Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablering av en ekstracellulære surt pH kultur-systemet

Published: November 19, 2017 doi: 10.3791/56660
Automatic Translation
1, 2
1Innovative Technology Laboratories, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, 2Laboratory for Systems Biology and Medicine, RCAST, The University of Tokyo

Summary

Sure svulst microenvironment spiller avgjørende roller i svulst progresjon. For å vurdere effekten av surt ekstracellulære pH på kreft celler i vitro, etablerte vi enkel surt kultur systemer.

Abstract

For svulst microenvironment, som hypoksi eller næringsstoffer sult, spiller viktige roller i kreft progresjon og kreft. Men er rollen surt ekstracellulære pH i tumor aggressivitet og dens underliggende mekanismen ikke mye studert sammenlignet med hypoxic eller næringsstoffer sult forhold. I tillegg har en veldefinert kultur metode å etterligne den sure ekstracellulære svulst microenvironment ikke fullt rapportert.

Her presenterer vi en enkel i vitro kultur metode for å opprettholde surt ekstracellulære pH bruker redusert bikarbonat og økt laktat eller HCl konsentrasjoner i kultur medium. Middels pH var vedvarende minst 24 timer og gradvis redusert med 72 h etter kultur av PANC-1 og AsPC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler. Tre distinkte surt media betingelser i denne studien svært upregulated pH-responsive gener som MSMO1, INSIG1og IDI1 forhold til hypoksi eller næringsstoffer sult. Oppregulering av disse genene kan brukes som en markør for surt pH. Disse enkle teknikker er gunstig å belyse underliggende mekanismene svulst malignitet under Sure svulst microenvironment. Derfor gjør våre ekstracellulære surt pH kultur-systemet oppdagelsen av mobilnettet surt pH svar ikke bare i kreftceller, men også i primære celler, for eksempel nyre rørformede celler, i forhold til de andre syrlig lidelser inkludert, diabetisk ketoacidose, melkesyreacidose, nedsatt tubulær acidose og respiratoriske acidose.

Introduction

Svulst-microenvironment spiller viktige roller i svulst progresjon og kreft celle metabolisme1,2,3. Kreftceller er ofte utsatt for forhold som hypoksi, Nærings deprivasjon og surt ekstracellulære pH (pHe). Men rollen pHe i svulst progresjon er ikke avklart så mye som hypoksi eller næringsstoff sult. PHe i tumor vev kan bli syreholdig, nå ca pH 6.84,5. Surt pH oppstår fra aerob og anaerob glycolytic utskillelse av protoner (H+) og laktat av voksende kreft celler5,6.

Studier viste at syrlig pHe-indusert histone deacetylation og fettsyrer oksidasjon exocytosis surt lysosomer for tilpasning til alvorlig syreholdig miljø7,8,9,10. Imidlertid påvirker mekanismer gjennom hvilke ekstracellulære forsuring kreft atferd og identiteten til nøkkelen regulatorer i surt pH svulst microenvironment ikke er fullstendig klarert. Videre flere rapporter beskrives ulike surt pH medier bruker uklart konsentrasjoner av bikarbonat, Tris, rør og HEPES buffer eller laktat og HCl, men det er noen rapporter å vise stabiliteten til de mellomstore eller omfattende sammenligning av flere forskjellige surt kultur medier7,8,9,10

For å belyse sentrale regulatorer og metabolske forandringer i kreftceller i sammenheng med ekstracellulære forsuring, vi etablert en enkel i vitro kultur modell for å opprettholde en syrlig pHe og undersøkt rollen pHe i kreft celler11. På denne måten, vi holdt et surt kultur medium med en pHe av 6,8 på 37 ° C under 5% CO2, med redusert bikarbonat konsentrasjoner i kultur medium. pH 7.4 ble brukt som normalt og kontrollere medium. Middels pH var vedvarende minst 24 timer og gradvis redusert med 72 h under kultur av PANC-1 og AsPC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler. Fordi forbedret Glykolysen akselererer utskillelse av ikke bare protoner, men også laktat7,8,9, vi også etablert en kultur metode mimicking laktat-indusert acidose ved å legge til laktat i stedet for å redusere den bikarbonat konsentrasjon. I tillegg tillater HCl-indusert surt pHe i medium oss å utelukke muligheten for at mobilnettet Svar å surt pH kultur medium ikke er grunn til en redusert konsentrasjon av bikarbonat. Videre kan bruker ulike medier med en pH på 6.4 til 7.4 med forskjellige bikarbonat konsentrasjon, vi vurdere omfanget av pHe effekter på mobilnettet svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av Sure kultur Medium

  1. Utarbeidelsen av kontroll (pH 7.4) og lav-pH (pH 6.8) kultur medium
    1. Oppløse 4.75 g DMEM vaskemiddel uten L-glutamin i 500 mL vann.
    2. Forberede 0,33 M NaHCO3 -løsning i en presset stramme flaske.
      Advarsel: Det er viktig å bruke en trykket tett flaske siden NaHCO3 avgir CO2 gass når oppvarmet og termisk nedbrutt.
    3. Autoclave mediet og løsning. Tillate buffere til å avkjøles til 25 ° C.
    4. Legge til 200 mM L-glutamin, 5 mL av penicillin-streptomycin, 5 mL og 50 mL av fetal bovin serum til 500 mL DMEM uten bikarbonat.
    5. Legge til 2,4 mL 0,33 M NaHCO3 løsning per 100 mL DMEM uten bikarbonat kontroll (pH 7.4) medium. For lav-pH (pH 6.8) medium, legge 0,6 mL 0,33 M NaHCO3 løsning per 100 mL DMEM uten bikarbonat.
    6. Sjekke middels pH etter 24 timer med inkubering på 37 ° C under 5% CO2.
      Merk: Mengden NaHCO3 -løsning må justeres avhengig av middels pH, som kan variere avhengig av CO2 innholdet av inkubatoren og lufttrykk. Ideelt for første gang er det bedre å måle middels pH med ulike bikarbonat konsentrasjoner å bestemme riktig mengde NaHCO3 løsning å legge til DMEM.
      1. Samle kultur medium umiddelbart etter fjerning kultur rett inkubatoren CO2 og måle pH-verdien med en pH-meter. Hold mediet temperaturen på 37 ° C ved hjelp av et vannbad hvis nødvendig. Måle middels pH tre ganger uavhengig.
        Merk: NaHCO3 løsning bør lagres på 4 ° C og hvert medium bør være nylagde. Kommersielt tilgjengelige produkter som kan brukes i denne studien er oppført i Tabellen for materiale.
  2. Forbereder laktat-indusert eller HCl-indusert surt kultur medium
    1. Legge til 74 µL av laktat løsning eller 125 µL av 1 M HCl 100 mL kontroll medium (forberedt i trinn 1.1.5).
    2. Sjekke middels pH etter 24 timer med inkubering på 37 ° C under 5% CO2.
      Merk: Laktat eller HCl løsning må også justeres i henhold til middels pH, som kan variere avhengig av CO2 innholdet i inkubator og lufttrykk. Ideelt sett er det bedre å måle middels pH med føljetong laktat eller HCl konsentrasjoner å bestemme riktig mengde for å justere til ønsket pH av mediet.

2. høsting og behandle celler

  1. Starte dyrke cellene på 37 ° C under 5% CO2 minst 1 uke før utføre eksperimenter.
    Merk: Cellelinjer brukt i denne studien er oppført i Tabellen for materiale.
  2. Passasjen celler når de når 70-90% confluency. Tillater ikke at cellene å bli confluent. Endre mediet hver 2-3 dager under daglige dyrking.
  3. Vask cellene ved å legge til 5 mL PBS. Sug opp PBS og Legg frakobling enzymet som 1 mL Trypsin.
  4. Ruge på 37 ° C til cellene avrundet og begynner å koble.
  5. Legge til 5 mL av kultur medium i frittstående cellene og deaktivere enzym. Overføre celle suspensjon 15 mL tube og sentrifuge for 3 min på 300 x g. leveringstanken nedbryting og å suspendere cellene med kultur medium.
  6. Telle levedyktig celler ved hjelp av en hemocytometer og Trypan-blå.
  7. Frø 5.0 x 105 celler/vel av en 10 cm rett i 10 mL av medium. Inkuber celler for 24 h på 37 ° C under 5% CO2.
  8. Sug opp kultur medium, vaske cellene med 5 mL PBS og legge 10 mL av Sure kultur medium i del 1. Inkuber celler for 24 h på 37 ° C under 5% CO2.

3. RNA isolasjon

  1. Sug opp kultur medium og vask celler med 5 mL PBS. Forstyrre cellene ved å legge til RNA utvinning reagens (se Tabellene av materialer).
  2. Skrape fatet kort, deretter fjerne RNA utvinning reagensen med en pipette og innskudd RNA utvinning reagens/cellen lysate i en 1,5 mL tube. La ved romtemperatur for 5 min.
  3. Legg til 250 µL kloroform og rist røret kraftig for ca 15 s. la ved romtemperatur for 5 min og sentrifuger på ≥8, 000 x g i 5 min.
  4. Fjern forsiktig den vandige fasen bruker en pipette. La bak noen av den vandige fasen. Plasser i en annen 1,5 mL tube.
  5. Legge til 550 µL isopropanol i den vandige fasen og bland forsiktig. La ved romtemperatur for 5 min. sentrifuge med maksimal hastighet (≥20, 000 x g) for 20 min på 4 ° C.
  6. Hell av isopropanol og tilsett 1 mL 75% etanol i DEPC behandlet vann. Bland forsiktig. Sentrifuge 8000 x g i 5 min.
  7. Pipetter av etanol og la pellets air-dry.
  8. Legge til ca 15-25 µL (avhengig av avkastningen) av DEPC behandlet vann til RNA-pellets. Bland godt.
  9. Måle konsentrasjonen av isolerte RNA ved å måle OD på 260 nm bruker et spektrofotometer.

4. cDNA syntese

  1. Kombinere følgende komponenter i et PCR reaksjon rør: opptil 5 µg totale RNA, 1 µL Oligo dT (50 µM) eller tilfeldig Primer blanding (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP og nuclease-fritt vann til et totalt volum på 14 µL.
  2. Bland og kort sentrifuge komponentene bruker en liten Borstemmaskin sentrifuge (~ 5 s). Denature prøven RNA/primer for 5 min på 65 ° C. Spin kort (~ 5 s) bruker en liten Borstemmaskin sentrifuge og sette prøven umiddelbart på is minst 1 min.
  3. Legg til følgende komponenter: 4 µL 5 x reversere transkripsjon buffer, 1 µL revers transkriptase (200 U/µL), 1 µL RNase hemmer (40 U/µL).
    Merk: Eksempler på kommersielt tilgjengelig kits vises i Tabellen på materialer
  4. Cap røret, blande, og deretter virvel kort innholdet ved å bruke en liten Borstemmaskin sentrifuge (~ 5 s). Inkuber kombinert reaksjonsblandingen ved 50-55 ° C i 10 min.
  5. Deaktiver reaksjonen av rugende ved 80 ° C i 10 min.

5. måling av syre-responsive genuttrykk bruker sanntid PCR

  1. Kombinere følgende komponenter i en 384-vel reaksjon plate: 1 µL mal cDNA, 0,75 µL 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM frem primer, 0,3 µL 50 µM reversere primer, 1 µL Taq utvalg, 2,5 µL 10 x Taq polymerase buffer, 2,5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL vann.
    Merk: Eksempel kommersielt tilgjengelig kits er vist i Tabellen for materiale. En liste over primere er vist i tabell 1. En 96-brønns reaksjon plate kan brukes i dette trinnet. Andre sonder (f.eks, Taqman sonde) kan også brukes.
  2. Definere eksperimentet og følgende PCR program på en Real-time PCR System: 50 ° C i 2 minutter, 1 syklus; 95 ° C i 10 min, 1 syklus; 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 1 minutt, 40 sykluser; 95 ° C i 15 s, 1 syklus; 60 ° C i 15 s, 1 syklus; 95 ° C i 15 s, 1 syklus.
  3. Plass platen i qPCR apparatet. Start programmet.
    Merk: Oppregulering av pH forståelsesfull genene MSMO1, INSIG1og IDI1 kan måles ved protein nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å bestemme riktig bikarbonat konsentrasjonen, vi forberedt DMEM på rekke 0 - 8 mM NaHCO3 (siste konsentrasjon i kultur medium) og lyktes i å forberede kultur medier med pH fra 6.4-7.4 (figur 1). Vi forberedt DMEM med 8 mM NaHCO3 (pH 7.4) som kontroll medium og 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) som et medium med surt pH i en tidligere rapport sier at ekstracellulære pH når pH 6.8 for solide svulster4,5. PH i surt mediet var vedvarende 24 h, og gradvis redusert til ca pH 6.6 72 h under kultur av PANC-1 og AsPC-1 celler (figur 2). Neste, for å bestemme mengden av laktat eller HCl må justere kontroll mediet (pH 7.4) til pH 6.8, vi lagt ulike mengder laktat eller HCl til kontroll medium målt pH i medium og fant at pH i kontroll mediet med en siste concentratio n 22,5 µM laktat og 6,25 mM HCl nådde en verdi på 6,8 (Figur 3).

Effekten av ekstracellulære forsuring med en middels lav pH kan evalueres lett basert på oppregulering av surt pH-responsive gener som MSMO1, IDI1og INSIG1. Uttrykk for disse genene ble svært økt under lav pH i forhold til deres uttrykk under hypoksi eller næringsstoffer sult (Figur 4). I tillegg oppregulering av disse genene var ikke gjelder for en medium der surt pH skyldtes redusert bikarbonat nivåer, og de var også upregulated av et medium som surt pH ble forårsaket av tillegg av laktat og/eller HCl (figur 5). Sammenligning av mobilnettet svar til medier som surt pH er avledet fra redusert bikarbonat nivåer eller tillegg av laktat eller HCl kan vi finne ut om mobilnettet svar er spesifikke for visse typer forsuring. Oppregulering av surt pH ansvarlig gener som IDI1, MSMO1og INSIG1 under ekstracellulære lav pH forekommer også i normale celler (figur 6), så vår metode kan brukes ikke bare kreftceller, men også normale celler. Under høy pH tilstand var hvilket uttrykk pH-ansvarlig gener ikke upregulated i PANC-1 og AsPC-1 celler (figur 7), som kan brukes som negativ kontroll.

Figure 1
Figur 1. Sammenhengen mellom NaHCO3 konsentrasjon og middels pH Vannrett akse konsentrasjonen av NaHCO3 og loddrette aksen viser middels pH på 37 ° C under 5% CO2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Endring av middels pH i lav-pH (pH 6.8) kultur medium under 72 h-kultur. Middels pH var vedvarende 24 h og gradvis redusert 72 h under kultur av PANC-1 og AsPC-1 celler. 5.0 x 105 celler ble sådd til en 10 cm rett i 10 mL av medium, ruges i 24 timer og endret til lav pH kultur medium. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Sammenheng mellom laktat eller HCl konsentrasjoner og pH av medium. Kontroll mediet (pH 7.4) ble bufret med ulike konsentrasjoner av laktat eller HCl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Transcriptional oppregulering av surt pH-responsive gener svar på lav pH Uttrykk var MSMO1, IDI1og INSIG1 høyere i PANC-1 og AsPC-1 celler i sammenheng med lav pH (pH) enn under hypoksi (H) eller næringsstoffer sult (NS) betingelser etter 24 h. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM av minst tre uavhengige eksperimenter. Student t-testene ble utført for angitt sammenligninger. p < 0.005. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Transcriptional oppregulering av surt pH-responsive gener som svar på melkesyreacidose og HCl-mediert acidose. Uttrykk for IDI1, MSMO1og INSIG1 mRNAs i PANC-1 cellene og AsPC-1 ble bestemt av kvantitative sanntid polymerase kjedereaksjon analyse under kontroll (Con, pH 7.4), lav pH (pH, pH 6.8, redusert mengden NaHCO3 ), melkesyreacidose (laktat, pH 6.8, økt mengde laktat) og HCl-mediert acidosis (HCl; pH 6.8, økt mengde HCl) forholdene for 24 h. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM minst tre uavhengige eksperimenter. Student t-testene ble utført for angitt sammenligninger. p < 0.005. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Transcriptional oppregulering av surt pH-responsive gener svar på lav pH i normale celler. Uttrykk MSMO1, IDI1og INSIG1 var upregulated i fibroblastic KMS-6, TIG, og MRC9 celler og HUVEC endotelceller etter 24 h. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM minst tre uavhengige eksperimenter. Student t-testene ble utført for angitt sammenligninger. p < 0.005. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Uttrykket nivå av surt pH-ansvarlig gener under høy pH (pH 7.6 til 8.0) tilstand sammenligning under lav pH (pH 6.8). Hvilket uttrykk pH-ansvarlig gener som IDI1, MSMO1og INSIG1 forblir uendret under høy pH (pH 7.6 til 8.0) forhold i PANC-1 og AsPC-1 celler etter 24 h. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM av minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Primer Videresende primer sekvens Primer Omvendt pimer rekkefølge
ACTB 5-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3 " ACTB 5-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3 "
MSMO1 5-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3 " MSMO1 5-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3 "
INSIG1 5-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3 " INSIG1 5-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3 "
IDI1 5-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3 " IDI1 5-CAACATCCGGCATAACTGTG-3 "

Tabell 1. Liste over primere brukt i kvantitative sanntid PCR analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrev vi en enkel surt pH kultur-systemet og vurdering prosessen. Kombinasjonen av tre metoder for middels forsuring, dvs, redusert bikarbonat konsentrasjon, laktat tillegg og HCl tillegg mulig for oss å undersøke pH-svar-mekanisme grundig og sammenligne cellulær respons på andre svulst microenvironmental forhold som hypoksi eller næringsstoff sult.

Nøkkelen til denne metoden er å finne de riktige konsentrasjonene av bikarbonat, laktat og HCl i kultur medium. Måle middels pH med ulike bikarbonat konsentrasjoner når denne metoden for første gang er viktig å bestemme riktig mengde NaHCO3 i medium. Under denne prosessen, er det nødvendig å måle middels pH etter 24 timer med inkubering på 37 ° C under 5% CO2, middels temperatur og likevekt statusen av CO2 i stor grad påvirke middels pH. Autoklavering av bikarbonat anbefales ofte som bikarbonat lett blir flatt. Cellen tetthet og celle confluency er avgjørende faktorer fordi store mengder voksende kreftceller lett syre kultur medium i kontroll prøver. I tillegg Svar å ekstracellulære surt pH avhenger av tilstanden til cellene og kan visne som cellene er passaged, så celler med mindre enn 10 passasjer ble brukt for eksperimenter.

Vår metode har betydelig vist stabilitet av middels pH 24 h og flere surt pH media i forhold. I denne protokollen, ble middels pH av 6,8 brukt som en lav pH tilstand, men føljetong surt pH mellom pH 6.4 og 6,9 i tillegg føljetong grunnleggende pH medier mellom pH 7.4 og 8.0, ble brukt til å undersøke cellulær respons mot ekstracellulære forsuring.

Vi fokusert hovedsakelig på kreftceller, men denne metoden kan brukes for andre typer celler i svulst microenvironment, inkludert stromal celler, immunceller og vaskulær endotelceller. Vi og andre rapporterte at minst noen pH følsom mekanismer i kreftcellene er vanlig i normale celler7. Det er også mulig å bruke denne metoden for analyse av andre primære celler samt embryonale stamceller og indusert pluripotent stamceller. En begrensning av dette kultur-systemet kunne vanskelighetene med å opprettholde betingelsen surt pH langsiktige eksperimenter.

Acidosis er forbundet med ulike typer sykdommer. Denne metoden kan brukes ikke bare i kreftforskning men også i å studere surt lidelser som diabetisk ketoacidose, nedsatt tubulær acidose og respiratoriske acidose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren Ayano Kondo er ansatt i Kyowa Hakko Kirin co, Ltd

Acknowledgments

Vi takker medlemmene av delingen av genomet vitenskap og laboratorium for systemer biologi og medisin, RCAST, The University of Tokyo. Vi spesielt takke Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida og Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin co, Ltd) for nyttig diskusjoner og støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Grant-in-Aid for unge vitenskapsmannen (A) (26710005, to), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (26116711 og 16 H 01567, to), og Grant-in-Aid for utfordrende
Utforskende forskning (16K 14605, to) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan, Takeda Science Foundation (to), Kobayashi grunnlaget for kreftforskning (to) og prosjektet for kreftforskning og Terapeutiske evolusjon (P-opprette) og praktisk forskning for nyskapende Cancer Control fra Japan byrå for medisinsk forskning og utvikling, AMED (to).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 Nissui 05919
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10438
NaHCO3 Wako 191-01305
L-glutamine solution Thermo Fisher 25030-081
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) Nacalai 09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red Nacalai 32778-05
0.5%-Trypan Blue Stain Solution Nacalai 29853-34
Lactic acid solution Sigma-Aldrich 252476
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H9892
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN 74134
SuperScript IV First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 18091
Power SYBR Green PCR Master Mix  Applied Biosystems 4368702 
Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
PANC-1 ATCC CRL-1469
AsPC-1 ATCC CRL-1682
KMS-6 JCRB Cell Bank JCRB0432
TIG JCRB Cell Bank
MRC9 ATCC CCL-212
HUVEC ATCC CRL-1730
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Fisher ND-ONE-W
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher CRL-1682

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
  2. Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
  3. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  4. Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
  5. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
  6. Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
  7. McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
  8. Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
  9. Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
  10. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
  11. Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).

Tags

Kreftforskning problemet 129 Extracellular lav pH svulst microenvironment laktat hypoksi Nærings sult kultur metoden medium
Etablering av en ekstracellulære surt pH kultur-systemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kondo, A., Osawa, T. Establishment… More

Kondo, A., Osawa, T. Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System. J. Vis. Exp. (129), e56660, doi:10.3791/56660 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter