我们提出了从体内组织和体外基底基质 organoids 分离肠道3D 结构的协议, 并详细介绍了针对微管免疫标记优化的不同固定和染色方案,中心, 和连接蛋白以及细胞标记包括干细胞蛋白 Lgr5。
3D体外organoids 的出现, 模仿体内组织结构和形态发生, 极大地提高了研究细胞和发育生物学关键生物学问题的能力。此外, organoids 与最近基因编辑和病毒基因递送技术的进步一起, 有望推动医学研究和开发新的治疗疾病的药物。Organoids 生长的体外基底基质为研究各种蛋白质的行为和功能提供了强大的模型系统, 非常适合荧光标记蛋白的活体成像。但是, 在 体外组织中建立内源性蛋白的表达和定位, 并在 organoids 中, 对标记蛋白的行为进行验证是很重要的。为此, 我们已经开发和修改了组织隔离, 固定和免疫标记协议的微管, 中心, 和相关的蛋白在前体肠道组织和在外肠道 organoids。其目的是保存 organoids/组织的3D 体系结构, 同时保持抗体的抗原性, 使固定剂和抗体有良好的穿透和清除能力。接触冷聚所有但稳定的微管, 这是一个关键因素时, 修改各种协议。我们发现, 增加乙酸酸 (edta) 的浓度从3毫米到30毫米提供了有效的剥离绒毛和棺在小肠, 而3毫米 edta 是足够的结肠棺。开发的甲醛/甲醇固定协议给予了很好的结构保存, 同时也保持了抗原性的有效标记微管, 肌动蛋白, 和末端结合 (EB) 蛋白。它也工作的中心蛋白 ninein, 虽然甲醇协议的工作更一致。我们进一步证实, 微管和相关蛋白的固定和免疫标记可以通过基底基质中的 organoids 分离或保持。
上皮的形成与 apico-基底极性是一个基本的过程中的发展和涉及戏剧性重组的微管和中心蛋白。一个径向微管阵列从中央位于中心微管组织中心 (MTOC) 是突出的许多动物细胞, 这是非常适合于相对平坦的细胞。相比之下, 柱状上皮细胞, 如小肠, 聚集径向 transcellular 微管阵列, 更好地支持这些细胞的形状和专门功能。微管的这戏剧性的整顿达到由中心移动到尖顶和顶端 non-centrosomal MTOCs (n-MTOCs) 形成, 变得负责任为 transcellular 微管的锚地1,2,3,4,5。
我们对上皮分化和相关微管重组的认识大多来自于对不显示体内组织结构的 2D体外细胞层的调查。开发 3D在体外化文化, 由 Clevers 和同事6的先驱, 代表了一个主要的技术进步, 因为他们模仿在体内体系结构和开发。上皮分化的层次在肠道明显;在棺底部的干细胞会产生未成熟的转运增殖细胞, 随着它们迁移到小的小肠绒毛或结肠表面而逐渐分化, 它们在被流进流明7。重要的是, 这是复制在肠道 organoids, 细胞从干细胞利基增殖形成囊肿, 随后产生地穴状芽与干细胞在底部和分化逐渐走向囊肿区,它变得绒毛象8。肠道化因此代表了一个强大的模型, 不仅研究在上皮分化过程中的微管和中心重组, 但许多其他蛋白质, 以及提供一个理想的平台, 筛选药物和食品潜在的治疗优势化合物9,10。
Organoids 非常适合荧光标记蛋白质的实时成像, 基因和淘汰赛 Organoids 都可以使用 CRISPR/Cas9 基因编辑11,12生成。然而, 建立内源性蛋白质的表达和定位是非常重要的, 特别是对标记蛋白的行为进行验证。免疫标记 3D organoids 生长在基底基质或前体孤立组织比细胞生长在培养皿中的2D 更复杂。固定的协议需要保存 organoids 的微妙的3D 结构, 同时保持抗体抗原性 (即, 结合抗体的表位)。例如, 4% 甲醛 (粉煤灰) 通常用作固定剂, 但它是一个相对快速的行动固色剂, 并提供良好的形态学保存, 在我们的经验, 它经常导致丧失抗原性和不适合许多中心抗体。还应考虑固定剂和抗体穿透3D 结构和组织的能力。为此, 我们修改和开发了 3D体外组织隔离和间接免疫标记的协议 organoids 和前体内孤立的肠道组织。我们描述了如何隔离小肠棺和绒毛和结肠组织, 并包括一个协议隔离 3D organoids 作为替代固定和免疫标记在地下室矩阵。我们提出了三种替代固定协议的免疫标记的微管和中心蛋白, 如 ninein, 和微管加尾跟踪蛋白 (+ 提示), 如 EB 蛋白和 CLIP-170 (请参阅参考8, 13)。我们还讨论了与每个协议相关的优缺点。
肠道组织的分离
小肠棺和绒毛和结肠棺的分离包括暴露粘膜表面, 用 EDTA 溶液处理以松弛细胞接触、分馏 (摇动) 和离心。Belshaw et al.和白石et al.对所提出的肠绒毛/隐窝隔离协议进行了修改17,18
暴露粘膜表面
我们已经尝试了一些方法, 以揭露粘膜表面的肠道在这一过程的发展。一个经典的方法是埃弗特 (转内) 管, 通常在段约100毫米长, 使用一个金属棒, 被捕获在一个折叠的组织在一端, 然后其余的管滑过管19。对于小鼠组织, 一个金属棒 (2.4 毫米直径) 与圆的末端是理想的。这种方法有利于扩大黏膜表面, 从而更好地获得 PBS 和 EDTA。我们最初使用这种方法, 但移动到切割管成短长度 (约5厘米), 并打开每个部分与解剖剪刀, 这证明更容易。这种方法是适当的, 如果只有几个肠道是必需的;但是, 如果在实验中使用更多的动物, 那么一个 purpose-built 的装置可以纵向切开管子, 如 Yoneda 的et al.所描述的那样。14将更有效。
绒毛和棺脱离肌肉层
最初, 我们使用3毫米 EDTA 在 PBS 和相对较长的孵化时间长达60分钟, 以放宽黏膜表面的基础组织17,18。在这种浓度的 EDTA, 我们发现潜伏期为30分钟, 足以松开棺从老鼠结肠。然而, 对于小肠隐窝/绒毛隔离, 我们尝试使用更多的浓缩 EDTA 较短的时间, 这证明是一种有效的方法。所有后续的工作都是用30毫米 EDTA 技术提取的组织进行的, 它们产生了绒毛或棺的相关分数。对于棺, 我们通常汇集分数 3-5 前固定, 但重要的是要检查这些是适当的分数, 因为计时将取决于一些因素, 如沿肠道的位置, 老鼠的年龄, 炎症, 以前的饮食,等同样, 在不同条件下, 在 EDTA 治疗后, 组织需要动摇的时间长短可能会有所不同。结果是含有绒毛和棺的混合物的分离组织片段, 或者主要是绒毛或棺 (图 2)。由于在结肠中没有绒毛, 因此, 在三十年代, 通过在试管中晃动组织, 可以在一步内实现隐窝提取。这些分数可以被固定和处理免疫标记。
基底基质对肠道 organoids 的分离
利用单元恢复解, 可以实现基底 organoids 的分离。该解决方案的工作原理是聚凝胶基底基体, 但温度需要 2-8 ° c。提醒注意的是, 动态微管可能不会被保存。因此, 对于动态微管的免疫标记和 + 提示, 如 EBs 细胞, 不推荐在固定前从基底基质中恢复。然而, 大多数的微管在区分化细胞是相对稳定的, 这些都被保存 (图 6)。它还有效地用于免疫标记中心和连接蛋白以及细胞标记。
固定协议
甲醛 (新鲜地由粉煤灰制成) 是一种相对快速的作用的固定剂, 形成可逆的交和4% 粉煤灰工作良好, 例如, 在免疫标记微管和伽玛蛋白和染色肌动蛋白丝与笔。更稀的粉煤灰解决方案, 如1% 工作良好的免疫标记, 例如, 与干细胞标记 Lgr5 和氏细胞标记 CD24 内的地穴干细胞利基, 而高浓度的粉煤灰没有工作。
戊二醛的加入更好地保存微管和所谓的 PHEMO 固定, 由3.7% 煤灰、0.05% 戊二醛和0.5% 洗涤剂的混合物组成在 PHEMO 缓冲 (68 毫米管子、25毫米 HEPES、15毫米 EGTA 和3毫米 MgCl2)2在不损害抗原性的情况下保护微管的优异。它也适用于免疫标记伽玛蛋白, β-蛋白, 和 e-钙黏附素, 和染色肌动蛋白丝与笔。然而, 在3D 组织和化的文化, PHEMO 固定产生不一致的结果, 因此没有使用。
甲醇是一种混凝剂固定剂, 具有较好的穿透力, 并易于保存抗原。固定与100% 甲醇 (-20 ° c) 引入了一些收缩, 给予适度的形态学保存, 和工作的微管, + 提示, 和许多中心抗体, 包括 ninein 在2D 细胞培养。然而, 在使用这种固定方法时, 有些 organoids 塌陷。此外, 通过整个棺, 绒毛, 或 organoids 的抗体渗透最初是一个问题, 但添加0.1% 洗涤剂的洗涤液和长期洗涤取得了更好的结果。
以前罗杰斯et al.使用了甲醛和甲醇的组合20到果蝇中的免疫标签 EB1 .因此, 一种基于甲醛和甲醇混合物的固定协议是基于3% 甲醛和97% 甲醇冷冻到-20 ° c 的肠道组织和 organoids, 但从罗杰斯使用的混合物中省略了5毫米碳酸钠et al。20此外, 在-20 ° c 的冷冻库中, 样品被固定。这特别适合免疫标记 + 提示, 如 CLIP-170 和 EBs, 但也证明了优良的固定和免疫标记微管和肌动蛋白在组织和 3D organoids。非常好结构保存是明显的, 并且抗原化保留了为几个骨架和伴生的蛋白质并且中心蛋白质例如伽玛蛋白并且 ninein, 虽然标号为 ninein 更加一致地使用甲醇固定.
The authors have nothing to disclose.
作者感谢保罗托马斯显微镜的意见和帮助。这里所涉及的这项工作得到了 BBSRC (格兰特号) 的支持。BB/J009040/1 到 M.M.M. 和 t.w)。
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |