Summary
De zure tumor communicatie speelt belangrijke rol in de progressie van de tumor. Om te beoordelen van de gevolgen van zure extracellulaire pH voor kanker cellen in vitro vastgesteld we eenvoudige zure cultuur systemen.
Abstract
Voorwaarden van de tumor communicatie, zoals hypoxie of nutriënten honger, spelen belangrijke rol in de progressie van kanker en maligniteit. Echter, de rol van zure extracellulaire pH in tumor agressiviteit en het onderliggende mechanisme heeft niet uitvoerig bestudeerd in vergelijking met hypoxische of nutriënten honger voorwaarden. Daarnaast is een welomschreven cultuur methode om na te bootsen de zure extracellulaire tumor communicatie niet volledig gemeld.
Hier presenteren we een eenvoudige in vitro cultuur methode om met behulp van de zure pH van de extracellulaire verminderd bicarbonaat en verhoogde lactaat of HCl concentraties in het kweekmedium. De middellange pH was opgelopen gedurende ten minste 24 uur en geleidelijk daalde met 72 h na cultuur van PANC-1 en AsPC-1 pancreatic kankercellen. Drie verschillende zure media voorwaarden in deze studie zeer upregulated pH-responsieve genen zoals MSMO1, INSIG1en IDI1 ten opzichte van hypoxie of nutriënten honger. De opregulatie van deze genen kan worden gebruikt als een marker van zure pH. Deze eenvoudige technieken zijn nuttig voor het verhelderen van de onderliggende mechanismen van tumor maligniteit onder zure tumor communicatie. Daarom kunnen onze extracellulaire zure pH cultuur system ontdekking van cellulaire zure pH reacties niet alleen in kankercellen, maar ook in primaire cellen, zoals renale tubulaire cellen, met betrekking tot de andere zure aandoeningen waaronder, diabetische ketoacidose, melkzuur acidose, renale tubulaire acidose en respiratoire acidose.
Introduction
De tumor communicatie speelt een belangrijke rol in de progressie van de tumor en kanker cel stofwisseling1,2,3. Kankercellen zijn vaak blootgesteld aan voorwaarden zoals hypoxie, nutriënten ontbering en zure extracellulaire pH (pHe). Echter, de rol van pHe in tumor progressie is niet opgehelderd zo uitgebreid zoals hypoxie of nutriënt honger. De pHe in de tumor weefsel kan worden zuur, ongeveer pH 6.84,5te bereiken. De zure pH vloeit voort uit de aërobe en anaërobe glycolytic uitscheiding van protonen (H+) en lactaat door delende kanker cellen5,6.
Recente studies is gebleken dat zure pHe-geïnduceerde Histon exocytose van zure lysosomen voor aanpassing aan de ernstige zure omgeving7,8,9,10, deacetylation en oxidatie van de vetzuren. Nochtans, de mechanismen via welke extracellulaire verzuring is van invloed op kanker gedrag en de identiteit van de sleutel regelgevers in de zure pH tumor communicatie zijn nog niet volledig vastgesteld. Bovendien verschillende rapporten beschreven verschillende zure pH media met behulp van onduidelijk concentraties van bicarbonaat, Tris, PIJPEN en HEPES-buffer of lactaat en HCl, maar er zijn weinig rapporten om aan te tonen van de stabiliteit van de gecorrigeerde middellange noch uitgebreide vergelijking van verschillende afzonderlijke zure voedingsbodems7,8,9,10
Om te verhelderen de belangrijkste regelgevers en metabole veranderingen in kankercellen in het kader van extracellulaire verzuring, we een eenvoudige in vitro cultuur model voor het handhaven van een zure pHe opgericht en gebogen over de rol van pHe in kanker cellen11. Met behulp van deze methode, wij onderhouden een zure kweekmedium met een pHe van 6,8 bij 37 ° C minder dan 5% CO2, met behulp van verminderde bicarbonaat concentraties in het kweekmedium. pH 7.4 werd gebruikt als normaal en controle van medium. De middellange pH was opgelopen gedurende ten minste 24 uur en daalde geleidelijk met 72 h tijdens cultuur van PANC-1 en AsPC-1 pancreatic kankercellen. Omdat u verbeterde glycolyse versnelt uitscheiding van niet alleen de protonen, maar ook de lactaat7,8,9, wij vastgesteld een cultuur methode lactaat-geïnduceerde acidose nabootsen door toevoegen van lactaat in plaats van het verminderen van de bicarbonaat concentratie. Bovendien, HCl-geïnduceerde zure pHe in het medium stelt ons in staat om uit te sluiten van de mogelijkheid die cellulaire reacties op zure pH kweekmedium niet als gevolg van een verminderde concentratie van bicarbonaat. Bovendien, voor informatie over het gebruik van verschillende media met een pH van 6.4 tot en met 7.4 met concentratie van de verschillende bicarbonaat we kunnen beoordelen in welke mate van pHe gevolgen voor cellulaire reacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van zure kweekmedium
-
Voorbereiding van de controle (pH 7.4) en lage-pH (pH 6.8) kweekmedium
- Los 4,75 g poeder van de DMEM zonder L-glutamine in 500 mL water.
- Bereid 0.33 M NaHCO3 -oplossing in een druk-strakke fles.
Let op: Het is belangrijk om het gebruik van een strakke fles van druk omdat NaHCO3 stoot CO2 gas verwarmd als thermisch ontleed. - Autoclaaf het medium en oplossing. Toestaan dat deze buffers afkoelen tot 25 ° C.
- Voeg 5 mL van 200 mM L-glutamine, penicilline-streptomycine, 5 mL en 50 mL foetale runderserum tot 500 mL van DMEM zonder bicarbonaat.
- Voeg voor controle (pH 7.4) medium, 2.4 mL 0.33 M NaHCO3 oplossing per 100 mL DMEM zonder bicarbonaat. Toevoegen voor lage-pH (pH 6.8) medium, 0,6 mL 0.33 M NaHCO3 oplossing per 100 mL DMEM zonder bicarbonaat.
- Controleer de middellange pH na 24 uur incubatie bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
Nota: Het bedrag van NaHCO3 oplossing moet worden aangepast afhankelijk van de middellange pH, die afhankelijk van het CO2 -gehalte van de incubator en luchtdruk verschillen kan. Ideaal, voor de eerste keer, het is beter om te meten de middellange pH met verschillende concentraties van de bicarbonaat om te bepalen van de juiste hoeveelheid NaHCO3 oplossing toe te voegen aan DMEM.- Verzamel kweekmedium onmiddellijk na het verwijderen van de cultuur-schotel uit de incubator van CO2 en meten van de pH met behulp van een pH-meter. Houd de kalibrator bij 37 ° C met behulp van een waterbad, indien nodig. Wordt de middelgrote pH driemaal onafhankelijk.
Opmerking: NaHCO3 oplossing moet worden bewaard bij 4 ° C en elke media moet vers worden bereid. Verkrijgbare producten die kunnen worden gebruikt in deze studie staan in Tabel van materialen.
- Verzamel kweekmedium onmiddellijk na het verwijderen van de cultuur-schotel uit de incubator van CO2 en meten van de pH met behulp van een pH-meter. Houd de kalibrator bij 37 ° C met behulp van een waterbad, indien nodig. Wordt de middelgrote pH driemaal onafhankelijk.
-
Lactaat-geïnduceerde of HCl-geïnduceerde kweekmedium zure voorbereiden
- 74 µL van lactaat oplossing of 125 µL van 1 M HCl toevoegen aan 100 mL controle voedingsbodem (bereid in stap 1.1.5).
- Controleer de middellange pH na 24 uur incubatie bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
Nota: Het bedrag van lactaat of HCl-oplossing moet ook worden aangepast volgens de middellange pH, die afhankelijk van het CO2 -gehalte in de incubator en luchtdruk verschillen kan. In het ideale geval is het beter om te meten de middellange pH met seriële lactaat of HCl concentratie te bepalen van het passende bedrag voor aan te passen aan de gewenste pH van het medium.
2. oogsten en het behandelen van cellen
- Start cultiveren van cellen bij 37 ° C minder dan 5% CO2 ten minste 1 week vóór het uitvoeren van experimenten.
Opmerking: De cellijnen die is gebruikt in deze studie staan in Tabel van materialen. - Passage cellen wanneer ze 70-90% confluentie bereiken. De cellen worden confluente niet toegestaan. Het medium elke 2-3 dagen tijdens dagelijkse teelt wijzigen.
- Het wassen van de cellen door toevoeging van 5 mL PBS. De PBS gecombineerd en ontkoppelen enzym zoals 1 mL trypsine toe te voegen.
- Incubeer bij 37 ° C totdat de cellen worden afgerond en beginnen om los te maken.
- Voeg 5 mL gestolde voedingsbodem aan de vrijstaande cellen en enzym deactiveren. De celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL en centrifuge voor 3 min op 300 x g. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cellen met kweekmedium.
- Met behulp van een hemocytometer en Trypan-blauw levensvatbare cellen te tellen.
- Zaad 5.0 x 105 cellen/putje van een 10-cm schotel in 10 mL van medium. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
- Gecombineerd het kweekmedium, wassen van de cellen met 5 mL PBS en voeg 10 mL van de zure kweekmedium bereid in sectie 1. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
3. RNA isolatie
- Gecombineerd kweekmedium en wassen van cellen met 5 mL PBS. Breek de cellen door RNA extractie reagens toe te voegen (Zie Tabellen van materialen).
- Schraap de schotel kort, dan verwijderen van het RNA extractie reagens met een pipet en storten de RNA extractie reagens/cel lysate in een 1,5 mL-buis. Laat bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg 250 µL chloroform en de buis goed schudden voor ongeveer 15 s. verlof bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifuge op ≥8, 000 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder voorzichtig de waterige fase met behulp van een precisiepipet. Laat achter een aantal van de waterige fase. Plaats in een andere 1,5 mL-buis.
- 550 µL isopropanol toevoegen aan de waterfase en meng voorzichtig. Laat bij kamertemperatuur voor 5 min. Centrifuge met maximale snelheid (≥20-, 000 x g) gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Giet af het isopropanol en voeg 1 mL 75% ethanol in DEPC behandeld water. Meng voorzichtig. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 5 min.
- Pipetteer af de ethanol en laat die de pellets drogen.
- Voeg dat ongeveer 15-25 µL (afhankelijk van de opbrengst) van DEPC water getrakteerd op de RNA-pellet. Meng grondig.
- Meten van de concentratie van geïsoleerde RNA door het meten van de OD op 260 nm met behulp van een spectrofotometer.
4. cDNA synthese
- De volgende onderdelen in een PCR reactiebuis combineren: maximaal 5 µg totaal RNA, 1 µL Oligo dT (50 µM) of willekeurige Primer Mix (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP en nuclease-gratis water tot een totaal volume van 14 µL.
- Meng en kort centrifugeren de onderdelen met behulp van een kleine benchtop centrifuge (~ 5 s). Denatureren van het monster RNA/primer gedurende 5 minuten bij 65 ° C. Kort draaien (~ 5 s) met behulp van een kleine benchtop centrifugeren en het monster snel op ijs voor minstens 1 min.
- De volgende onderdelen toe te voegen: 4 µL 5 x Reverse transcriptie buffer, 1 µL Reverse-Transcriptase (200 U/µL), 1 µL RNase remmer (40 U/µL).
Opmerking: Voorbeelden van commercieel beschikbare kits zijn weergegeven in Tabel van materialen - Dop van de tube, meng, en kort centrifugeren dan de inhoud met behulp van een kleine benchtop centrifuge (~ 5 s). Incubeer de gecombineerde reactiemengsel bij 50-55 ° C gedurende 10 minuten.
- Inactivering van de reactie door broeden bij 80 ° C gedurende 10 minuten.
5. meting van de zuur-responsieve genexpressie met behulp van PCR in real time
- De volgende onderdelen in een 384-well reactie plaat combineren: 1 µL sjabloon cDNA, 0,75 µL 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM vooruit primer, 0,3 µL 50 µM reverse primer, 1 µL polymerase Taq, 2.5 µL 10 x Taq polymerase buffer, 2.5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL water.
Opmerking: Voorbeeld van commercieel beschikbare kits zijn weergegeven in Tabel van materialen. Een lijst met inleidingen is weergegeven in tabel 1. Een reactie van de 96-wells-plaat kan ook worden gebruikt in deze stap. Andere sondes (b.v., Taqman sonde) kunnen ook worden gebruikt. - Opzetten van het experiment en de volgende PCR-programma op een Real-time PCR-systeem: 50 ° C gedurende 2 minuten, 1 cyclus; 95 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus; 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min, 40 cycli; 95 ° C gedurende 15 s, 1 cyclus; 60 ° C gedurende 15 s, 1 cyclus; 95 ° C gedurende 15 s, 1 cyclus.
- Plaats de plaat in de qPCR instrument. Start het programma.
Opmerking: Opregulatie van de pH responsieve genen MSMO1, INSIG1en IDI1 kunnen worden gemeten door eiwitniveaus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te bepalen van de juiste bicarbonaat concentratie, we DMEM voorbereid op een bereik van 0 - 8 mM NaHCO3 (eindconcentratie in het kweekmedium) en opgevolgd in het bereiden van voedingsbodems met pH variërend van 6.4-7.4 (Figuur 1). Wij DMEM met 8 mM NaHCO3 (pH 7.4) als een medium van de controle, en 2 mM NaHCO3 (pH 6,8) als een medium met een zure pH volgens een vorige rapport waarin staat dat de extracellulaire pH pH 6.8 voor stevige tumors4,5bereikt. De pH van het zure medium was opgelopen gedurende 24 uur, en geleidelijk verlaagd naar ongeveer pH 6.6 gedurende 72 uur tijdens de cultuur van de PANC-1 en AsPC-1 cellen (Figuur 2). Vervolgens, om te bepalen van het bedrag van lactaat of HCl moeten aanpassen van het besturingselement medium (pH 7.4) op een pH van 6.8, we verschillende hoeveelheden lactaat of HCl toegevoegd aan het besturingselement medium en gemeten van de pH van het medium, en vond dat de pH van het medium van de controle met een definitieve concentratio n van 22,5 µM lactaat en 6,25 mM HCl bereikt een waarde van 6,8 (Figuur 3).
Het effect van extracellulaire verzuring met behulp van een medium met lage pH kan gemakkelijk worden geëvalueerd op basis van opregulatie van zure pH-responsieve genen zoals MSMO1, IDI1en INSIG1. Uitdrukking van deze genen steeg sterk onder lage pH ten opzichte van hun uitdrukking onder hypoxie of nutriënten honger (Figuur 4). Bovendien, de opregulatie van deze genen niet specifiek naar een medium waarin de zure pH werd veroorzaakt door verminderde bicarbonaat niveaus was, en zij waren ook upregulated door een medium waarin zure pH werd veroorzaakt door de toevoeging van lactaat en/of HCl (Figuur 5). Vergelijking van cellulaire reacties op media waarin de zure pH is afgeleid van verminderde bicarbonaat niveaus of de toevoeging van lactaat of HCl laat ons toe om te bepalen als cellulaire reacties specifiek voor bepaalde soorten verzuring zijn. Opregulatie van zure pH verantwoordelijke genen zoals IDI1, MSMO1en INSIG1 onder de extracellulaire lage pH komt ook in normale cellen (Figuur 6), zodat onze methode kan worden toegepast op niet alleen de tumorcellen, maar ook de normale cellen. Onder hoge pH voorwaarde was het niveau van de expressie van genen die pH-verantwoordelijk niet upregulated in PANC-1 en AsPC-1 cellen (Figuur 7), die kunnen worden gebruikt als negatieve controle.
Figuur 1. Correlatie tussen NaHCO3 concentratie en middellange pH. Horizontale as toont concentratie van NaHCO3 en verticale as toont middellange pH bij 37 ° C onder 5% CO2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Verandering van middellange pH van lage-pH (pH 6.8) kweekmedium tijdens 72 h-cultuur. Middellange pH was opgelopen gedurende 24 uur en daalde geleidelijk gedurende 72 uur tijdens cultuur van PANC-1 en AsPC-1 cellen. 5.0 x 105 cellen werden uitgezaaid naar een 10-cm schotel in 10 mL van medium, 24u ge¨ uncubeerd en veranderd naar lage pH kweekmedium. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Correlatie tussen lactaat of HCl concentratie en pH van het medium. Het besturingselement medium (pH 7.4) is gebufferd met verschillende concentraties van lactaat of HCl. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Transcriptionele opregulatie van zure pH-responsieve genen in reactie op lage pH. Expressie niveau van MSMO1, IDI1en INSIG1 was hoger in PANC-1 en AsPC-1 cellen in het kader van lage pH (pH) dan uit hypoxie (H) of nutriënten honger (NS) voorwaarden na 24 h. gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Van de student t-tests werden uitgevoerd voor de aangegeven vergelijkingen. p < 0.005. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Transcriptionele opregulatie van zure pH-responsieve genen in reactie op melkzuur acidose en HCl-gemedieerde acidose. Uitdrukking van IDI1, MSMO1en INSIG1 mRNAs in PANC-1 cellen en cellen van de AsPC-1 werd bepaald door de kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie analyse onder controle (Con; pH 7.4), lage pH (pH, pH 6.8, verminderde hoeveelheid NaHCO3 ), melkzuur acidose (lactaat; pH 6.8, verhoogde lactaat hoeveelheid), en HCl-gemedieerde acidose (HCl, pH 6.8, verhoogd bedrag van HCl) voorwaarden voor 24 h. gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Van de student t-tests werden uitgevoerd voor de aangegeven vergelijkingen. p < 0.005. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Transcriptionele opregulatie van zure pH-responsieve genen in reactie op de lage pH in normale cellen. Expressie niveau van MSMO1, IDI1en INSIG1 was upregulated in de fibroblastic KMS-6, TIG, en MRC9 cellen en endotheliale cellen van de HUVEC na 24 h. gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Van de student t-tests werden uitgevoerd voor de aangegeven vergelijkingen. p < 0.005. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. Expressie niveau van zure pH-verantwoordelijke genen onder hoge pH (pH 7,6 tot 8,0) voorwaarde in vergelijking onder lage pH (pH 6.8). Het niveau van de expressie van pH-verantwoordelijke genen zoals IDI1, MSMO1en INSIG1 blijft ongewijzigd onder hoge pH (pH 7,6 tot 8,0) omstandigheden in PANC-1 en AsPC-1 cellen na 24 h. gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Primer | Voorwaartse primer volgorde | Primer | Omgekeerde pimer reeks | ||
| ACTB | 5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3' | ACTB | 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' | ||
| MSMO1 | 5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3' | MSMO1 | 5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3' | ||
| INSIG1 | 5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3' | INSIG1 | 5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3 ' | ||
| IDI1 | 5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3' | IDI1 | 5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3' | ||
Tabel 1. Lijst van inleidingen gebruikt in kwantitatieve real-time PCR analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschreven hier, een eenvoudige zure pH cultuur systeem en het evaluatieproces. De combinatie van drie methoden voor middelgrote verzuring, dat wil zeggen, verminderde bicarbonaat concentratie, lactaat toevoeging en HCl toevoeging, konden we het pH-response-mechanisme grondig onderzoeken en vergelijken van de cellulaire reactie op andere tumor microenvironmental voorwaarden zoals hypoxie of nutriënt honger.
De sleutel van deze methode is het bepalen van de juiste concentraties van bicarbonaat, lactaat en HCl in het kweekmedium. Meten van de middellange pH met verschillende concentraties van de bicarbonaat bij het uitvoeren van deze methode voor het eerst is belangrijk om te bepalen van de juiste hoeveelheid NaHCO3 in het medium. Tijdens dit proces, het is noodzakelijk dat de middellange pH wordt gemeten na 24 uur incubatie bij 37 ° C minder dan 5% CO2, als medium temperatuur en evenwicht status van CO2 grote invloed hebben op de middellange pH. Autoclaaf van bicarbonaat wordt vaak aangeraden, naarmate bicarbonaat gemakkelijk plat. Celdichtheid en cel confluentie zijn cruciale factoren omdat grote aantallen groeiende kankercellen Breng gemakkelijk het kweekmedium zelfs in controlemonsters. Daarnaast reacties op de extracellulaire zure pH afhankelijk van de conditie van de cellen en kunnen vervagen als cellen zijn gepasseerd, dus de cellen met minder dan 10 passages werden gebruikt voor de experimenten.
Onze methode is aanzienlijk aangetoond van de stabiliteit van middellange pH gedurende 24 uur en ten opzichte van verschillende media van de zure pH. In dit protocol, werd middellange pH van 6,8 gebruikt als een lage pH voorwaarde, maar de seriële zure pH tussen pH 6.4 en 6.9, naast seriële fundamentele pH media tussen pH 7.4 en 8.0, werden gebruikt om de cellulaire reactie tegen de verzuring van de extracellulaire onderzoeken.
We voornamelijk gericht op kankercellen, maar deze methode kan worden gebruikt voor andere soorten cellen in de tumor-communicatie, met inbegrip van stromale cellen, immune cellen en vasculaire endotheliale cellen. Wij en anderen gemeld dat op zijn minst enige pH gevoelig mechanismen in kankercellen gebruikelijk in normale cellen7 zijn. Het is ook mogelijk deze methode voor de analyse van andere primaire cellen alsmede embryonale stamcellen toe te passen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Een beperking van deze cultuur-systeem zou de moeilijkheid van het handhaven van de voorwaarde van de zure pH in experimenten op lange termijn.
Acidose wordt geassocieerd met verschillende soorten ziekten. Deze methode kan gelden niet alleen in kankeronderzoek maar ook bij het bestuderen van zure aandoeningen zoals diabetische ketoacidose, renale tubulaire acidose en respiratoire acidose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur Ayano Kondo is een medewerker van Mizuho Securities Kirin Co., Ltd.
Acknowledgments
Wij danken de leden van de afdeling of genoom Science en laboratorium voor systeembiologie en geneeskunde, RCAST, de Universiteit van Tokio. Wij bedanken met name Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida, en Dr. A.
Kunisato (Mizuho Securities Kirin Co., Ltd.) voor nuttige discussies en steun. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Grant-in-Aid voor jonge wetenschapper (A) (26710005), to, Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (26116711 en 16 H 01567, to), en Grant-in-Aid voor uitdagend
Verkennend onderzoek (16K 14605, to) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan, de Takeda Science Foundation (to), de Stichting Kobayashi van kankeronderzoek (to) en het Project voor kankeronderzoek en Therapeutische Evolution (P-maken) en de praktische onderzoek voor innovatieve kankerbestrijding van Japan Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling, AMED (to).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
