Summary
Denna artikel beskriver experimentella protokoll för att studera ex vivo sammandragningar av mänskliga myometrium och deras tillämpning i läkemedelsutveckling. Denna teknik används för att förbättra förståelsen av myometrium fysiologi och patofysiologi samt att verifiera farmakologiska data från romanen forskning sonder eller drug leads.
Abstract
Identifiering och karakterisering av nya läkemedelssubstanser eller biokemiska sonder lita på robust och fysiologiskt relevant analys system. Vi beskriva metoder för att mäta ex vivo myometriet kontraktilitet. Denna analys kan användas för att undersöka faktorer och molekyler inblandade i moduleringen av myometrium kontraktion och att fastställa deras retande eller hämmande åtgärder, och därmed deras terapeutiska potential i vivo. Biopsier erhålls från kvinnor som genomgår kejsarsnitt leverans med informerat samtycke. Fina strimlor av myometriet dissekeras, klipps och bifogas en kraftgivare inom 1 mL orgel bad superfused med fysiologisk koksaltlösning lösning vid 37 ° C. Strips utveckla spontana sammandragningar inom 2 – 3 h under inställd spänning och förblir stabila i många timmar (> 6 h). Remsorna kan också stimuleras för att kontrakt som av endogena hormoner, oxytocin och vasopressin, som orsakar koncentrationsberoende modulering av kontraktion frekvens, styrka och varaktighet, att mer likna sammandragningar i arbete. Effekten av kända och nya läkemedel leder kan därför testas på spontana och agonist-inducerad sammandragningar.
Detta protokoll Detaljer speciellt hur denna analys kan användas för att bestämma styrkan av kända och nya agenter genom att mäta deras effekter på olika parametrar för mänskliga myometrium kontraktion. Vi använder oxytocin- och V1a -receptorantagonister, atosiban och SR49059 som exempel på substanser som hämmar oxytocin och vasopressin-inducerad sammandragningar, och visar hur denna metod kan användas för att komplettera och verifiera farmakologiska data som erhållits från cell-baserat analyser till stöd läkemedelsutveckling. Effekterna av romanen agonister jämfört med oxytocin och vasopressin kan också betecknas. Medan vi använder exemplet med Oxytocinet / vasopressin systemet, denna metod kan också användas för att studera andra receptorer och jonkanaler som spelar en roll i livmoderns sammandragning och avslappning för att främja förståelsen av människans livmoder fysiologi och patofysiologi.
Introduction
Målet med läkemedelsutveckling är att producera roman, potenta, och mycket selektiv ligander som genererar ett terapeutiskt svar genom att aktivera eller hämma cellulära signalvägar. Detta kräver en lämplig analys där att testa blyföreningar med tillförlitlig, robust och relevanta resultat1. Farmakologiska tekniker såsom ligand-receptorbindning och funktionella analyser använder ofta heterologa cell-baserat system, konstruerad till overexpress receptorer som annars inte skulle vara närvarande2. Medan dessa tekniker ger värdefulla insikter för receptorn farmakologi och tidig läkemedelsutveckling, kan uppgifterna återspeglar inte en sann i vivo -scenario. Det är därför viktigt att farmakologiska data från cell-baserat analyser valideras även i fysiologiskt relevanta modeller.
Glatt muskulatur i livmodern (myometrium) utgör den muskulösa lagret av livmodern som är ansvarig för värkarna under förlossningen att utplåna och vidga livmoderhalsen och leverera det fostret3. Sammandragning av myometriet är spontan; Det kräver inte hormonell eller nervös indata till kontrakt4. Värkarna är följd av spontan depolarisation av myometrium cellmembranen vilket leder till öppnandet av spänning manövrerade Ca2 +-kanaler (L-typ kanaler) och tillströmningen av Ca2 + in i cellen5. Kalcium komplex med calmodulin och aktiverar myosin light chain kinase som i sin tur phosphorylates myosin möjliggör cross bridge cykel formation med aktin och kontraktion. Avkoppling är typiskt medierad av avinstallation fosforylering av myosin av myosin fosfatas och en minskning av koncentrationen av Ca2 + via dess extrudering från cellen eller binda till sarkoplasmatiska nätmagen (SR)5,6 ,7.
Flera metoder har utvecklats för att studera myometrium funktion och dysfunktion, från i vivo interna och externa tocography och intrauterina trycket katetrar, till generation av omvandlade eller förevigade celler av myometrium ursprung8 ,9,10,11,12. Samtidigt som kultur cellsystem kan upptäcka om ett ämne kan fungera på cellnivå, kan remsor av vävnader inom orgel bad användas som verktyg för att mäta funktionella Svaren av hela vävnader till farmakologiska reagenser. Traditionell orgel badet är vanligtvis ett stort uppvärmt glas kammare som kan hålla mellan 5 och 50 mL fysiologisk koksaltlösning (PSS). Remsor i dessa stora kammare kräver normalt luftning med syre och stora volymer av PSS. Remsor av vävnad är dissekeras och upphängd i badning kammaren och bifogas en kraftgivare som mäter förändringar i spänningar, såsom under en sammandragning. Remsor av myometriet från både människor och djur inklusive, marsvin13, mus14, råtta15, kanin16och andra17,18, har använts av ett antal forskargrupper för att undersöka många frågor om myometrium fysiologi och patologi, inklusive prematura och dysfunktionella mödor. Till exempel myometrium remsor har använts för att identifiera faktorer som reglerar och ändra myogenic aktivitet19,20,21, bestämma organell funktion såsom SR22, samt utreda modulatorer av Jonen kanaliserar23,24,25,26, pumpar och värmeväxlare27 för att fastställa deras roll i myometrium fysiologi.
Denna ex vivo -teknik möjliggör bedömning av vävnad kontraktion prestanda och den direkta effekten av olika agenter på parametrarna för kontraktion skall mätas inklusive, kontraktion kraft (styrka), frekvens och varaktighet, samt integration av dessa värden, att skapa ett index av totala arbete (integrerad medelkraft eller arean under kurvan, AUC). Som isolerade vävnad strip preparatet utgör en modell för mer än en celltyp, kan det fysiologiska svaret av hela vävnad mätas. Den orgel bad och isolerade vävnad strip är därför ett användbart verktyg för att ge bron mellan cell kulturarbete och hela djuret /i vivo arbete. Därav, inom läkemedelsutveckling, effekterna av romanen agenter när det gäller deras excitatoriska (dvs, stimulerande) eller hämmande (dvs, avkoppling) potentiella i vivo kan mer noggrant bedömas. Denna teknik användes framgångsrikt i utvecklingen av oxytocin- och V1a-receptorn (OTR och V1aR) antagonist atosiban som tokolytiskt medel hämmar prematura arbete sammandragningar och fördröja prematur förlossning. In vitro test av atosiban på myometrium remsor hittade antagonisten kan avsevärt minska oxytocin (OT)-inducerad sammandragningar28,29,30. Allt dessa studier bidragit till att validera translationell värdet av atosiban och genererade proof-of-concept data behövs för att ta den vidarebefordra till kliniska prövningar31,32,33,34 . Atosiban är nu allmänt används som drogen av primat fördröja arbetskraft i Europa. Liknande proof-of-concept studier utfördes för att oxytocin analoga karbetocin att visa sin terapeutiska potential att förebygga post-partum blödningar35,36,37. Andra blyföreningar för närvarande under utveckling med denna analys inkluderar retosiban (GSK221149A)38 och nolasiban (opublicerade data). Dessa metoder har också använts framgångsrikt att jämföra mellan patientgrupper39,40,41,42,43,44, 45,46,47 och undersöka inom arten skillnader.
Här beskriver vi användningen av isolerade ex vivo vävnad remsor från gravid mänskliga myometriet inom små (1 mL) skräddarsydda orgel bad för att illustrera hur denna metod kan användas för att komplettera och validera farmakologiska uppgifter som erhållits från cell-baserat analyser . Biopsier erhölls till stor del från kvinnor som genomgår före labor elektiva kejsarsnitt (CS) leverans eftersom de är planerad operation och därmed är lättare att schemalägga biopsi samling, har enkel tillgång till myometriet, och vävnader kommer inte utsatts för någon uterotona stimulantia eller muskelavslappnande medel före operation. Biopsier kan dock fås från kvinnor som genomgår oplanerade (akuta) CS leverans i arbete ger det finns tillräcklig tid att fullt samtycker patienten. De flesta biopsier erhålls under operation från lägre livmoder segment på platsen för kirurgiska snitt, men det är också möjligt att erhålla prover från de övre segment48,49. I några fall efter vaginal förlossning, har punch biopsier från placenta sängen också erhållits50. Men detta är inte den mest konventionella rutten och myometrium vävnad Hämtad är liten. Icke-gravida myometriet kan erhållas från före eller postmenopausala kvinnor som genomgår hysterektomi för godartade gynekologiska tillstånd. En full tjocklek biopsi är samplade efter patologi undersökning, från det lägre corpuset bort från livmoderhalsen, och livmoder tas från mitten av livmoderväggen undvika serös och livmodercancer ytorna.
Protocol
Lämpliga institutionella, etisk granskning styrelsen och säkerhet godkännande för experiment med mänskliga vävnader måste vara på plats innan du arbetar med alla mänskliga vävnader. Allt arbete beskrivs häri mottagna godkännande från den lokala forskningsetiska kommittén (Liverpool East, REC Ref 10/H1002/49) och institutionella granskning styrelserna för forsknings- och utvecklingsavdelning, Liverpool Women's Hospital och universitetet i Liverpool.
Obs: Alla biopsier som beskrivs i detta protokoll erhölls från kvinnor som genomgår före labor elektiv CS leverans på Liverpool Women's Hospital och varje kvinna gav skriftligt informerat samtycke att delta.
1. lösningar
- Förbereda modifierade Krebs fysiologisk koksaltlösning lösning (PSS) med följande sammansättning: 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 7,8 mM glukos, 10,9 mM HEPES och 2,0 mM CaCl2.
Obs: Volymen som ska göras bestäms beroende på antalet vävnad bad i drift, flödet av systemet (1 mL/min), och beräknad längd av experiment inklusive Jämviktstiden och blekt tid. - Justera pH till 7,4 med 4 M NaOH.
2. vävnad bad ställa in
- Förvärma vävnad bad system behållaren ~ 45 ° C med ett recirkulerande vattenbad vid 55-60 ° C.
Obs: Vatten reservoaren i basen av apparaten värms till ~ 45 ° C, som efter möjliggör värmeväxling med PSS i peristaltiska slangen kör igenom, säkerställer PSS i vävnad badet finns vid 37 ° C. Vissa justeringar av ställa in temperaturer kan behövas för att säkerställa temperaturen av PSS i vävnad badet når 37 ° C. Detta kommer att variera beroende på apparaten används och ange flöden. - Växla manuellt på någon annan nödvändig utrustning inklusive förstärkare, datainsamling och inspelningssystem och sugpumpar.
- Placera varje peristaltiska feeder röret (en tub per bad) runt rullarna Peristaltisk pump huvudets. Säkra med behållande stoppen och genom skärpning komprimering kammar och låsa tangenterna runt rören. Placera de lediga ändarna av de peristaltiska feeder rören i en 1 L behållare med PSS och starta pumpen för att tillåta PSS att ständigt BEGJUTA i vävnad badet.
- Säkerställa sugpumpar fungerar korrekt och att nivån på lösning i badet är konstant så att flödet in i badet är lika med andelen borttagning. PSS-nivån i vävnad badet kan justeras genom att manipulera djupet av insugningsröret i badet med Modellerarens lera.
- Kalibrera kraftgivare genom att placera en känd vikt (motsvarande 1 millinewton (mN, enheten för kraft)) i givaren kroken och inspelning deformationen upptäcktes av programvaran förvärvet.
Obs: Värdena kan justeras i programvaran så att värdena registreras konverteras automatiskt till mN förneka behovet av att utföra några ytterligare konverteringar under analysen. Kalibrering av kraftgivare måste utföras innan vävnad montering.
3. vävnad förberedelse och dissektion av remsor
- Samla biopsier av gravida mänskliga myometriet (1 – 2 cm3) på CS efter leverans av barnet och moderkakan. Erhålla (typisk) full tjocklek biopsier där både Hyster (yttre slemhinnor skikt av livmodern) och decidua (innersta lagret av livmodern) är närvarande. Använd endast myometrium vävnad (central muskel lager). Se figur 1A-B.
- Ta bort (väsentliga) decidua och eventuella vidhäftande fostrets membran (i förekommande fall) som dessa vävnader är kända för att producera ämnen som kan förändra myometrium kontraktilitet.
Obs: I kirurgi, prover är placerat i Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) eller färska PSS och lagras vid 4 ° C. Idealiskt bör vävnader användas inom 12-16 timmar efter kirurgi, men studier har visat ingen nackdel att kontraktilitet efter 18 h av samling med lagring på 4 ° C51. Lämpliga kontroller måste utföras för att bekräfta vävnad livskraft och funktion efter långvarig lagring vid 4 ° C. De här är prover från den övre kanten av webbplatsen snitt lägre livmoder segment och inte från det övre segmentet. Är lägre och övre delar av livmodern har visat att kontrakt likaså48, därav anses lägre segmentet biopsier vara en bra återspegling av övre segmentet myometrium aktivitet.
- Ta bort (väsentliga) decidua och eventuella vidhäftande fostrets membran (i förekommande fall) som dessa vävnader är kända för att producera ämnen som kan förändra myometrium kontraktilitet.
- Förbereda dissektion område och nödvändiga instrument inklusive: stor dissektion sax, liten Vännäs dissekera sax, två dissekera pincett, dissektion pins och aluminium vävnad klipp, runt en dissektion Mikroskop med både fasta och zoom förstoringen.
- Plats biopsi provet på en tydlig silastic-baserade dissektion maträtt (se Tabell för material) fylld med PSS och noggrant orientera biopsi så att bildernas serosa och decidua identifieras figur 1B.
- Använd stift för att säkra biopsi på basen av skålen. Säkerställa vävnaden förblir återfuktad med PSS genom dissektion processen.
- Slå på mikroskopet ljuskällan och inspektera vävnaden under lupp med 10 x förstoring att identifiera regioner i myometriet fri från ärrvävnad, serosa, decidua och eventuella vidhäftande fostrets membran om nuvarande manuellt.
- Utför trubbig dissektion med stora dissektion sax för att separera två intilliggande vävnad skikt, avslöjar två plan eller ark av muskel.
Obs: Det är ofta lättare att hitta en liten ficka mellan vävnaderna att börja separation men försiktighet måste iakttas för att undvika små fartyg vid biopsi kanten som de kan misstas för 'fickor'. - Plats dissekera stiften på varje hörn av vävnad för att säkra den. Inspektera ark av muskel letar regioner av muskeln med fibrer löper parallellt.
Obs: Regionen identifiering kan vara hjälpt av efter riktningen av små kapillärer startas genom vävnaden. Mild dra vid vävnad kanten kan också hjälpa till att identifiera den riktning som fibrerna reser. - Skär bort remsor av vävnad ~ 2 mm brett x 8 mm lång x 1 mm tjock längs den längsgående axeln i linje med riktningen av muskelfibrer med små dissektion sax.
Obs: Måste vara försiktig att endast hålla vävnad av den inledande skuren kanten för att undvika skador. - Upprepa processen att dissekera ut antalet nödvändiga remsor för experimentet.
- Fäst varje remsa i båda ändar att räta och säkra till skålen, ta hand inte sträcka vävnaden.
- Fäst aluminium vävnad klipp i varje ände så att vävnaden mellan dem är ~ 5 mm långa och försiktigt skära bort någon överflödig vävnad (figur 1 c).
- Överför till en ren skål fylld med PSS redo för montering.
4. montering vävnader i Bad
- Överföra remsorna till experimentella vävnad bad. Montera remsor horisontellt i stället för lodrätt (som i traditionell orgel bad) (figur 2B).
- Fäst ena änden av varje remsa av klippet kraft givaren, som mäter vävnad sammandragning, och den andra till en fast krok båda inom vävnad kammaren.
Obs: Kapaciteten av vävnad badet är ~ 1 mL som är tillräckligt stor för att säkerställa remsorna är helt nedsänkt i badet. - Säkerställa remsorna är vid basen av varje krok i badet.
- Öppna programvaran inspelning genom att dubbelklicka på ikonen för programvaran.
- Justera inspelningen för varje kanal så att det är i vyn i fönstret kanal.
- Justera Y Axelskala att läsa mellan 0-10 V (motsvarar 0-10 mN post kalibrering) genom att högerklicka på Y-axeln, välja 'fjäll', och inmatning minsta och högsta värden 0 och 10, respektive. Välj 'OK'. Upprepa för varje kanal inspelning.
- Tryck på 'record' i programvaran live inspelningen ska börja.
Obs: Om remsor inte säkras till basen på varje krok, kunde de glida under kontraktion som visas som ett 'snäpp' på inspelningen. Ställ in spänningen ändras och därför sammandragningar efter slirning kan variera. - Sträcka vävnaden i varje bad genom att manuellt stänga de micromanipulators som bifogas varje givare. Följ den uppåtgående vävnad rörelsen från baseline på skärmen och fortsätter att vända micromanipulators tills baslinjen spänningen når 0,2 g (~ 2 mN).
Obs: Vävnaden börjar omedelbart att slappna av (anges av en nedgång i baslinjen spänning), vanligtvis når en konstant spänning på mellan 0,5 – 1 mN. Denna definierade spänning har optimerats för vävnad remsor av denna storlek i vår experimentella förhållanden. Om andra medelstora vävnader skall användas, är det viktigt att lämpliga längd-spänning relation undersökningar utförs för att optimera den vilande kraften tillämpas. - Tillåta vävnader temperera för ~ 2 h tills spontana sammandragningar uppstår.
Obs: en liten förhöjning i baslinjen spänning vanligtvis observeras och är en bra indikation på vävnad lönsamhet och att det blir kontraktila.
5. utmanande vävnaden med 40 mM kalium (hög K+)
- Om inga spontana sammandragningar uppstår efter 2 h montering, utmana remsorna med en hög kalium salt lösning där kalium är förhöjd till 40 mM av isosmotic substitution av NaCl till KCl. För hög K+, Lägg till följande (i mM): 119,6 NaCl, 40 KCl, 1,2 MgSO4, 7,8 glukos, 10,9 HEPES och 2.0 CaCl2.
Obs: I glatt muskulatur såsom myometriet, tillämpningen av hög K+ orsakar sammandragning av indirekt ingående spänning drivs kalciumkanaler leder till maximal tillströmning av Ca2 + i vävnadsceller. Hög K+ kan därför användas som en åtgärd för att testa allmänna index för vävnad integritet samt att uppnå ett mått av maximal vävnad svar.- Placera arkmataren röret för bad innehållande remsan för att utmanas i laboratoriet glasflaska innehållande hög K+ för 1-2 min.
- Återgå feeder röret till behållaren på PSS.
- Där ett svar till hög K+ uppnås, fortsätta att övervaka remsan för en ytterligare 1 h. Om inget kontraktila svar till hög K+ eller ingen spontan aktivitet framkallade bokför högt K+ svar, kassera remsan.
Obs: Försöksledaren måste också vara medveten om dödvolymen (tidsåtgången för lösning att nå vävnad badet) i mataren slangen innan bedömning av svaret på hög K+. Detta kan ta 2-3 min och beror på flödeshastigheten. - För att säkerställa fullständig wash-out av hög K+ från bad och feeder rören, som kan påverka efterföljande manövrar, vänta tills spontana sammandragningar tillbaka till pre hög K+ amplitud innan du fortsätter vidare med experimentet.
6. testa effekterna av kända och nya föreningar på myometrium kontraktion
Obs: Experiment för att testa effekten av nya läkemedel och reagenser på myometrium funktion kan utföras på spontan (figur 3A) eller agonist-stimulerad sammandragningar (figur 3B-C). För agonist stimuleras värkarna, OT eller arginin vasopressin (VP) läggs till PSS att ge en koncentration av 0,5 nM och används under hela experimentet (figur 3B-C). Koncentrationen av OT har optimerats för denna analys eftersom det ger sammandragningar som är phasic i naturen40,52. Koncentrationer av agonister större än detta kan leda till långvarig, ihållande (tonic) sammandragningar (se Ref41,44 för exempel) under vilken effekten av olika agenter är svårt att bedöma och experimentella tidsramen behöver utvidgas kraftigt för att rymma ökade varaktighet enskilda sammandragningar och minskning i frekvens. I detta exempel experiment, OT eller VP läggs till stimulera sammandragningar så att antagonism genom kända OTR och V1aR antagonister, atosiban och SR49059 eller genom vår nya förening [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT), kan bedömas.
- Förbereda koncentrationer av de test andra i PSS (med eller utan 0,5 nM OT/VP) utspätt till minst 1/1000 utspädning, säkerställa ett brett utbud av koncentrationer ingår till exempel de som inte framkalla en reaktion för koncentrationer som överskrider maximalt svar.
- Förbereda en motsvarande uppsättning utspädningar som innebär lika stora volymer av fordon (t.ex., dimetyl sulfoxid, acetonitril eller destillerat vatten).
Obs: Det är ofta enklast att förbereda den högsta koncentrationen, dvs10-6 M (från ett lager av 10-3 M) och sedan utföra seriespädningar längs en logaritmisk skala (t.ex., 10-6–10-10 M). Volymen ska förberedas beror vid tidpunkten för ansökan, flöde av apparater, och antalet remsor som skall undersökas, t.ex., om en 25 min tillämpning av reagens och ett flöde på 1 mL/min är minst 25 mL av varje koncentration per vävnad bad requir Ed. - Gäller första koncentrationen av sammansatta vävnaden genom att placera feeder slangen för vävnad bad i laboratoriet glasflaska innehållande reagens på önskad koncentration.
Obs: Detta bör göras när en stadig baslinje på spontana eller OT/VP-stimuleras värkarna uppnås. - Tillämpa motsvarande fordon kontrollösningen på samma sätt till ett andra bad.
- Registrera tiden för ansökan (dvs.när mataren slangen har ändrats).
- Upprepa processen för varje koncentration genom att sekventiellt placera feeder slangen i laboratoriet glasflaska innehållande nästa koncentrationen i serien och upprepa tills alla koncentrationer har tillämpats.
Tillämpningen av varje koncentration kan vara mellan 15 och 30 min men bör konsekvent för varje koncentration som tillämpas och mellan experiment. De som rör OT eller VP-stimulerad sammandragningar tenderar att kräva de ansökan längre (t.ex., 25 min) att minskningen i kontraktion frekvensen som observerats under stimulering. Preliminära försök att bestämma optimal appliceringstid bör utföras i förväg med någon ny reagens som testas. - Återgå feeder röret till PSS (med eller utan OT/VP) till blekt.
- Klicka på 'stopp' avsluta live inspelningen. Omedelbart spara data till en lämplig mapp och exportera en version som en '.mat' fil.
7. dataanalys
Obs: Datafångst och analys kan utföras med valfritt antal kommersiellt tillgängliga data förvärv programvarupaket. Se Tabell för material för detaljer om programvara som används i detta protokoll. För en korrekt bedömning av kontraktila aktivitet, inbegriper parametrarna av sammandragningar som ska mätas: i) amplitud av kontraktion, ii) frekvensen av kontraktion, iii) varaktigheten av sammandragning, och iv) medelkraft integral (figur 4). Medelkraft integrerad motsvarar att arean under kurvan kontraktion och är därför ett index för det totala arbete som vävnad remsan i en viss tid. Vissa eller alla parametrar kan analyseras. Som ett minimum rekommenderas att integrerad medelkraft och amplituden av kontraktion är analyserade53. I de experiment som beskrivs här mätte vi ändringar i amplitud av kontraktion och area under kurvan.
- Importera the.mat till programvaran analys.
- Justera kolumnen motsvarar X-axeln till reflektera den experimentella tid, med hänsyn till intervallet samplingsfrekvensen. Experiment är vanligtvis inspelade på 10 Hz motsvarar 10 prover/s eller 600 prover/min.
- Plotta data som en X-Y samordna graf med ”rita | Line ”funktion.
- Noll baslinjen för kontraktion med funktionen 'översätta vertikala' i programvaran.
- Välj en lämplig kontrollperiod.
Obs: Detta är tidsperioden som närmast föregår tillämpningen av den första koncentrationen av regent men lika med längden på tillämpningen av reagens (figur 4A). Till exempel, om tillämpningen av drogen X är för 25 min, använda den 25 min före den första tillämpningen av drogen X som kontroll. - Läs av Y-axeln, spela in amplituden (kraft) av sammandragning på max toppen av varje sammandragning som förekommer inom den tidsram som valts och beräkna ett medelvärde.
- Mäta varaktigheten av sammandragning på 50% av denna högsta topp genom läsning av X-axeln i början och slutet av varje sammandragning och spela in ett medelvärde.
- Räkna antalet sammandragningar som förekommer i tidsramen att generera ett värde för frekvens.
- Använder funktionen 'integration' för att beräkna AUC (i godtyckliga enheter, a.u.) för tidsperioden som valts.
Obs: För att spela in AUC korrekt, är det viktigt att baslinjen för sammandragningar är inställd på noll på Y-axeln. - Sekventiellt flytta genom varje koncentrationerna och spela in de olika parametrarna av kontraktion.
- Ange kontrolldata som 100% och uttrycka de värden som erhålls under varje koncentration av reagens som en procentandel av detta styra dvs, värden för stimulering bör vara > 100% samtidigt avkoppling bör vara < 100%.
Obs: Normalisera data på detta sätt bör tillåta användaren att jämföra resultaten mellan strips och farmakologiska behandlingar. - Upprepa för varje experiment och överföra data till ett grafiskt paket.
Representative Results
Använda denna modell, kan att bemöta olika agonister och antagonister av kontraktion liksom romanen agenter av känd eller okänd funktion undersökas och kvantifieras. Standard farmakologiska parametrar såsom EG50 och IC50 värden kan beräknas när reagens används i en rad olika koncentrationer, t.ex., 10-5– 10-9 M och lagt i ökande koncentrationer längs en logaritmisk skala.
Oxytocin receptorantagonist koncentration-respons experiment
I detta experiment, var ihopkopplade remsor av mänskliga myometriet skär som beskrivs ovan och visas i figur 1, monterade i vävnad bad som avbildas i figur 2, och tillåtna temperera för att producera stabila sammandragningar av lika amplitud och frekvens. Remsorna utsattes sedan för den endogena OTR agonist, OT (0,5 nM) att stimulera sammandragningar. Efter en period av stabil aktivitet under OT (vanligtvis 45 min) tillämpades atosiban på en remsa i ökande koncentrationer längs en logaritmisk skala (10-9– 10-6 M). Den andra remsan var ensam i OT som tid-kontroll. Ett exempel på att bemöta atosiban kan ses i figur 5A. Tar de sammandragningar som omedelbart föregick den första koncentrationen av atosiban som kontroll (100%), beräknades amplituden och AUC för varje koncentration som tillämpas som visas i figur 4. För time-kontroll experiment mättes tid-motsvarande experimentella manövrar. Data var sedan ritade och kurvor försedd med funktionen icke-linjär regression i ett grafiskt program (figur 5B-C). När det gäller beräkning av hämmande effekt, beräknades den relativa styrkan av atosiban genom att mäta den IC50 som är koncentrationen orsakar halv maximal (50%) hämmande svar. Samma kan göras för agonister eller stimulatorer av kontraktion. I detta fall beräknas styrkan av föreningen från EG50 (koncentrationen orsakar hälften maximalt stimulerande svar).
Utredning av nya föreningar och testa sin Receptor selektivitet
Vi använde denna fysiologiskt relevanta modell av ex vivo mänskliga myometrium sammandragningar för att undersöka antagonistiska effekter av en nyligen syntetiserade förening, [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) på sammandragningar stimuleras med antingen den infödda V1a R-agonist, VP eller den infödda OTR agonist, OT. Vi använde denna analys för att validera receptor selektivitet [D-Arg8] INT, som tidigare hade fastställts av farmakologiska cellbaserade metoder är en antagonist vid V1aR men den OTR54.
I detta experiment utsattes mänskliga myometrium remsor för 0,5 nM VP eller 0,5 nM OT för ca 1 h för att stimulera sammandragningar som visas i figur 3, innan du lägger till vår nya förening [D-Arg8] INT i ökande koncentrationer (figur 6A och figur 6 C). Detta jämfördes sedan med kommersiellt tillgängliga, känd V1aR antagonisten, SR49059 (figur 6B). Figur 6A illustrerar koncentration beroende minskar i VP-stimulerade humana myometrium sammandragningar med ökande koncentrationer av [D-Arg8] INT. Data för amplitud av kontraktion och AUC för varje koncentration sammanfattas i figur 6Aii-iii. Effekten är liknande den som visas för ökande koncentrationer av kända V1aR-hämmaren, SR49059, visas i figur 6Bi-iii. Selektivitet [D-Arg8] INT mot V1aR men inte mot OTR framgår av det faktum att [D-Arg8] INT gör inte minska människors myometrium sammandragningar som har stimulerats med OT (figur 6 c) som amplitud och AUC förblev stabil (figur 6Cii-iii).
Figur 1: mänskliga myometrium biopsi dissektion. (A) A diagram över mänskliga livmodern visar de tre vävnad lager som utgör livmoderväggen. Det innersta lagret är livmoderslemhinnan (decidua i graviditet, röd pil), det mellersta skiktet är myometriet (muskulösa lagret, svart pil) som genererar sammandragningar och det yttersta lagret är Hyster (eller serös membran, blå pil) som utgör en skyddande skikt runt livmodern. Regionen av intresse för biopsi provtagning avbildas av den svarta rektangeln. Ett exempel biopsi från en gravid kvinna som tas under kejsarsnitt visas i (B) med decidua och myometrium lager markerade (buk-och brösthinnan inte synliga). Det är viktigt att de olika vävnaderna identifieras så att remsor av myometriet är korrekt dissekeras för experiment. Ett exempel remsa av myometriet som har dissekeras och klippt visas i (C). Vanligtvis 2 – 6 remsor kapas och klippt som visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: flera organ bad experimentell uppsättning upp används för att mäta sammandragningar av mänskliga myometriet. (A) remsor av myometriet placeras i små (1 mL) orgel bad chambers som placeras ovanpå en uppvärmd reservoar (jag) och är superfused med fysiologisk koksaltlösning lösning (PSS) genom en Peristaltisk pump (ii). Behållaren hålls på en inställd temperatur genom ett cirkulerande vattenbad (iii). Varje remsa är kopplad till en kraftgivare (iv), som registrerar ändringarna i spänning under kontraktion. Detta är förstärkt av en transbridge förstärkare (v) och omvandlas till en digital signal (vi), som är inspelad på ett datorsystem (vii) kör programvaran associerade förvärv. (B) förstorad bild av en orgel bad kammare med en remsa av mänskliga myometriet i situ (röd pil), badar i PSS med ena änden fästs en kraftgivare och den andra till en fast krok. ()C) Schematisk översikt över Ställ. Vävnaden kammare fylld med PSS är ständigt perfusion med värmde PSS vid 37 ° C som är via värmeväxling med en uppvärmd vattenreservoar under badet (som hålls på 45 ° C) och en cirkulerande vattenpump vid 55 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: spontan och agonist-stimulerad sammandragningar av mänskliga myometriet in vitro-. Agonist-fria förhållanden, spontana sammandragningar förblir stabila för över 3 h inspelning utan betydande förlust av amplitud eller område-under-the-kurvan (AUC) (Aii, Aiii), visar robustheten av denna modell för att utreda den tillämpning av olika agenter på spontan kontraktion. Efter att upprätta stabila, spontana sammandragningar, lades 0,5 nM oxytocin (B, OT) eller vasopressin (C, VP) till fysiologisk koksaltlösning lösningen (PSS). Sammandragningar under stimulering också förbli stabila under ett antal timmar utan betydande förlust av sammandragning amplitud (Bii, Cii) eller AUC (Biii, Ciii) Aktivera effekten av olika kontraktila mäklare till undersökt i närvaro av myometrium agonister. Data presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Obs, för agonist-stimulerad sammandragningar (B, C), tas kontrollperioden (100%) efter de första 45 min av tillämpningen av agonist, när värkarna har stabiliserats. I alla fall var remsor superfused med PSS vid 37 ° C, pH 7,4 (Reproducerad från Arrowsmith o.a. 40 med tillstånd från Reproduktiv vetenskaper och Di Giglio o.a. 54 med tillstånd från Vetenskapliga rapporter under licensen Creative gemensamma Open Access). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: dataanalys. (A) En lämplig kontrollperiod visas i rött bestämdes genom att välja sammandragningar som närmast föregår tillämpningen av den test föreningen (Drug X). Denna kontrollperiod är också lika i tid för tillämpningen av drogen X (t.ex., 40 min i detta exempel). När uppmätta värden för kontrollperioden anges som 100%. Alla efterföljande mätningar är sedan uttryckt som en procentandel av kontroll. (B) det finns 4 olika parametrar av kontraktion som kan mätas: a amplituden av kontraktion som mäter kontraktion styrka (kraft, mN), (ii) frekvens av kontraktion som mäter graden av kontraktion, (iii) varaktigheten av kontraktion som mäts vid halv maximal topp kontraktion och (iv) area under kurvan (även känd som kraft integral, godtyckliga enheter) som ger ett mått på totala arbete. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: inspelning atosiban antagonistisk effekt på oxytocin-inducerade sammandragningar i mänskliga myometriet. När spontana sammandragningar var etablerade, stimuleras sammandragningar med den oxytocin-receptoragonist, oxytocin (OT). Värkarna var tillåtna att stabilisera under stimulering för en ytterligare 45 min. (A) The V1a och OT-receptorantagonist, atosiban tillämpades sedan ökande koncentrationer längs en logaritmisk skala (10-9-10-5M). Sammandragningar under perioden som föregick den första koncentrationen av atosiban mättes och tas som kontroll (100%). Aktiviteten under varje efterföljande koncentration var mätt och uttryckt som en procentandel av kontroll. Samma utfördes för stålband utsätts för OT ensam använder tid-motsvarande experimentella manövrar. Data var ritade i grafisk programvara: (B, C) Visa koncentration-respons kurvor för den antagonistiska effekten av atosiban (blå) och lämplig utspädning av fordonet (grå, tidskontroll) på OT-inducerad myometrium kontraktion amplitud och arean under kurvan (AUC), respektive. Data presenteras som medelvärde ± standardfel medelvärde (SEM) andelen amplitud och AUC för kontroll aktivitet (före tillämpningen av atosiban). IC50 -värdena beräknades sedan som ger den koncentration vid vilken hälften maximal hämmande (50%) svar för amplituden av kontraktion och kraft integral (AUC) är uppnådda (Reproducerad från Arrowsmith o.a. 40 med tillstånd från Reproduktiv vetenskaper). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: testa en roman som är sammansatta på mänskliga myometrium kontraktion effekt och receptor selektivitet. Efter spontana sammandragningar av mänskliga myometriet var etablerade, stimuleras sammandragningar med antingen den vasopressin-receptoragonist, vasopressin (VP) (Ai, Bi) eller den oxytocin-receptoragonist, oxytocin (OT) (Ci). Effekten av [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) och kommersiellt tillgängliga V1aR antagonisten, SR49059 på sammandragningar stimuleras av VP bedömdes genom att tillämpa ökande koncentrationer av föreningar. Typiska Svaren visas i (Ai, Bi). Tillhörande analyserade data för amplitud och area under kurvan (AUC) visas i (ii) och (iii), respektive där effekten har uttryckt som procentandel av kontroll aktivitet (100%). [D-Arg8] INT såväl kända V1aR antagonisten, SR49059 orsakade en dos beroende sänkning amplitud och AUC, stödja [D-Arg8] INT roll som en V1aR receptorantagonist i mänskliga myometriet. Däremot [D-Arg8] INT påverkade inte sammandragningar stimuleras av OT (Ci-iii), därav likaså till våra fynd från cellbaserade analyser, [D-Arg8] INT visar också selektivitet mot V1aR i mänskliga myometriet (uppgifter som återges från Di Giglio o.a. 54 med tillstånd från Vetenskapliga rapporter under licensen Creative gemensamma Open Access). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Medan de flesta läkemedelsutveckling är avsett för behandling av mänskliga sjukdomar, sker mest grundläggande forskning främst i djurvävnader. Här, beskriver vi metoder för att undersöka ex vivo sammandragningar av mänskliga myometriet erhållits från kirurgi som kan användas för att ta itu med ett antal viktiga frågor relaterade till livmoderns fysiologi och patologi, samt för att validera funktionella Svaren till kända och nya farmakologiska agenter till stöd läkemedelsutveckling. I synnerhet belysa vi användningen av denna analys att undersöka antagonistiska svaret av en känd OTR och V1aR kompetitiv antagonist, atosiban på OT-inducerad gravid myometrium sammandragningar, samt att fastställa svar och receptor selektivitet av en nyutvecklad selektiv V1aR antagonist, [D-Arg8] INT. Vi visar att viktiga farmakokinetiska parametrar såsom EG50 och IC50 kan beräknas, vilket överensstämmer väl med cell-baserad farmakologi data.
Använda flera remsor samtidigt möjliggör direkt jämförelse av flera agent effekter, konkurrens experiment med antagonister och lämplig tid och fordonet kontroller. Remsor är ofta beredda i grupper om 2, 4 eller 8, ger denna teknik måttlig genomströmning, möjliggör testning av 2 – 4 föreningar vid 6 – 8 (kumulativa) koncentrationer (per biopsi). Denna metod ger också data i realtid så att effekterna kan bedömas snabbt och protokoll kan justeras. Dessutom, denna teknik kan användas för att testa någon förening av intresse och har använts framgångsrikt av ett antal forskargrupper fokuserade på myometrium fysiologi och i läkemedelsutveckling. Förutom att analysera rena föreningar som beskrivs i denna uppsats, livmoderns kontraktilitet modellen har också och kan användas framgångsrikt för att skärmen för romanen uterotona föreningar från blandningar, såsom naturläkemedel från traditionell medicin7 , 55 , 56.
Även denna modell är tekniskt robust och visar bra reproducerbarhet, det har vissa begränsningar: dissektion kan vara svårt för dem obekanta med vävnaden eller använder dissektion utrustning, därav nya användare kommer att kräva tid att optimera vävnad förberedelser och protokoll. Det bör också noteras att mänskliga myometriet skiljer sig avsevärt i utseende till andra modeller såsom råtta och mus. De flesta gnagare livmödrar består av två tub-liknande livmoderns horn, var komplett med en äggstock i ena änden och gick på livmoderhalsen. Varje horn har klart definierade längsgående och cirkulära muskellager, som lätt kan avskiljas vid dissektion medan de olika fiber typerna i mänskliga myometriet är ofta sammanflätade bildar en ”mesh”. Dessutom är kontraktion profiler av mänskliga myometriet mycket olika till gnagare. Mest noterbart är är sammandragningar i mänskliga myometriet färre men längre varaktighet. Experimentell tidsramar för att arbeta med människors myometriet är därför ofta mycket längre än gnagare modeller. Skillnader i receptoruttryck mellan arter kan också bidra till ganska markanta skillnader i Svaren till agonister och detta bör erinras om extrapolera resultat mellan arter.
Det finns också antal steg som måste beaktas att maximera utdata från detta system. Kritiska steg omfattar bevarande av vävnad livskraft såsom ta hand vid hantering av vävnader för att undvika onödig skada under dissektion eller vid montering. En skicklig ögat krävs att dissekera fina strimlor av livmoderns muskler, garanterar orienteringen av muskelfibrer i den longitudinal riktningen och efter planet av vävnad, samt undvika ärrvävnad, decidua och små fartyg. För att underlätta orientering ändamål när preparatet är i laboratoriet, är det möjligt att lägga till en etikett (till exempel små kirurgiska stitch) vid tidpunkten för insamling till ena sidan av biopsin att avgränsa serös kanten från decidual kant.
Vävnader bör hållas vid en stadig 36 – 37 ° C under experiment som vävnad funktion är föremål för temperaturförändringar. Detta kan uppnås med en robust luftkonditionering enhet inom laboratoriet. Konstant genomblödning av värmde PSS säkerställer temperaturen bibehålls samt genomspolning av restprodukter från kontraktion. Temperaturen inom orgel badet kan ändras genom att ändra flödet eller justera vattentemperaturen bad direkt. Små badkar storlek jämfört med traditionella 5-50 mL bad säkerställer en relativt snabb omsättning av PSS och blekt av reagenser. Miniatyriserade orgel badet minskar som beskrivs här, också mängden PSS och reagenser av intresse behövs, vilket minimerar kostnaderna och skona värdefulla, nyutvecklade kemikalier. Dessutom, på grund av små badkar storlek och använder en HEPES-baserad buffert, kräver detta system inte syresättningen t.ex., av bubblande PSS med carbogen. Standardisering av spänning appliceras till remsorna är också viktigt. För remsor av denna storlek (5 x 2 x 1 mm), bör detta vara cirka 2 mN (motsvarar ~0.2 g). Alternativa metoder inkluderar tillämpningen av en hög kalium lösning att framkalla maximal kontraktion och stretching till hälften av detta maximal kontraktion. Det måste dock noteras, att spänning appliceras i vivo skilja.
Utmaningar inkluderar att få vävnader från försökspersoner, men även om beskattning, mänskliga vävnader tydligt representerar de mest fysiologiskt relevanta (och givande) modell för att studera livmoderns sammandragning i mänskliga sjukdomar och drug discovery. Den isolerade vävnad remsor dock inte nödvändigtvis likställer till vävnad i vivo som de är undantagna exempelvis av hormonella och nervös ingång som, även om inte nödvändigt för kontraktion, kommer att modulera sammandragningar i vivo. Denna analys men ger möjlighet att analysera myometrium sammandragningar på ett kontrollerat sätt, åtskilda från sådana influenser. Det tillåter också för effekten av faktorer såsom hormonella kontroll av kontraktion (t.ex., via VP, prostaglandiner, OT, etc.) för att undersökas, som ger ledtrådar till regleringen av myometrium funktion. Som vävnader erhålls från olika kvinnor, finns det naturligtvis viss variation i spontana kontraktila profiler mellan exemplar. Därför är det ofta nödvändigt att utföra experiment på ett stort antal (~ n = 10) av prover att minimera variationen i vissa datamängder53. Detta är viktigast när man jämför kontraktila aktivitet mellan olika patientgrupper. Normalisera agonister och antagonister att styra aktiviteten svar (dvs.att uttrycka som en procentandel av kontroll aktivitet eller hög K+) minskar vissa av denna variation. För att minska mellan strip variationen kan dessutom data normaliseras för att band cross sectional område genom att mäta deras längd och vikt post experimenterande41. Detta är särskilt användbart när du jämför kontraktion mönster mellan olika patientgrupper.
Begränsningar av denna teknik har även tillgång till färska vävnader som kräver goda arbetsrelationer med sjukhuspersonal, särskilt teater personalen och de inblandade i processen samtycke. Etiska behörigheter från den lokala forskningsetisk kommitté och institutet eller sjukhus Granskningsnämnden måste också vara på plats. Samling av mänskliga myometriet sannolikt utförs under CS leverans, när givaren genomgår kirurgi. Biopsin tas från samma livmoder snitt plats gjord för att leverera barnet och patienten behöver därför inte genomgå någon ytterligare förfaranden. Teater personalen och kirurgen utför biopsi behöver göras medvetna om senare användning av vävnader och att de inte ska placeras i fixativ lösningar sådant som för skicka till en patologiavdelningen. Länge experimentell tidsramen är en annan faktor. Experiment med mänskliga vävnader ta många timmar (normalt > 6 h) (i motsats till 2 – 3 h för ett liknande experiment i råtta eller mus livmoder), på grund av långsammare frekvensen av sammandragning och den 2 – 3 h fördröjning mellan vävnad montering och inrättandet av spontana sammandragningar. Men som vi har visat, mänsklig vävnad sammandragningar är robust, och när etablerade kan kontraktet för många timmar utan betydande trötthet40.
Detta system tillåter också andra utmaningar i vivo arbete att övervinna inklusive möjligheten att testa farmaceutiska reagens på gravid vävnad. Denna teknik kan lätt extrapoleras till andra arter, inklusive mus whereby första resultaten kan bekräftas innan du fortsätter ytterligare i hela djurstudier. Kontrollerad förändringar i temperatur, sammansättning av superfusate (PSS) och pH kan göras lätt att härma olika scenarier i vivo och analysera effekten av dessa förändringar på sammansatta beteende. De grundläggande principerna för mäta isometrisk spänning i myometrium remsor kan också utökas till mäta samtidiga ändringar i intracellulära kalciumkoncentration eller pH med hjälp av fluorescerande Ca eller pH (H+) indikatorer och utrustning för att upptäcka och spela in fluorescens57,58,59,60.
Sammantaget mänskliga myometriet representerar en robust och fysiologiskt relevant modell att karakterisera och validera nya terapeutiska föreningar i läkemedelsutveckling — både rena föreningar och blandningar. Vi har exempel på dess användning i läkemedelsutveckling med avseende på det OT/VP-systemet och fokuserade på OTR och V1enR antagonister att visa hur denna modell kan användas för att bestämma sammansatta effekt och styrka på definierade mål och validera ligand selektivitet. Dock bör påpekas att denna teknik kan användas för att studera alla mål av intresse eller väg som leder till myometrium kontraktion (eller avkoppling), samt till stöd drog upptäckten av nya mål och vägar, och avancera vår förståelse av myometrium fysiologi och patofysiologi.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning har stötts av den österrikiska Science fond (FWF) genom projektet I3243 och den Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horisont 2020 för forskning och innovation (bidragsöverenskommelse nr 714366). CWG har understötts av en australiensisk forskning Council (ARC) framtid Fellowship (FT140100730) och MM ett ARC Discovery tidiga karriär forskare (DECRA)-stipendium (DE150100784). SA stöds av Harris-välbefinnande prematura födseln centrala forskningsbidrag administreras av välbefinnande för kvinnor, UK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
| Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
| GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
| LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
| Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
| BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
| Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
| Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
| Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
| Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
| Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
| Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
| Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
| Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
| Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
| Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
| Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
| Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
| Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
| Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
| Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
| Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
| HBSS | SIGMA | H9269 | |
| Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
| Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
| [Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
- Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
- Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
- Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
- Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
- Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
- Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
- Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
- Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
- Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
- Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
- Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
- Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
- Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
- Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
- Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
- Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
- Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
- Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
- Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
- Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
- McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
- Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
- Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
- Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
- Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
- Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
- Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
- Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
- Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
- Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
- Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
- Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
- Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
- Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
- Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
- Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
- Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
- Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
- Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age? J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
- Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
- Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
- Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
- Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
- Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
- Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
- Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
- Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
- Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
- Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
- Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
- Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
- Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
- Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
- Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
- Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
- Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).
