Summary
酸性肿瘤微环境在肿瘤进展中起重要作用。为了评估酸性细胞外 pH 对癌细胞的影响, 在体外,建立了简单的酸性培养体系。
Abstract
肿瘤微环境的条件, 如缺氧或营养饥饿, 在癌症进展和恶性肿瘤中起关键作用。然而, 酸性细胞外 pH 在肿瘤侵袭性中的作用及其机制并没有得到广泛的研究, 与缺氧或营养饥饿的情况。此外, 一个明确的培养方法来模拟酸性细胞外肿瘤微环境没有得到充分报道。
在这里, 我们提出了一个简单的体外培养方法, 以保持酸性细胞外 pH 使用还原碳酸氢盐和增加乳酸或 HCl 浓度的培养基。培养基 pH 值维持至少24小时, 并逐渐减少 72 h 以下的培养 PANC-1 和 AsPC-1 胰腺癌细胞。三独特的酸性介质条件在这项研究中高度上调 pH 反应基因, 如MSMO1, INSIG1和IDI1相比, 缺氧或营养饥饿.这些基因的上调可作为酸性 pH 值的标志物。这些简单的技术有助于阐明酸性肿瘤微环境下肿瘤恶性肿瘤的基本机制。因此, 我们的胞外酸性 ph 培养系统能够发现细胞酸性 ph 反应不仅在癌细胞, 而且在初级细胞, 如肾小管细胞, 与其他酸性疾病, 包括糖尿病酮症酸中毒,乳酸酸中毒, 肾小管酸中毒和呼吸道酸中毒。
Introduction
肿瘤微环境在肿瘤进展和癌细胞代谢中起关键作用1,2,3。癌细胞经常暴露在缺氧、养分匮乏和酸性细胞外 pH 等条件下。然而, 在肿瘤进展的作用没有被澄清如在缺氧或营养饥饿的广泛。肿瘤组织中的脂肪细胞可以变为酸性, 达到大约 pH 值 6.84,5。酸性 pH 产生于有氧和厌氧酵排泄质子 (H+) 和乳酸的增殖癌细胞5,6。
最近的研究发现, 酸性的组蛋白脱乙酰, 脂肪酸氧化, 和胞酸性溶酶体适应严重酸性环境7,8,9,10。然而, 细胞外酸化影响肿瘤行为的机制和酸性 pH 肿瘤微环境中关键调控因子的身份尚未完全确定。此外, 一些报告描述了各种酸性 pH 介质使用不清楚的碳酸氢盐, 三, 管道, 和 HEPES 缓冲剂或乳酸和 HCl, 但很少有报告显示稳定的调整介质或全面几种独特酸性培养基的比较7,8,9,10
为了阐明细胞外酸化过程中肿瘤细胞的主要调控因子和代谢变化, 我们建立了一个简单的体外培养模型, 以维持酸性细胞的活性, 并研究了在癌细胞中的作用.使用这种方法, 我们维持了一个酸性培养基与6.8 在37° c 以下 5% CO2, 在培养基中使用还原碳酸氢盐浓度。pH 值7.4 被用作正常和控制介质。在 PANC-1 和 AsPC-1 胰腺癌细胞培养过程中, 培养基 pH 值持续至少 24 h, 并逐渐降低 72 h。由于增强的糖酵解加速了不仅质子的排泄, 而且乳酸7,8,9, 我们还建立了一种模拟乳酸诱导酸中毒的培养方法, 添加乳酸, 而不是减少碳酸氢盐浓度。此外, 在培养基中 HCl 诱导的酸性物质允许我们排除细胞对酸性 pH 培养基反应的可能性, 而不是由于碳酸氢盐浓度的降低。此外, 使用不同浓度的 pH 值为6.4 到7.4 的不同介质, 我们可以对细胞反应的影响程度进行评估。
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Protocol
1. 酸性培养基的制备
-
制备控制 (ph 值 7.4) 和 low-pH (ph 6.8) 培养基
- 在500毫升的水中溶解4.75 克无 l-谷氨酰胺的 DMEM 粉。
- 在压紧瓶中准备 0.33 M NaHCO3解决方案。
注意: 由于 NaHCO3在加热和热分解时发出 CO2气体, 因此使用压力紧瓶非常重要。 - 高压釜介质和溶液。允许这些缓冲器冷却到25° c。
- 添加5毫升的200毫米 l-谷氨酰胺, 5 毫升的青霉素-链霉素, 和50毫升的胎儿牛血清到500毫升的 DMEM 没有碳酸氢盐。
- 对于控制 (pH 7.4) 介质, 添加2.4 毫升的0.33 米 NaHCO3溶液每100毫升的 DMEM 没有碳酸氢盐。对于 low-pH (pH 6.8) 介质, 在没有碳酸氢盐的 DMEM 中, 每100毫升添加0.6 毫升的0.33 米 NaHCO3溶液。
- 在37° c 以下 5% CO2下, 检查 24 h 孵育后的介质 pH 值。
注意: NaHCO3解决方案的数量需要根据介质 pH 值进行调整, 这可能因孵化器和气压的 CO2内容而异。理想情况下, 第一次, 最好用不同的碳酸氢盐浓度来测量中 pH 值, 以确定 NaHCO 的3解决方案中添加到 DMEM 的适当数量。- 从 CO2孵化器中取出培养皿后立即收集培养基, 并使用 ph 计测量 ph 值。如有必要, 在37° c 下使用水浴保持介质温度。独立测量介质 pH 值三次。
注意: NaHCO3解决方案应存储在4° c, 并且每个媒体都应进行新的准备。可用于本研究的商业可用产品列在材料表中。
- 从 CO2孵化器中取出培养皿后立即收集培养基, 并使用 ph 计测量 ph 值。如有必要, 在37° c 下使用水浴保持介质温度。独立测量介质 pH 值三次。
-
乳酸诱导或盐酸诱导的酸性培养基的制备
- 添加74µL 乳酸溶液或125µL 1 M HCl 到100毫升的控制介质 (在步骤1.1.5 中制备)。
- 在37° c 以下 5% CO2下, 检查 24 h 孵育后的介质 pH 值。
注: 乳酸或 HCl 溶液的用量也需要根据培养基 pH 值进行调整, 根据孵化箱和气压中 CO2含量的不同而有所不同。理想的情况是, 最好用连续的乳酸或盐酸浓度来测定培养基 ph 值, 以确定适当的剂量来调节培养基的 ph 值。
2. 收获和治疗细胞
- 开始培养细胞在37° c 以下 5% CO2至少1星期在执行实验之前。
注: 本研究中使用的细胞系列于材料表中。 - 通道细胞, 当他们达到 70-90% 70-100。不要让细胞成为汇合。在日常栽培中每 2-3 天改变培养基。
- 通过加入5毫升 PBS 清洗细胞。吸取 PBS 和添加分离酶, 如1毫升胰蛋白酶。
- 孵育在37° c, 直到细胞被四舍五入, 开始分离。
- 将5毫升培养基添加到分离细胞和停用酶。将细胞悬浮液转移至15毫升管, 离心机3分钟, 在 300 x g. 吸取上清和 re-suspend 细胞的培养基。
- 使用例和台盼蓝计算活细胞。
- 种子 5.0 x 105细胞/10 厘米的菜在10毫升的培养基中。孵育细胞为24小时在37° c 以下 5% CO2。
- 吸取培养基, 用5毫升 PBS 洗涤细胞, 在1节中加入10毫升的酸性培养基。孵育细胞为24小时在37° c 以下 5% CO2。
3. RNA 分离
- 用5毫升 PBS 培养培养基和洗涤细胞。通过添加 RNA 提取试剂来扰乱细胞 (请参阅材料表)。
- 用吸管将 rna 提取试剂取出, 然后将 rna 提取试剂/细胞裂解液放入1.5 毫升管中。室温下保持5分钟。
- 添加250µL 氯仿, 并大力摇管约十五年代. 在室温下为5分钟, 离心机在≥8,000 x g 为5分钟。
- 小心地用吸管除去水相。留下一些水相。在另一个1.5 毫升管的地方。
- 在水相中加入550µL 异丙醇, 轻轻搅拌。在室温下, 以最大转速 (≥20,000 x g) 在4° c 的20分钟内离开离心机5分钟。
- 倒入异丙醇, 在 DEPC 处理的水中加入1毫升75% 乙醇。轻轻地混合。离心机在 8000 x g 为5分钟。
- 吸管关闭乙醇, 让颗粒风干。
- 添加约 15-25 µL (取决于产量) 的 DEPC 处理水的 RNA 颗粒。混合彻底。
- 用分光光度计测量 260 nm 的 OD, 测量分离 RNA 的浓度。
4. cDNA 合成
- 在 PCR 反应管中结合以下成分: 高达5µg 总 RNA, 1 µL 寡糖 dT (50 µM) 或随机引物组合 (60 µM), 1 µL 10 毫米 dNTP, 和核酸-免费水到总容量14µL。
- 使用小型台式离心机 (5 s) 对部件进行混合和简单的离心分离。变性样品 RNA 或底漆为5分钟在65° c。简要 (〜 5 s) 使用一个小的台式离心机, 并把样品迅速在冰上至少1分钟。
- 添加以下组件: 4 µL 5x 反向转录缓冲, 1 µL 反转录酶 (200 u/µL), 1 µL 核糖核酸抑制剂 (40 u/µL)。
注: 商业可用套件的示例见材料表 - 盖管, 混合, 然后简要地离心的内容使用一个小的台式离心机 (约 5 s)。孵育混合反应混合物在 50-55 ° c 为10分钟。
- 在80° c 下孵育10分钟, 使反应钝化。
5. 用实时 PCR 技术测定酸反应基因的表达
- 将以下元件组合在384个反应板中: 1 µL 模板 cDNA, 0.75 µL 10X N ", n-二甲基-n--[4-(E)-(3-甲基-13-噻唑-2-ylidene) 甲基]-1-喹啉-1-ium-2-基]-propylpropane-13-二胺, 0.3 µL 50 µM 向前底漆, 0.3 µL 50 µM 反向底漆, 1 µL Taq 聚合酶, 2.5 µL 10x Taq 聚合酶缓冲, 2.5 µL 20 毫米 dNTP, 16.65 µL 水。
注意: 商业可用工具包的示例显示在材料表中。表 1中显示了底漆的列表。在这一步中还可以使用 96-井反应板。还可以使用其他探头 (例如、Taqman 探头)。 - 建立了实时 pcr 系统的实验和以下 pcr 方案:50 ° c 为2分钟, 1 周期;95° c 为 10 min, 1 周期;95° c 为十五年代和60° c 为 1 min, 40 周期;95° c 为十五年代, 1 周期;60° c 为十五年代, 1 周期;95° c 为十五年代, 1 周期。
- 把盘子放在 qPCR 的仪器里。启动程序。
注: 上调的 pH 响应基因MSMO1, INSIG1和IDI1可以通过蛋白质水平来衡量。
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Representative Results
为了确定适当的碳酸氢盐的浓度, 我们准备 DMEM 在 0-8 毫米 NaHCO3 (最终浓度在培养基中), 并成功地准备的文化介质 pH 范围从 6.4-7.4 (图 1)。我们准备 DMEM 与8毫米 NaHCO3 (pH 7.4) 作为控制介质, 和2毫米 NaHCO3 (ph 6.8) 作为一个介质与酸性 ph 值根据前一份报告指出, 胞外 ph 值达到 ph 6.8 为固体肿瘤4,5。酸性介质的 ph 值维持在 24 h, 在 PANC-1 和 AsPC-1 细胞培养过程中, 在72小时内逐渐降低到大约 ph 值 6.6 (图 2)。接下来, 为了确定将控制介质 (ph 值 7.4) 调整到 ph 6.8 所需的乳酸或 hcl 量, 我们在控制介质中添加了不同数量的乳酸或 hcl, 并测定了培养基的 ph 值, 并发现控制介质的 ph 值为最终 concentration-22.5 µM 乳酸和 6.25 mM HCl 的值达到 6.8 (图 3)。
细胞外酸化的影响, 使用低 ph 的介质可以很容易地评估基于上调的酸性 ph 敏感基因, 如MSMO1, IDI1, 和INSIG1。在低 pH 值下, 这些基因的表达与缺氧或营养饥饿时的表达相比有很大的提高 (图 4)。此外, 这些基因的上调不是特定于一种酸性 ph 是由还原碳酸氢盐水平引起的培养基, 它们也上调于酸性 ph 是由添加乳酸和/或盐酸引起的培养基 (图 5)。对介质的细胞反应的比较, 其中酸性 pH 是从还原碳酸氢盐的水平, 或添加乳酸或 HCl, 使我们能够确定细胞反应是特定类型的酸化。上调的酸性 ph 基因如IDI1、 MSMO1和INSIG1在胞外低 ph 下也发生在正常细胞 (图 6), 因此我们的方法不仅适用于肿瘤细胞, 也可用于正常细胞。在高 ph 条件下, PANC-1 和 AsPC-1 细胞 (图 7) 中 ph 值基因的表达水平不上调, 可作为阴性对照。
图1。NaHCO3浓度与中 pH 值之间的相关性水平轴显示 NaHCO 的浓度3和垂直轴显示中等 pH 值在37° c 以下 5% CO2.请单击此处查看此图的较大版本.
图2。low-pH (ph 6.8) 培养基 ph 值在 72 h 培养中的变化.在 PANC-1 和 AsPC-1 细胞培养过程中, 培养基 pH 值持续24小时, 并逐渐减少72小时。5.0 x 105细胞被播种到10毫升培养基中的 10 cm 皿中, 孵育 24 h, 并转化为低 pH 培养基。数据被提出作为平均± SEM 至少三独立实验。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。乳酸或 HCl 浓度与培养基 pH 值的相关性.控制介质 (pH 值 7.4) 用不同浓度的乳酸或 HCl 进行缓冲.请单击此处查看此图的较大版本.
图4。对 ph 值低的 ph 反应基因的转录上调.MSMO1、 IDI1和INSIG1的表达式级别在低 ph (ph) 条件下的 PANC-1 和 AsPC-1 细胞中高于缺氧 (h) 或营养饥饿 (NS) 的情况下 24 H. 数据显示为平均± SEM 至少三独立的实验。学生的t-对指定的比较执行了测试。p < 0.005。请单击此处查看此图的较大版本.
图5。酸碱应答基因的转录上调反应乳酸酸中毒和盐酸介导的酸中毒.IDI1、 MSMO1和INSIG1基因在 PANC-1 细胞和 AsPC-1 细胞中的表达是由控制下的定量 real-time 聚合酶链反应分析 (7.4), ph 值低 (ph 值 6.8, 减少了 NaHCO 的数量3), 乳酸酸中毒 (乳酸; ph 值 6.8, 乳酸含量增加), 和 hcl 介导的酸中毒 (hcl; ph 值 6.8, 增加的 hcl) 条件为 24 h. 数据被提出作为平均± SEM 至少三独立实验。学生的t-对指定的比较执行了测试。p < 0.005。请单击此处查看此图的较大版本.
图6。在正常细胞 ph 值较低的情况下, 对酸性 ph 应答基因的转录上调.MSMO1、 IDI1和INSIG1的表达式级别是上调在纤维 KMS-6、TIG、MRC9 细胞和24小时后的内皮内皮细胞. 数据被显示为至少三独立实验的平均± SEM。学生的t-对指定的比较执行了测试。p < 0.005。请单击此处查看此图的较大版本.
图7。在低 ph 值 (ph 值 6.8) 下, ph 值高 (ph 值为7.6 到 8.0) 的酸性 ph 基因的表达水平.ph 负责基因的表达水平, 如IDI1、 MSMO1和INSIG1在高 ph 值 (ph 7.6 到 8.0) 条件下保持不变 PANC-1 和 AsPC-1 细胞在 24 h 之后. 数据被显示为平均± SEM 至少三独立的实验。请单击此处查看此图的较大版本.
| 底漆 | 正向引物序列 | 底漆 | 反向 pimer 序列 | ||
| ACTB | 5 "-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3" | ACTB | 5 "-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3" | ||
| MSMO1 | 5 "-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3" | MSMO1 | 5 "-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3" | ||
| INSIG1 | 5 "-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3" | INSIG1 | 5 "-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3" | ||
| IDI1 | 5 "-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3" | IDI1 | 5 "-CAACATCCGGCATAACTGTG-3" | ||
表 1.用于定量 real-time PCR 分析的引物清单.
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Discussion
在这里, 我们描述了一个简单的酸性 pH 培养系统及其评价过程。结合三种培养基酸化方法,即: 即, 降低碳酸氢盐浓度, 添加乳酸和盐酸, 使我们能够深入研究 pH 反应机制, 并对其他肿瘤的细胞反应进行比较。微条件如缺氧或营养饥饿。
该方法的关键是在培养基中测定碳酸氢盐、乳酸和盐酸的适当浓度。在第一次执行此方法时, 用不同的碳酸氢盐浓度测定中 pH 值对于确定介质中 NaHCO3的适当数量非常重要。在此过程中, 必须在37° c 以下 5% co2下, 测量 24 h 孵育后的介质 ph 值, 因为 co2的中温和平衡状态对介质 ph 值有很大影响。碳酸氢盐的灭菌经常被推荐, 因为碳酸氢盐容易地变得平。细胞密度和细胞70-100 是重要的因素, 因为大量生长的癌细胞容易酸化培养基, 即使在控制样品中。此外, 对胞外酸性 pH 值的反应取决于细胞的状况, 并可能随着细胞的传代而消退, 因此实验使用少于10通道的细胞。
本方法显著地证明了 24 h 介质 ph 值的稳定性, 并对几种酸性 ph 介质进行了比较。在这个协议中, 中等 ph 值为6.8 被用作低 ph 值, 但 ph 值6.4 和6.9 之间的串行酸性 ph 值, 除了 ph 7.4 和8.0 之间的系列碱性 ph 值, 还被用来研究细胞对胞外酸化的反应。
我们主要关注癌细胞, 但这种方法可用于肿瘤微环境中的其他类型细胞, 包括基质细胞、免疫细胞和血管内皮细胞。我们和其他人报告说, 在正常细胞中, 至少某些 pH 敏感机制在癌细胞中是常见的7。也可以应用这种方法来分析其他原代细胞以及胚胎干细胞和诱导多能干细胞。这种培养体系的一个局限性是长期实验中保持酸性 pH 值的困难。
酸中毒与各种类型的疾病有关。这种方法不仅适用于癌症研究, 还可用于研究酸性疾病, 如糖尿病酮症酸中毒、肾小管酸中毒和呼吸道酸中毒。
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Disclosures
作者野近藤是协和发酵麒麟 Co. 的雇员, Ltd。
Acknowledgments
我们感谢东京大学 RCAST 基因组科学和系统生物学和医学实验室的成员。我们特别感谢 Dr. h. Aburatani、Dr. t 儿、(LSBM、RCAST、东京大学)、Dr. k. Tomizuka、Dr. t. 吉田和 Dr. A。
国 (协和发酵麒麟 Co., Ltd.) 进行有益的讨论和支持。这项工作得到了部分支持补助金为年轻科学家 (A) (26710005, 培训), 补助金为创新领域的科学研究 (26116711 和 16H01567, 培训) 和补助金为挑战
日本教育、文化、体育、科学和技术部、武田科学基金会 (培训)、小林癌症研究基金会 (培训) 和癌症研究项目的探索性研究 (16K14605, 培训)治疗进化 (P 创造) 和创新的癌症控制的实际研究从日本医疗研究和发展机构, 阿曼德 (培训)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
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