Vi præsenterer protokoller til isolation af intestinal 3D strukturer fra væv i vivo og in vitro- kælderen matrix indlejret organoids, og detaljer forskellige fiksering og farvning protokoller optimeret til immuno-mærkning af mikrotubulus, centrosomal og junctional proteiner samt som celle markører herunder stamceller protein Lgr5.
Fremkomsten af 3D in vitro- organoids, der efterligner i vivo væv arkitektur og morfogenese har meget avanceret mulighed for at undersøge biologiske nøglespørgsmål i celle og udviklingsmæssige biologi. Derudover lover organoids sammen med de seneste tekniske fremskridt i gen redigering og virale gen levering at fremme medicinsk forskning og udvikling af nye lægemidler til behandling af sygdomme. Organoids dyrkes in vitro- i kælderen matrix giver kraftfuld modelsystemer til at studere adfærd og funktion af forskellige proteiner og er velegnet til live-imaging af mærket fluorescerende proteiner. Men om oprettelse af udtryk og lokalisering af de endogene proteiner i ex vivo væv og i in vitro- organoids er vigtigt at kontrollere funktionsmåden for de mærkede proteiner. Til dette formål har vi udviklet og ændret væv isolation, fiksering og immuno-mærkning protokoller for lokalisering af mikrotubuli, centrosomal og tilknyttede proteiner i ex vivo tarmens væv og i in vitro- tarm organoids. Målet var for fiksativ at bevare 3D arkitekturen i organoids/væv samtidig bevare antistof antigenicity og giver god penetration og clearance af fiksativ og antistoffer. Udsættelse for kulde depolymerizes alle, men stabil mikrotubuli og dette var en vigtig faktor, når du ændrer de forskellige protokoller. Vi konstaterede, at øge den ethylendiamintetra syre (EDTA) koncentration fra 3 mM til 30 mM gav effektiv udstationering af villi og Krypter i tyndtarmen, mens 3 mM EDTA var tilstrækkelig for Colon Krypter. Udviklede formaldehyd/metanol fiksering protokol gav meget god strukturel bevarelse samtidig også bevare antigenicity for effektiv mærkning af mikrotubuli, aktin og ende-bindende (EB) proteiner. Det arbejdede også for centrosomal protein ninein selv om methanol protokol arbejdede mere konsekvent. Vi etableret yderligere, at fiksering og immuno-mærkning af mikrotubuli og tilknyttede proteiner kan opnås med organoids isoleret fra eller resterende inden for matrixen kælder.
Dannelsen af epitheler med apico-basal polaritet er en grundlæggende proces i udvikling og indebærer en dramatisk reorganisation af mikrotubuli og centrosomal proteiner. En radial mikrotubulus array fra en centralt beliggende centrosomal mikrotubulusorganiserende center (MTOC) er fremtrædende i mange animalske celler og dette er velegnet til relativt flade celler. Derimod samle kolonneformat epitel celler, som de i tarmen, ikke-radial transcellular mikrotubulus arrays, der bedre understøtter den form og specialiserede funktioner af disse celler. Denne dramatiske reorganisering af mikrotubuli er opnået ved at centrosome flytter til apex og apikale ikke-centrosomal MTOC (n-MTOC) danner, der bliver ansvarlig for forankring af transcellular mikrotubuler1,2 , 3 , 4 , 5.
Meget af vores viden om epitelial differentiering og tilknyttede mikrotubulus reorganisering er kommet fra undersøgelser af 2D i vitro cellelag, der ikke vises i vivo væv arkitektur. Udvikling af 3D in vitro- organoid kulturer, pioner af Clevers og co-arbejdere6, repræsenterer et stort teknologisk fremskridt, da de efterligner i vivo arkitektur og udvikling. Et hierarki af epitel differentiering er tydelig i tarmen; stamceller i bunden af Krypter give anledning til umodne transit forstærke celler, som formere sig og differentiere efterhånden som de vandrer op krypten ind på den lille tarm villus eller Colon overflade, hvor de bliver fuldt differentierede inden kaste ind i lumen7. Vigtigere, er dette gentaget i tarm organoids hvor celler fra stamceller niche formere danner cyster, der efterfølgende genererer krypt-lignende knopper med stamceller i bunden og differentiering gradvist fremskridt i retning af regionen cyste der bliver villus-lignende8. Den intestinale organoid udgør derfor en kraftfuld model til at studere ikke blot mikrotubulus og centrosomal reorganisering under epithelial differentiering, men mange andre proteiner samt giver en ideel platform for screening af medicin og mad forbindelser af potentielle terapeutiske fordele9,10.
Organoids er velegnet til live-imaging af fluorescerende-tagged proteiner samt både knock- og knock-out organoids kan genereres ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering11,12. Men de udtryk og lokalisering af de endogene proteiner til at blive undersøgt er vigtigt, især for at kontrollere funktionsmåden for de mærkede proteiner. Immuno-mærkning 3D organoids dyrkes i kælderen matrix eller ex vivo isoleret væv er mere komplekse end celler dyrkes i kultur retter i 2D. Fiksering protokol skal bevare den sarte 3D arkitektur af organoids samtidig stadig bevare antistof antigenicity (dvs., epitoper for bindende antistoffer). For eksempel, 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) er almindeligt anvendt som fiksativ, men mens det er relativt hurtig virkende fiksativ og giver gode morfologiske bevarelse, vores erfaring det ofte resulterer i tab af antigenicity og er ikke egnet til mange centrosomal antistoffer. Fiksativ og antistoffer evne til at trænge ind i 3D strukturer og væv bør også overvejes. Vi har ændret herpå, og udviklede protokoller for væv isolation og indirekte immuno-mærkning af 3D in vitro- organoids og ex vivo isoleret tarmens væv. Vi beskriver, hvordan du isolere lille tarm krypter og villi og Colon væv, og omfatter en protokol til isolation af 3D organoids som et alternativ til fastsættelse og immuno-mærkning inden for matrixen kælder. Vi præsenterer tre alternative fiksering protokoller for immuno-mærkning af mikrotubuli og centrosomal proteiner, såsom ninein, og mikrotubulus plus-ende tracking proteiner (+ TIPs), såsom EB proteiner og klip-170 (Se også referencer8, 13). Vi også diskutere fordele og ulemper knyttet til hver protokol.
Isolering af tarmens væv
Isolering af lille tarm krypter og villi og Colon Krypter indebærer udsætter slimhinden, behandling med EDTA-oploesning til at løsne celle kontakter, fraktionering (ryste) og centrifugering. Præsenteres intestinal villi/krypt isolation protokol er blevet ændret fra Belshaw et al. og Whitehead et al. 17 , 18
Udsætter slimhinden
Vi har eksperimenteret med en række tilgange til at eksponere slimhinden i tarmkanalen i udviklingen af denne procedure. En klassisk metode er at evert (turn indefra og ud) rør, normalt i segmenter cirka 100 mm lange, ved hjælp af en metalstang, der er fanget i en fold af væv på ene ende og derefter de resterende rør gled over tube19. Beliggenheden er perfekt til musen væv, en metalstang (2,4 mm i diameter) med afrundede ender. Denne fremgangsmåde har fordelen at udvide slimhinden giver bedre adgang til PBS og EDTA. Vi oprindeligt anvendt denne fremgangsmåde men flyttede til skæring af rør i korte længder (ca. 5 cm) og åbne hver sektion med dissekere saks, da dette viste sig lettere. Denne tilgang er passende, hvis kun et par tarmene er påkrævet; men hvis flere dyr skulle være brugt i et eksperiment derefter en specialbyggede enhed til skære åbne røret på langs, som beskrevet af Yoneda et al. 14 ville være mere effektiv.
Udstationering af villi og Krypter fra muskel lag
I begyndelsen brugte vi 3 mM EDTA i PBS og forholdsvis lang inkubationstid gange på op til 60 min. for at løsne slimhinden fra det underliggende væv17,18. Ved denne koncentration af EDTA fandt vi en inkubationstiden på 30 min. var tilstrækkelig til at løsne Krypter fra mus kolon. Dog til tyndtarmen crypt/villus isolering prøvet vi at bruge mere koncentreret EDTA i kortere tid, som viste sig for at være en effektiv fremgangsmåde. Alle efterfølgende arbejde blev udført med væv udvundet ved hjælp af 30 mM EDTA teknik generere relevante fraktioner til villi eller Krypter. For Krypter, vi samles normalt fraktioner 3-5 før fastsættelse af men det er vigtigt at kontrollere, om disse er de passende fraktioner, som tider vil afhænge af en række faktorer såsom placering langs tarmkanalen, alder af musen, betændelse, tidligere kost , etc. ligeledes længden af tid, vævet skal blive rystet efter EDTA behandlingen være effektiv kan variere under forskellige betingelser. Resultatet er isoleret væv fraktioner der indeholder en blanding af villi og Krypter eller hovedsagelig enten villi eller crypts (figur 2). Da der er ingen villi i tyktarmen, krypt udvinding kan være opnåelige i ét trin ved at ryste væv i røret til 30 s. Disse fraktioner kan derefter fast og forarbejdet til immuno-mærkning.
Isolering af tarm organoids fra kælderen matrix
Isolering af organoids fra kælderen matrix kupler kan opnås ved hjælp af celle opsving løsning. Løsningen virker ved depolymerizing geléagtig kælderen matrix, men temperaturen skal være 2-8 ° C. Et notat af forsigtighed er, at dynamiske mikrotubuli ikke kan bevares. Således, for immuno-mærkning af dynamiske mikrotubuli og + TIPs som cellen EBs, recovery fra kælderen matrix før fiksering anbefales ikke. Men de fleste af mikrotubuli i differentiering organoid cellerne er relativt stabile og disse blev bevaret (figur 6). Det fungerede også godt for immuno-mærkning af centrosomal og junctional proteiner samt celle markører.
Fiksering protokoller
Formaldehyd (frisklavet fra PFA) er en relativt hurtig virkende fiksativ, der danner reversible cross-links og 4% PFA fungerer godt for eksempel i immuno-mærkning mikrotubuli og gamma-tubulin og farvning actin filamenter med Phalloidin. Mere fortyndes PFA løsninger såsom 1% fungeret godt for immuno-mærkning for eksempel med stamcelle markører Lgr5 og Paneth celle markør CD24 i krypten stamcelle niche, mens højere koncentrationer af PFA ikke virkede.
Tilsætning af glutaraldehyd giver bedre bevarelse af mikrotubuli og den såkaldte PHEMO fiksering, som består af en blanding af 3,7% PFA, 0,05% glutaraldehyd og 0,5% vaskemiddel i PHEMO buffer (68 mM rør, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA og 3 mM MgCl2)2 giver fremragende bevarelse af mikrotubuli uden at kompromittere antigenicity. Det virker også godt for immuno-mærkning gamma-tubulin, β-catenin, og E-cadherin og farvning actin filamenter med phalloidin. Dog i 3D væv og organoid kulturer, PHEMO fiksering produceret inkonsistente resultater og derfor ikke blev anvendt.
Methanol er en koaguleringsmiddel fiksativ, der giver relativt gode penetration og tendens til at bevare antigenicity. Fiksering med 100% methanol (-20 ° C) introducerer nogle krympning, giver moderat morfologi bevarelse og virker for mikrotubuli, + TIPs og mange centrosomal antistoffer, herunder ninein i 2D cellekulturer. Men nogle organoids kollapsede når du bruger denne fiksering metode. Derudover penetration af antistoffer gennem hele Krypter, villi, eller organoids var oprindeligt et problem men tilsætning af 0,1% vaskemiddel til vaskeopløsning og langvarig vask opnåede bedre resultater.
En kombination af formaldehyd og methanol havde tidligere været brugt af Rogers et al. 20 at immuno-label EB1 i Drosophila. En fiksering protokol baseret på en blanding af formaldehyd og methanol er derfor udviklet til tarmens væv og organoids baseret på 3% formaldehyd og 97% methanol nedkøles til-20 ° C, men udelade natriumcarbonat 5 mM fra den blanding, der blev brugt af Rogers mfl. 20 desuden prøver blev fastsat i fryser ved-20 ° C. Dette fungerede særdeles godt for immuno-mærkning + TIPs, såsom klip-170 og EBs, men også viste sig fremragende til fastsættelse og immuno-mærkning mikrotubuli og aktin inden for væv og 3D organoids. Meget god strukturel bevarelse var tydelig og antigenicity blev bevaret for flere cytoskeletal og tilknyttede proteiner samt centrosomal proteiner som gamma-tubulin og ninein, selv om mærkning for ninein arbejdede mere konsekvent med methanol fiksering.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Paul Thomas for mikroskopet rådgivning og bistand. Dette arbejde involveret her blev støttet af BBSRC (give nr. BB/J009040/1 M.M.M. og T.W.).
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |