kann leicht auf andere Tierarten einschließlich Maus, wobei die ersten Ergebnisse werden, bevor Sie fortfahren bestätigt können, extrapoliert werden im gesamten tierexperimentellen Studien weiter. Kontrollierte Änderungen in der Temperatur, Zusammensetzung des Superfusate (PSS) und pH kann leicht gemacht werden verschiedene Szenarien in Vivo zu imitieren und analysieren die Auswirkungen dieser Änderungen auf zusammengesetzte Verhalten. Die grundlegenden Prinzipien des Messens isometrischen Anspannung in Myometrial Streifen auch erweiterbar um gleichzeitige Änderungen im intrazellulären Calcium-Konzentration oder pH-Wert Messung durch die Verwendung von fluoreszierenden Ca oder pH (H+) Indikatoren und Ausrüstung zu erkennen und Rekord Fluoreszenz57,58,59,60.
Insgesamt repräsentiert der menschlichen Gebärmutter eine robuste und physiologisch relevante Modell zu charakterisieren und neuartige therapeutische Substanzen in der Drogeentdeckung validieren – reine Verbindungen und Mischungen. Wir haben Beispiele seines Gebrauches in der Wirkstoffforschung im Hinblick auf die OT/VP und konzentrierte sich auf OTR und V1einR Antagonisten zu zeigen, wie dieses Modell verwendet werden kann, um zusammengesetzte Wirksamkeit und Potenz auf definierte Ziele bestimmen und Liganden Selektivität zu validieren. Dennoch sollte es berücksichtigt werden, beachten Sie, dass diese Technik kann verwendet werden, um jedes Ziel von Interesse oder Fußweg Myometrial Kontraktion (oder Entspannung) zu studieren, sowie Wirkstoffforschung neue Ziele und Wege zu helfen und unser Verständnis von myometrial Physiologie und Pathophysiologie.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch die Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) durch Projekt I3243 und der European Research Council (ERC) unter der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (Finanzhilfevereinbarung Nr. 714366). CWG wurde durch ein Australian Research Council (ARC) Zukunft Fellowship (FT140100730) und MM ein ARC Entdeckung frühen Karriere Forscher (DECRA) Fellowship (DE150100784) unterstützt. SA stützt sich auf ein Harris-Wohlbefinden Preterm Geburt Zentrum Forschungsstipendium vom Wohlbefinden der Frauen, UK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
| Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
| GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
| LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
| Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
| BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
| Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
| Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
| Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
| Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
| Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
| Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
| Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
| Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
| Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
| Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
| Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
| Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
| Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
| Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
| Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
| Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
| HBSS | SIGMA | H9269 | |
| Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
| Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
| [Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
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