Vi presenterar protokoll för isolering av intestinal 3D-strukturer från i vivo vävnad och in vitro- källaren matrix inbäddade organoids, och detalj olika fixering och färgprotokoll optimerad för immuno-märkning av mikrotubuli, centrosomal och Junktional proteiner samt som cell markörer inklusive stamceller proteinet Lgr5.
Tillkomsten av 3D i vitro organoids som efterliknar i vivo vävnad arkitektur och morfogenes har mycket avancerade förmågan att studera biologiska nyckelfrågor i cell- och utvecklingsbiologi. Organoids tillsammans med senaste tekniska framsteg i gen redigering och viral genen leverans lovar dessutom att främja medicinsk forskning och utveckling av nya läkemedel för behandling av sjukdomar. Organoids odlas i vitro i källaren matris ger kraftfull modellsystem för att studera beteende och funktion av olika proteiner och är väl lämpade för live-imaging av lysrör-märkta proteiner. Om inrättande av uttryck och lokalisering av endogena proteiner i ex vivo vävnad och i in vitro- är organoids dock viktigt att kontrollera beteendet hos de märkta proteinerna. För detta ändamål har vi utvecklat och ändrade vävnad isolering, fixering och immuno-märkning protokoll för lokalisering av mikrotubuli, centrosomal och associerade proteiner i Tarmvävnaden ex vivo och in vitro- intestinal organoids. Syftet var för fixeringsvätskan att bevara 3D arkitekturen av organoids/vävnad samtidigt bevara antikropp antigenicitet och möjliggör god inträngning och clearance av fixativ och antikroppar. Exponering för kyla depolymerizes alla utom stabil mikrotubuli och detta var en viktig faktor när du ändrar de olika protokollen. Vi hittade att öka den etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syrakoncentration från 3 mM till 30 mM gav effektiv avlossning av villi och kryptor i tunntarmen medan 3 mM EDTA räckte för kolon kryptor. Utvecklade formaldehyd/metanol fixering protokollet gav mycket bra strukturella bevarande samtidigt bevara antigenicitet för effektiv märkning av mikrotubuli, aktin och slutet-bindande (EB) proteinerna. Det fungerade också för den centrosomal protein ninein även om protokollet metanol arbetat mer konsekvent. Vi etablerat ytterligare att fixering och immuno-märkning av mikrotubuli och associerade proteiner skulle kunna uppnås med organoids isoleras från eller återstående inom matrisen källare.
Bildandet av epitel med apico-basal polariteten är en grundläggande process i utvecklingen och innebär en dramatisk omorganisation av mikrotubuli och centrosomal proteiner. En radiell mikrotubulära matris som härrör från ett centralt centrosomal mikrotubuli organisera center (MTOC) är framträdande i många djurceller och detta är väl lämpad för relativt platt celler. Däremot montera columnar epitelceller, som de i tarmen, icke-radiell transcellular mikrotubuli matriser som bättre stöder form och specialiserade funktioner av dessa celler. Denna dramatiska omorganisering av mikrotubuli uppnås genom den centrosome flyttar till apex och apikala icke-centrosomal MTOCs (n-MTOCs) bildar, som blir ansvarig för förankring av transcellular mikrotubuli1,2 , 3 , 4 , 5.
Mycket av vår kunskap om epitelial differentiering och associerade mikrotubulära omorganiseringen har kommit från utredningar av 2D i vitro cell lager som inte visas i vivo vävnad arkitekturen. Utveckling av 3D i vitro organoid kulturer, uppfunnen av Clevers och medarbetare6, representerar en stora tekniska framsteg som de härmar i vivo arkitektur och utveckling. En hierarki av epitelial differentiering är uppenbart i tarmen; stamceller längst ned i kryptor ge upphov till omogna transit förstärkande cellerna att föröka sig och differentiera gradvis när de vandrar upp kryptan till små intestinal villus eller kolon yta, där de blivit fullt differentierade innan kasta in i lumen7. Allt replikeras detta i intestinal organoids där celler från stamcellsnischen föröka bildar cystor som därefter genererar crypt-liknande knoppar med stamceller i botten och differentiering gradvis utvecklas mot regionen cysta, som blir villus-liknande8. Den intestinala organoid utgör därför en kraftfull modell för att studera inte bara mikrotubuli och centrosomal omorganisation under epitelial differentiering men ett flertal andra proteiner, samt att ge en idealisk plattform för screening av läkemedel och livsmedel föreningar av potentiella terapeutiska fördelar9,10.
Organoids är väl lämpade för live-imaging av lysrör-märkta proteiner och båda inpressning och knock-out organoids kan genereras med hjälp av CRISPR/Cas9 gen redigering11,12. Det är dock viktigt, särskilt för att kontrollera beteendet hos de märkta proteinerna om upprättandet av uttryck och lokalisering av endogena proteiner studeras. Immuno-märkning 3D organoids odlas i källaren matris eller ex vivo isolerade vävnad är mer komplex än celler odlade i kultur rätter i 2D. Fixering protokollet behöver bevara ömtåliga 3D arkitekturen av organoids men ändå bevara antikropp antigenicitet (dvs, epitoper för bindande antikroppar). Exempelvis 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) används ofta som ett fixativ men samtidigt som det är en relativt snabb agerar fixativ och ger bra morfologiska bevarande, i vår erfarenhet det ofta resulterar i förlust av antigenicitet och lämpar sig inte för många centrosomal antikroppar. De fixativ och antikroppar förmåga att penetrera 3D-strukturer och vävnader bör också övervägas. I detta syfte vi har ändrat och utvecklat protokoll för vävnad isolering och indirekta immuno-märkning av 3D in vitro- organoids och ex vivo isolerad Tarmvävnaden. Vi beskriver hur man isolera små intestinal kryptor och villi och colonic vävnad, och inkluderar ett protokoll för isoleringen av 3D organoids som ett alternativ till fastställande och immuno-märkning inom matrisen källare. Vi presenterar tre alternativa fixering protokoll för immuno-märkning av mikrotubuli och centrosomal proteiner, såsom ninein, och mikrotubuli plus-end spårning proteiner (+ TIPs), såsom EB proteiner och klipp-170 (se även referenser8, 13). Vi diskuterar också för- och nackdelar som är associerad med varje protokoll.
Isolering av Tarmvävnaden
Isolering av små intestinal kryptor och villi och colonic kryptor innebär att utsätta slemhinneepitel, behandling med EDTA-lösningen att lossa Cellkontakter, fraktionering (skakningar) och centrifugering. Presenterade tarmens villi/crypt isolering protokoll har ändrats från Belshaw et al. och Whitehead o.a. 17 , 18
Utsätta slemhinneepitel
Vi har experimenterat med ett antal metoder att exponera slemhinneepitel av tarmkanalen i utvecklingen av detta förfarande. En klassisk metod är att evert (vänd avig) röret, vanligen i segment ca 100 mm lång, med en metallstav som fångas i ett veck av vävnad i ena änden och sedan återstående röret gled över tube19. För musen vävnad är en metallstav (2,4 mm diameter) med rundade ändar perfekt. Denna metod har fördelen att utvidga slemhinneepitel ger bättre tillgång till PBS och EDTA. Vi använde denna metod inledningsvis men flyttade till skär röret i korta längder (ca 5 cm) och öppna varje avsnitt med dissekera saxen som detta visade sig vara lättare. Detta tillvägagångssätt är lämpligt om bara några tarmar är obligatoriskt. men om fler djur skulle vara används i ett experiment då en specialbyggda enhet för styckning öppna röret längdriktningen, som beskrivs av Yoneda o.a. 14 skulle vara effektivare.
Avlossning av villi och kryptor från muskellagrar
Inledningsvis använde vi 3 mM EDTA i PBS och relativt långa inkubationstider upp till 60 min för att lossa slemhinneepitel från underliggande vävnad17,18. Vid denna koncentration av EDTA hittade vi en inkubationstid av 30 min var tillräcklig för att lossa kryptor från musen kolon. Dock för tunntarmen crypt/villus isolering provat vi att använda mer koncentrerad EDTA under en kortare tid, vilket visade sig vara en effektiv strategi. Alla efterföljande arbete genomfördes med vävnad som utvinns med hjälp av 30 mM EDTA tekniken genererar relevanta fraktioner för villi eller kryptor. För kryptor, vi poolade normalt fraktionerna 3-5 innan fastställande men det är viktigt att kontrollera om dessa är lämpliga fraktioner eftersom tiderna beror på ett antal faktorer såsom position längs tarmkanalen, ålder mus, inflammation, tidigare kost , etc. på samma sätt hur länge vävnaden behöver skakas efter EDTA behandling vara effektivt kan variera under olika förhållanden. Resultatet är isolerade vävnad fraktioner innehållande en blandning av villi och kryptor eller huvudsakligen antingen villi eller kryptor (figur 2). Eftersom det finns ingen villi i kolon, crypt utvinning kan vara genomförbara i ett steg genom att skaka vävnaden i röret för 30 s. Dessa fraktioner kan sedan fastställas och bearbetas för immuno-märkning.
Isolering av intestinal organoids från källaren matris
Isolering av organoids från källaren matrix kupoler kan uppnås med hjälp av cell återställningslösning. Lösningen fungerar av depolymerizing matrisen geléartad källaren men den temperatur måste vara 2-8 ° C. Ett varningens är att dynamiska mikrotubuli inte kan bevaras. Således, för immuno-märkning av dynamiska mikrotubuli och + TIPs såsom cellen EBs, återhämtning från källaren matris före fixering rekommenderas inte. Men de flesta av mikrotubuli i särskiljande organoid cellerna är relativt stabil och dessa bevarades (figur 6). Det fungerade också bra för immuno-märkning av centrosomal och Junktional proteiner som cellen markörer.
Fixering-protokoll
Formaldehyd (nygjorda från PFA) är en relativt snabbverkande fixativ som bildar vändbar cross-links och 4% PFA fungerar bra för exempelvis immuno-märkning mikrotubuli och gamma-tubulin och färgning aktin filament med Phalloidin. Mer späd PFA lösningar såsom 1% fungerade bra för immuno-märkning till exempel med stamceller markörer Lgr5 och Paneth cell markören CD24 inom crypt stamcellsnischen, medan högre koncentrationer av PFA inte fungerade.
Tillsats av glutaraldehyd ger bättre bevarande av mikrotubuli och den så kallade PHEMO fixering som består av en blandning av 3,7% PFA, 0,05% glutaraldehyd och 0,5% tvättmedel i PHEMO buffert (68 mM rör, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA och 3 mM MgCl2)2 ger utmärkt bevarandet av mikrotubuli utan att kompromissa med antigenicitet. Det fungerar också bra för immuno-märkning gamma-tubulin, β-catenin, och E-cadherin och färgning aktin filament med phalloidin. Dock i 3D vävnad och organoid kulturer, PHEMO fixering produceras inkonsekventa resultat och användes därför inte.
Metanol är ett koaguleringsmedel fixativ som ger relativt bra penetration och tenderar att bevara antigenicitet. Fixering med 100% metanol (-20 ° C) införs vissa krympning, ger måttlig morfologi bevarande och fungerar för mikrotubuli, + TIPs och många centrosomal antikroppar inklusive ninein i 2D cellkulturer. Dock vissa organoids kollapsade när du använder denna metod för fixering. Dessutom penetration av antikroppar genom hela kryptor, villi eller organoids var från början ett problem utan tillsats av 0,1% tvättmedel till tvättlösning och långvarig tvättning uppnått bättre resultat.
En kombination av formaldehyd och metanol hade tidigare använts av Rogers et al. 20 till immuno-etikett EB1 i Drosophila. En fixering protokollet baserat på en blandning av formaldehyd och metanol har därför utvecklats för Tarmvävnaden och organoids baserat på 3% formaldehyd och 97% metanol kylas ned till-20 ° C, men utelämna 5 mM natriumkarbonat från blandningen som användes av Rogers et al. 20 dessutom prover var fast i frysen vid-20 ° C. Detta fungerat särskilt väl för immuno-märkning + TIPs, såsom klipp-170 och EBs, men också visat sig vara utmärkt för fastställande och immuno-märkning mikrotubuli och aktin inom vävnad och 3D organoids. Mycket bra strukturella konservering var uppenbar och antigenicitet bevarades för flera cytoskeletal och associerade proteiner samt centrosomal proteiner såsom gamma-tubulin och ninein, även om märkning för ninein arbetade mer konsekvent med metanol fixering.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Paul Thomas om Mikroskop råd och stöd. Detta arbete inblandade här stöddes av BBSRC (bevilja nr. BB/J009040/1 till M.M.M. och T.W.).
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |