Summary
Asidik tümör microenvironment tümör ilerlemesinde önemli rol oynar. Kanser hücreleri in vitro olarak asidik ekstrasellüler pH etkilerini değerlendirmek için basit asidik kültür sistemleri kuruldu.
Abstract
Hipoksi veya besin açlık gibi tümör microenvironment şartları kanser ilerlemesi ve malignite kritik rol oynarlar. Ancak, asidik ekstrasellüler pH tümör saldırganlık ve onun altında yatan mekanizma rol kapsamlı hipoksik veya besin açlık koşulları ile karşılaştırıldığında araştırılmamıştır. Buna ek olarak, asidik ekstraselüler tümör microenvironment taklit etmek için iyi tanımlanmış kültür yöntemi tam olarak bildirilmemiştir.
Burada asidik ekstrasellüler pH kullanarak bikarbonat ve artan laktat veya HCl konsantrasyonu kültür orta azaltılmış korumak için basit vitro kültür yöntemi mevcut. Orta pH en az 24 saat sürekli ve yavaş yavaş 72 kültür PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücrelerinin takip h tarafından azalmıştır. Bu çalışmada üç ayrı asidik ortam koşullarında son derece hipoksi ya da besin açlık. MSMO1, INSIG1ve IDI1 gibi upregulated pH-yanıt veren genler göre Bu genlerin upregulation asidik pH bir işareti olarak kullanılabilir. Bu basit teknikler asidik tümör microenvironment altında tümör malignite temel mekanizmaları aydınlatmak yararlıdır. Bu nedenle, hücre dışı asidik pH kültür sistemimiz hücresel asidik pH yanıt sadece kanser hücrelerinin zamanda kadar asidik diğer bozukluklar da dahil olmak üzere, Diyabetik ketoasidoz ile ilgili olarak renal tübüler hücreler gibi Primer hücre keşfi sağlar, Laktik asidoz, renal tübüler asidoz ve solunum asidozu.
Introduction
Tümör microenvironment tümör ilerleme ve kanser hücre metabolizması1,2,3kritik rol oynar. Kanser hücreleri genellikle hipoksi, besin yoksunluğu ve asidik ekstrasellüler pH (pHe) gibi koşullara maruz kalır. Ancak, tümör ilerleme pHe rolü gibi kapsamlı açıklık olmuştur değil hipoksi veya besin açlık olduğu gibi. Tümör dokusunda pHe yaklaşık pH 6.84,5ulaşan asidik hale gelebilir. Asidik pH aerobik ve anaerobik glycolytic atılımı proton (H+) doğar ve laktat Proliferasyona kanser tarafından5,6hücreler.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya o asidik pHe kaynaklı Histon deasetilasyonu, yağ asidi oksidasyon ve ağır asidik ortamı7,8,9,10adaptasyon için asidik organellerin ekzositozu. Ancak, mekanizmalar aracılığıyla hangi hücre dışı asitleştirme kanser davranış ve düzenleyiciler asidik pH tümör microenvironment içinde tam olarak tespit anahtar kimliğini etkiler. Ayrıca, çeşitli raporlar bikarbonat, Tris, borular ve HEPES tampon veya laktat ve HCl belirsiz konsantrasyonları kullanarak çeşitli asidik pH medya açıklanan, ancak kararlılığını ayarlanan orta ne de kapsamlı göstermek için birkaç rapor vardır: birkaç farklı asidik kültür media7,8,9,10 karşılaştırılması
Anahtar düzenleyiciler ve kanser hücrelerinin hücre dışı asitleştirme bağlamında metabolik değişiklikler aydınlatmak için kurulan bir asidik pHe korumak için basit vitro kültür manken ve pHe kanser hücreleri11' deki rolü inceledi. Bu yöntemi kullanarak, biz tutulan 37 ° c altında %5 6,8 pHe ile asidik bir kültür orta düşük bikarbonat konsantrasyonu kültür ortamı kullanarak CO2. pH 7.4 normal olarak kullanılan ve orta kontrol. Orta pH en az 24 saat sürekli ve 72 h PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücre kültür sırasında yavaş yavaş azaldı. Gelişmiş Glikoliz sadece da laktat7,8,9proton atılımı hızlandırır çünkü aynı zamanda asidoz laktat kaynaklı yerine laktat ekleme azaltarak tarafından taklit eden bir kültür yöntemi kurdu bikarbonat konsantrasyonu. Ayrıca, HCl kaynaklı asidik pHe orta asidik pH kültür ortamına hücresel yanıt bikarbonat azaltılmış bir konsantrasyon nedeniyle değildir olasılığını dışlamak için bize izin verir. Ayrıca, 6.4-7,4 farklı bikarbonat konsantrasyonu ile pH ile çeşitli medya kullanarak, biz ölçüde hücresel yanıt pHe efektleri değerlendirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. asidik kültür orta hazırlanması
-
Denetim (pH 7,4) hazırlanması ve düşük-pH (pH 6.8) kültür orta
- 4.75 g L-glutamin olmadan DMEM tozu 500 mL su içinde çözülür.
- 0,33 M NaHCO3 çözüm basınç sıkı bir şişe hazırlayın.
Dikkat: NaHCO3 ısıtmalı ve termal olarak çürümüş CO2 gaz yayar bu yana bir basınç sıkı şişe kullanmak önemlidir. - Otoklav orta ve çözüm. Bu arabellekleri 25 ° C'ye soğutmak izin
- 200 mM L-glutamin, penisilin-streptomisin, 5 mL 5 mL ekleyin ve 50 mL fetal sığır serum DMEM 500 ml bikarbonat olmadan.
- Denetim (pH 7,4) orta için 0,33 M NaHCO3 çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 2,4 mL ekleyin. Düşük-pH (pH 6.8) orta için 0,33 M NaHCO3 çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 0.6 mL ekleyin.
- Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO2.
Not: NaHCO3 çözüm miktarı kuluçka ve hava basıncı CO2 içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH bağlı olarak ayarlanması gerekir. İdeal olarak, ilk kez, NaHCO3 çözüm için DMEM eklemek için uygun miktarını belirlemek için çeşitli bikarbonat konsantrasyonu ile orta pH ölçmek daha iyi.- Hemen CO2 kuluçka kültür çanak çıkardıktan sonra kültür orta toplamak ve pH metre kullanarak pH ölçmek. Orta sıcaklık bir su banyosu kullanarak 37 ° C'de tutun. Orta pH bağımsız olarak üç kez ölçmek.
Not: NaHCO3 çözüm 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve her ortamın taze hazırlanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan piyasada bulunan ürünler Malzemeler tabloiçinde listelenir.
- Hemen CO2 kuluçka kültür çanak çıkardıktan sonra kültür orta toplamak ve pH metre kullanarak pH ölçmek. Orta sıcaklık bir su banyosu kullanarak 37 ° C'de tutun. Orta pH bağımsız olarak üç kez ölçmek.
-
Laktat kaynaklı veya HCl kaynaklı asidik kültür ortamı hazırlama
- 74 µL laktat çözüm veya 1 M HCL 125 µL denetim orta (1.1.5 adımda hazırlanan) 100 mL ekleyin.
- Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO2.
Not: Laktat veya HCl bir çözüm de kuluçka ve hava basınç CO2 içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH göre ayarlanması gerekir. İdeal olarak, seri laktat veya HCl konsantrasyonu için ortamın pH istenen ayarlamak için uygun miktarını belirlemek ile orta pH ölçmek iyidir.
2. hasat ve hücreleri tedavi
- Altında %5 CO2 gerçekleştirmeden önce en az 1 hafta deneyler 37 ° C'de hücreler yetiştirilmesi başlatın.
Not: Bu çalışmada kullanılan hücre hatları Malzemeler tabloiçinde listelenir. - % 70-90 confluency ulaştığınızda geçiş hücreleri. Hücreleri Konfluent olmak izin vermez. Orta 2-3 günde günlük ekimi sırasında değiştirin.
- Hücreleri 5 mL PBS ekleyerek yıkayın. PBS Aspire edin ve 1 mL tripsin gibi ayırmayı enzim ekleyin.
- Hücreleri yuvarlanır ve ayırmak başlamak kadar 37 ° C'de kuluçkaya.
- 5 mL kültür orta de müstakil hücrelere ekleme ve enzim devre dışı bırakın. 15 mL tüp ve 300 x g. aspiratı süpernatant adlı 3 dk santrifüj hücre süspansiyon aktarmak ve kültür orta hücrelerle yeniden askıya alma.
- Bir hemasitometre ve Trypan-mavi kullanarak canlı hücreleri saymak.
- Tohum 5.0 x 105 hücreleri/iyi bir 10 cm tabak orta 10 ml. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO2.
- Kültür orta Aspire edin, 5 mL PBS hücrelerle yıkama ve 10 mL asidik kültür orta bölüm 1'de hazırlanan ekleyin. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO2.
3. RNA izolasyon
- Kültür orta Aspire edin ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. Hücrelerin RNA ayıklama reaktif ekleyerek bozabilir ( Malzemeleri tablolarıgörmek).
- Çanak kısaca kazımak, RNA ayıklama reaktif bir pipet ile kaldırın ve RNA ayıklama reaktif/hücre 1,5 mL tüp lysate mevduat. 5 min için oda sıcaklığında bırakın.
- 250 µL kloroform ekleyin ve 5 min için oda sıcaklığında yaklaşık 15 s. bırak ve ≥8, 000 x g 5 min için santrifüj tüpü şiddetle çalkalanır.
- Bir pipet kullanarak sulu faz dikkatli bir şekilde çıkarın. Sulu faz bırak. Başka bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.
- Sulu faz 550 µL isopropanol ekleyin ve karışımı yavaşça. 5 dakika santrifüj (≥20, 000 x g) maksimum hızda süreyle oda sıcaklığında 4 ° C'de 20 dk için bırakın
- İsopropanol dökün ve 1 mL % 75 etanol DEPC su tedavi ekleyin. Hafifçe karıştırın. 8000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Etanol ve granül kurumasına izin pipet.
- DEPC yaklaşık µL 15-25 (verim) bağlı olarak su RNA Pelet tedavi ekleyin. İyice karıştırın.
- 260 OD ölçerek izole RNA konsantrasyonu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.
4. cDNA sentezi
- PCR reaksiyon tüp içinde aşağıdaki parçaları birleştirmek: 5 µg toplam RNA, 1 µL Oligo dT (50 µM) veya astar karışımlarda (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP ve 14 µL toplam hacmiyle nükleaz ücretsiz su.
- Mix ve kısaca bir küçük benchtop santrifüj kullanarak bileşenlerini santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 65 ° C'de 5 min için örnek RNA/astar denatüre Kısaca spin (~ 5 s) küçük bir benchtop kullanarak santrifüj kapasitesi ve örnek derhal en az 1 dk. için buz koymak.
- Aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 4 µL 5 ters transkripsiyon arabellek x, 1 µL transkriptaz (200 U/µL), 1 µL RNase inhibitörü (40 U/µL).
Not: Piyasada kitleri örnekleri Malzemeler tablo gösterilir - Tüp, kap mix ve kısaca belirtilen içeriğini bir küçük benchtop santrifüj santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 10 dk 50-55 ° C kombine tepki karisimin kuluçkaya.
- Reaksiyon 10 dk 80 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
5. gerçek zamanlı PCR kullanarak asit duyarlı gen ekspresyonu ölçümü
- Aşağıdaki bileşenler, 384-iyi tepki plaka birleştirmek: 1 µL şablon cDNA, 0,75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X 0.3 µL 50 µM ileri astar, 0.3 µL 50 µM ters astar, 1 µL Taq polimeraz, 2.5 µL 10 x Taq polimeraz arabellek, 2.5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL su.
Not: Piyasada kitleri örneği Malzemeler tablogösterilmiştir. Astar listesi Tablo 1' de gösterilen. 96-iyi tepki plaka da bu adımda kullanılabilir. Diğer probları (örneğin, Taqman sonda) de kullanılabilir. - Deneme ve gerçek zamanlı PCR sistemi aşağıdaki PCR programa ayarlayın: 50 ° C için 2 dk, 1 döngüsü; 10 dk, 1 döngüsü için 95 ° C; 95 ° C 15 s ve 60 ° C için 1 dakika, 40 döngüleri; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü; 60 ° C 15 s, 1 döngüsü; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü.
- Yer plaka qPCR alet. Programı başlatın.
Not: pH duyarlı genlerin MSMO1Upregulation, INSIG1ve IDI1 tarafından protein düzeyleri ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uygun bikarbonat konsantrasyonu belirlemek için DMEM aralığı 0 - 8 mM NaHCO3 (kültür orta son konsantrasyonu) hazırlanmış ve 6.4-7.4 (şekil 1) arasında değişen pH ile Kültür medya hazırlanmasında başarılı oldu. DMEM ile 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) olarak bir denetim orta ve asidik pH ile 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) bir ortam olarak ekstrasellüler pH pH 6.8 solid tümör4,5için ulaşır belirten bir önceki rapora göre hazırladık. Asidik ortamın pH için 24 saat sürekli ve yavaş yavaş yaklaşık pH PANC-1 ve AsPC-1 hücreleri (Şekil 2) için 6,6 Kültür sırasında 72 h için azalmıştır. Ardından, laktat veya HCl pH 6.8 kontrol ortamına (pH 7,4) ayarlamak için gereken miktarını belirlemek için biz çeşitli miktarlarda laktat veya HCl denetim Orta olarak eklendi ve ortamın pH ölçülen ve son concentratio ile denetim ortam pH bulundu n 22.5 µM laktat ve 6.25 mM HCl 6,8 (şekil 3) değeri ulaştı.
Düşük pH ile bir ortam kullanarak hücre dışı asitleştirme etkisi kolayca upregulation MSMO1, IDI1ve INSIG1gibi asidik pH duyarlı genlerin göre değerlendirilebilir. Bu genlerin ifade son derece düşük pH onların ifade hipoksi veya besin açlık (şekil 4) altında karşılaştırıldığında altında yükseltilmiştir. Buna ek olarak, bu genlerin upregulation asidik pH düşük bikarbonat düzeyleri tarafından neden olduğu bir ortama belirli değildi ve onlar were da upregulated bir orta asidik pH laktat ve/veya HCl (şekil 5) eklenmesi tarafından neden oldu. Asidik pH düşük bikarbonat seviyeleri elde edilir veya laktat veya HCl eklenmesi hücresel yanıt asitleştirme belirli türleri için özel olup olmadığını belirlemek bize sağlayan medya hücresel yanıt karşılaştırılması. Bizim yöntem sadece tümör hücreleri normal hücreleri için de uygulanabilir ancak bu yüzden Upregulation IDI1, MSMO1ve INSIG1 gibi asidik pH sorumlu genlerin hücre dışı düşük pH altında da normal hücrelerde (şekil 6), oluşur. Yüksek pH koşul altında pH-sorumlu genlerin ifade düzeyi PANC-1 ve AsPC-1 hücreleri (Şekil 7), hangi-ebilmek var kullanılmış negatif kontrol upregulated değildi.
Şekil 1. NaHCO3 konsantrasyon ve orta pH. arasında korelasyon Yatay eksen gösterir NaHCO3 konsantrasyon ve dikey eksen gösterir 37 ° C'de orta pH altında % 5 CO2. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Düşük-pH (pH 6.8) kültür orta 72 h-kültür sırasında orta pH değişikliği. Orta pH için 24 saat sürekli ve yavaş yavaş için 72 h sırasında PANC-1 ve AsPC-1 hücre kültür azalmıştır. 5.0 x 105 hücreleri orta 10 ml 10 cm çanak tohumlari, 24 saat inkübe ve düşük pH kültür ortamına değişti. Veri en az üç bağımsız deneyler ortalama ± SEM sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Laktat veya HCl konsantrasyonu ve pH orta arasında korelasyon. Denetim orta (pH 7,4) laktat veya HCl. çeşitli konsantrasyonları ile tamponlanmış Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Yanıt olarak düşük pH asidik pH duyarlı genlerin transkripsiyon upregulation 24 h veri sunulmaktadır sonra ortalama ± SEM, en az üç ifade düzey MSMO1, IDI1ve INSIG1 yüksek PANC-1 ve hipoksi (H) veya besin açlık (NS) koşulları altında düşük pH (pH) bağlamında hücrelerde AsPC-1 bağımsız deneyler. Öğrenci t-testleri için belirtilen karşılaştırma gerçekleştirilen. p < 0.005. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Laktik asidoz ve HCl aracılı asidoz yanıt asidik pH duyarlı genlerin transkripsiyon upregulation. IDI1, MSMO1ve INSIG1 mRNA'ların PANC-1 hücreleri ve AsPC-1 hücreleri ifade nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu analiz kontrolü (Con; pH 7,4), düşük pH (pH; NaHCO3 miktarı azalmış pH 6.8, altında tarafından belirlendi ), laktik asidoz (laktat; laktat pH 6.8, artış miktarı) ve HCl aracılı asidoz (HCl; HCl pH 6.8, artan miktarda) koşulları 24 h için veri sunulmaktadır ortalama ± SEM en az üç bağımsız deneyler. Öğrenci t-testleri için belirtilen karşılaştırma gerçekleştirilen. p < 0.005. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Yanıt-e doğru normal hücrelere düşük pH asidik pH duyarlı genlerin transkripsiyon upregulation. Upregulated fibroblastic KMS-6, TIG, MSMO1, IDI1ve INSIG1 ifade seviye olduğunu ve MRC9 hücreleri ve endotel HUVEC hücreleri 24 h veri sonra en az üç bağımsız deneyler ortalama ± SEM sunulmaktadır. Öğrenci t-testleri için belirtilen karşılaştırma gerçekleştirilen. p < 0.005. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7. Karşılaştırıldığında düşük pH (pH 6.8) altında yüksek pH (pH 7,6-8,0) koşul altında asidik pH sorumlu genlerin ifade düzey. IDI1, MSMO1ve INSIG1 gibi pH sorumlu genlerin ifade düzey PANC-1'deki yüksek pH (pH 7,6-8,0) koşullarda değişmeden kalır ve AsPC-1 hücreleri 24 h veri sonra sunulmaktadır ortalama ± SEM, en az üç bağımsız deneyler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Astar | Astar sıra ileri | Astar | Ters pimer sıra | ||
| ACTB | 5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3' | ACTB | 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' | ||
| MSMO1 | 5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3' | MSMO1 | 5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3' | ||
| INSIG1 | 5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3' | INSIG1 | 5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3 ' | ||
| IDI1 | 5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3' | IDI1 | 5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3' | ||
Tablo 1. Nicel gerçek zamanlı PCR analizinde kullanılan astar listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, bir basit asidik pH kültür sistemi ve değerlendirme sürecinin açıklanan. Orta asitleştirme, Yani, düşük bikarbonat konsantrasyonu, laktat ek ve HCl ek olarak, üç yöntemlerin bileşimini pH-yanıtlama mekanizması iyice araştırmak ve hücresel yanıt diğer tümör olarak karşılaştırmak için bize etkin hipoksi veya besin açlık gibi microenvironmental koşulları.
Bu yöntem, kültür orta uygun konsantrasyonlarda bikarbonat, laktat ve HCl belirlemek için anahtardır. Bu yöntem ilk kez gerçekleştirirken çeşitli bikarbonat konsantrasyonu ile orta pH ölçme NaHCO3 orta uygun miktarını belirlemek önemlidir. Bu işlem sırasında kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH ölçmek gereklidir altında %5 CO2, CO2 ün orta sıcaklık ve denge durumunu büyük ölçüde etkileyen orta pH. Bikarbonat kolayca düz hale geldikçe ısıyla bikarbonat sık tavsiye edilir. Çünkü büyüyen kanser hücrelerini çok sayıda kolayca kültür ortamında bile kontrol örnekleri acidify hücre yoğunluğu ve hücre confluency çok önemli faktörlerdir. Buna ek olarak, yanıt ekstraselüler asidik pH için hücreleri koşula bağlıdır ve hücreleri pasajlı gibi az 10 pasajlar içeren hücreler için deneyler flashbacklerinde fade.
Bizim yöntem önemli ölçüde orta pH 24 h için kararlılığını gösterdi ve çeşitli asidik pH medya göre. Düşük pH koşulu ama seri asidik pH pH 6.4 ve 6,9, ek olarak pH 7,4 ve 8.0, arasında seri temel pH ortam arasında ekstrasellüler asitleştirme karşı hücresel yanıt araştırmak için kullanılan gibi bu protokol için orta pH 6.8 kullanıldı.
Biz esas olarak kanser hücreleri üzerinde duruldu, ama bu yöntem tümör microenvironment, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri ve vasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere hücrenin diğer türleri için kullanılabilir. Biz ve diğerleri en azından bazı pH hassas mekanizmalarının kanser hücrelerinin içinde normal hücreleri7' ortak olduğunu bildirdi. Bu da diğer Primer hücre gibi embriyonik kök hücre analizi için bu yöntemi uygulamak mümkündür ve pluripotent kök hücreler indüklenen. Bir sınırlama Bu kültür sistemi uzun vadeli deneyler asidik pH durumda sürdürmenin zorluk olabilir.
Asidoz çeşitli hastalıklar ile ilişkilidir. Bu yöntem aynı zamanda Diyabetik ketoasidoz, renal tübüler asidoz ve solunum asidozu gibi asidik bozuklukları eğitim sadece kanser araştırma içinde geçerli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar Ayano Kondo bir çalışandır, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Acknowledgments
Biz Division genom bilim ve laboratuvar üyeleri teşekkür sistemleri Biyoloji ve tıp, RCAST, Tokyo Üniversitesi için. Biz özellikle teşekkür Dr H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, Tokyo Üniversitesi), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida ve Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co, Ltd) yararlı tartışmalar ve destek. Bu eser kısmen için genç bilim adamı (A) (26710005, T.O.), yenilikçi alanları (26116711 ve 16 H 01567, T.O.) bilimsel araştırma için Grant-in-Aid ve Grant-in-Aid için zorlu Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir
Araştırmacı araştırma (16K 14605, T.O.) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya, Takeda Bilim Vakfı (to), kanser araştırmaları (to) Kobayashi temeli ve kanser araştırmaları için proje ve Terapötik evrim (P-oluşturma) ve yenilikçi kanserle savaş Japonya ajansı tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED (to) için pratik araştırma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
