نقدم البروتوكولات لعزل المعوية هياكل ثلاثية الأبعاد من الأنسجة في الجسم الحي والمضمنة في المختبر مصفوفة الطابق السفلي أورجانويدس، والتثبيت المختلفة بالتفصيل وتلطيخ البروتوكولات الأمثل لوسم المناعية من ميكروتوبولي، البروتينات سينتروسومال، وهالة كذلك خلية علامات بما في ذلك الخلايا الجذعية البروتين Lgr5.
ظهور ثلاثية الأبعاد في المختبر أورجانويدس التي تحاكي في فيفو هندسة الأنسجة و morphogenesis متقدمة إلى حد كبير القدرة على دراسة المسائل البيولوجية الرئيسية في الخلية وعلم الأحياء التنموي. وباﻹضافة إلى ذلك، وعود أورجانويدس جنبا إلى جنب مع التقدم التقني المحرز مؤخرا في تحرير الجينات والمورثات الفيروسية التسليم للنهوض بالبحوث الطبية واستحداث أدوية جديدة لعلاج الأمراض. أورجانويدس تزرع في المختبر في الطابق السفلي مصفوفة توفير نظم نموذجية قوية لدراسة السلوك ووظيفة البروتينات المختلفة، وهي مناسبة تماما للعيش-التصوير للبروتينات الفلورية ذات العلامات. ومع ذلك، إنشاء التعبير والترجمة من البروتينات الذاتية في أنسجة الجسم الحي السابقين و في المختبر أورجانويدس هامة للتحقق من سلوك البروتينات المعلمة. وتحقيقا لهذه الغاية علينا المتقدمة وتعديل عزل الأنسجة، وتثبيت، وبروتوكولات وسم المناعية للتعريب microtubules، سينتروسومال، وما يرتبط بها البروتينات في الأنسجة المعوية فيفو السابقين و في المختبر أورجانويدس المعوية. وكان الهدف لمثبت للحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد من أورجانويدس/الأنسجة الوقت أيضا الحفاظ على جسم أنتيجينيسيتي وتمكن من اختراق جيد وإزالة مثبت والأجسام المضادة. التعرض للبرد ديبوليميريزيس جميع ولكن ميكروتوبوليس مستقرة، وكان هذا عاملاً أساسيا عند تعديل البروتوكولات المختلفة. ووجدنا أن زيادة التركيز (يدتا) حمض الذي الإيثيلين من 3 مم إلى 30 مم أعطى مفرزة فعالة من الزوائد والاقبية في الأمعاء بينما كان كافياً للأقبية colonic يدتا 3 مم. وأعطى البروتوكول التثبيت المتقدمة فورمالدهايد/الميثانول الحفاظ على هيكلية جيدة جداً مع أيضا الحفاظ على أنتيجينيسيتي لوسم فعالة microtubules، أكتين، والبروتينات (EB) نهاية الملزمة. كما أنها عملت نينين البروتين سينتروسومال على الرغم من أن البروتوكول الميثانول عملت أكثر باستمرار. وأنشأنا كذلك أنه يمكن تحقيق التثبيت ووضع العلامات المناعية ميكروتوبوليس والبروتينات المرتبطة بها مع أورجانويدس المعزولة من أو البقاء داخل المصفوفة الطابق السفلي.
تشكيل epithelia مع الأقطاب أبيكو القاعدية هو عملية أساسية في عملية التنمية، وينطوي على إعادة تنظيم هائلة microtubules والبروتينات سينتروسومال. مجموعة microtubule شعاعي النابعة من ميكروتوبولي سينتروسومال بموقع مركزي تنظيم مركز (بعد) بارز في العديد من الخلايا الحيوانية وهذا مناسب تماما لخلايا مسطحة نسبيا. على النقيض من ذلك، تجميع عمودي من الخلايا الظهارية، مثل تلك التي الأمعاء، صفائف microtubule ترانسسيلولار شعاعي غير أن دعم أفضل شكل ومهام متخصصة لهذه الخلايا. عملية إعادة التنظيم هذه مثيرة ميكروتوبوليس ويتحقق من خلال سينتروسومي الانتقال إلى ذروة وغير سينتروسومال متوكس قمي (n-متوكس) تشكيل، الذي يصبح مسؤولاً لرسو السفن من1،ميكروتوبوليس ترانسسيلولار2 , 3 , 4 , 5.
الكثير من معرفتنا بالتمايز الظهارية، وإعادة تنظيم microtubule المرتبطة بها قد تأتي من التحقيقات في 2D في المختبر طبقات الخلايا التي لا يتم عرض بنية الأنسجة في الجسم الحي . ويمثل التطور 3D في المختبر الثقافات أورجانويد، بادرت كليفيرس وزملاء العمل6، تقدم التكنولوجي رئيسية كما أنها تحاكي في فيفو العمارة والتنمية. التسلسل هرمي للتمايز الظهارية يتجلى في الأمعاء؛ الخلايا الجذعية في الجزء السفلي من أقبية تؤدي إلى عبور غير ناضجة تضخيم الخلايا التي تتكاثر وتفرق تدريجيا عندما تهاجر حتى سرداب على زغابة معوية صغيرة أو على سطح colonic، حيث أنها أصبحت متباينة تماما قبل أن تسلط في التجويف7. الأهم من ذلك، وهذا يتكرر في أورجانويدس المعوية حيث تتكاثر الخلايا من الخلايا الجذعية المتخصصة تشكل الخراجات التي تولد براعم سرداب الشبيهة بالخلايا الجذعية في القاع والتمايز تتقدم تدريجيا نحو منطقة كيسه، في وقت لاحق يصبح مثل الزوائد8. أورجانويد المعوية وبالتالي يمثل نموذجا قويا لدراسة ليس فقط من ميكروتوبولي وإعادة تنظيم سينتروسومال خلال التمايز الظهارية لكن العديد من البروتينات الأخرى، فضلا عن توفير منصة مثالية لفحص الأدوية والأغذية مركبات إمكانات العلاجية فوائد9،10.
أورجانويدس هي مناسبة تماما للعيش-التصوير للبروتينات الفلورية معلم وكلاهما تدق والمغلوب أورجانويدس يمكن إنشاؤها باستخدام الجينات كريسبر/Cas9 تحرير11،12. إنشاء تعبير والتعريب من البروتينات الذاتية دراستها غير هامة، خاصة للتحقق من سلوك البروتينات المعلمة. أورجانويدس 3D وسم المناعية نمت في مصفوفة الطابق السفلي أو السابقين فيفو عزل الأنسجة أكثر تعقيداً من الخلايا التي نمت في أطباق الثقافة في 2D. تثبيت البروتوكول يحتاج إلى الحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد الدقيقة أورجانويدس مع المحافظة على جسم أنتيجينيسيتي (أي، [ابيتوبس] لربط الأجسام المضادة). على سبيل المثال، بارافورمالدهيد 4% (PFA) يستخدم عادة كمثبِّت ولكن رغم أنه مثبت النيابة سريع نسبيا ويعطي جيدة الحفاظ على الخصائص المورفولوجية، في تجربتنا أنه كثيرا ما يؤدي إلى فقدان أنتيجينيسيتي وليست مناسبة للعديد الأجسام المضادة سينتروسومال. وينبغي أيضا النظر في مثبت وأجسام مضادة قادرة على اختراق هياكل ثلاثية الأبعاد والأنسجة. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن قد عدلت والبروتوكولات المتقدمة لعزل الأنسجة ووسم المناعية غير المباشرة أورجانويدس 3D في المختبر و السابقين فيفو عزل الأنسجة المعوية. ونحن تصف كيفية عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة والزوائد والأنسجة colonic، وتشمل بروتوكول لعزل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد كبديل لتحديد ووسم المناعية داخل المصفوفة الطابق السفلي. نحن نقدم ثلاثة بروتوكولات تثبيت البديلة لوسم المناعية microtubules والبروتينات سينتروسومال، مثل نينين، والبروتينات تتبع زائد-نهاية ميكروتوبولي (+ نصائح)، مثل البروتينات EB ومقطع-170 (انظر أيضا المراجع8، 13). كما نناقش إيجابيات وسلبيات المقترنة مع كل بروتوكول.
عزل الأنسجة المعوية
عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة والزوائد والاقبية colonic ينطوي على تعريض سطح المخاطية، المعاملة مع الحل أدتا تخفيف الاتصالات المحمولة وتجزئة (الهز) والطرد المركزي. تم تعديل البروتوكول العزلة الزوائد المعوية قدم/سرداب من بيلشاو et al. ووايتهيد et al. 17 , 18
تعريض سطح المخاطية
ونحن قد جربت عددا من النهج لفضح السطح المخاطي للامعاء في وضع هذا الإجراء. نهج كلاسيكي إيفرت (إيقاف الداخل إلى الخارج) الأنبوب، عادة في مقاطع طويلة، حوالي 100 مم استخدام قضيب معدني يتم التقاطها في إضعاف النسيج في نهاية واحدة والانبوب المتبقي ثم انزلق عبر أنبوب19. للماوس الأنسجة، مثالي قضيب معدني (2.4 مم) ذات نهايات مستدير الزوايا. وهذا النهج قد يعود بالنفع لتوسيع سطح المخاطية مما يتيح إمكانية الوصول إلى برنامج تلفزيوني ويدتا. ونحن في البداية يستخدم هذا النهج لكنها انتقلت إلى قطع الأنبوبة إلى أطوال قصيرة (حوالي 5 سم) وفتح كل مقطع بتشريح مقص كما أثبت هذا أسهل. وهذا النهج مناسبة إلا إذا كان مطلوبة من عدد قليل من الأمعاء؛ ولكن إذا كانت الحيوانات أكثر أن تستخدم في تجربة ثم بنيت لهذا الغرض جهاز لقطع فتح الأنبوب طوليا، كما وصفها Yoneda et al. 14 سيكون أكثر كفاءة.
مفرزة من الزوائد والاقبية من طبقة العضلات
في البداية استخدمنا 3 مم يدتا في برنامج تلفزيوني وفترات حضانة طويلة نسبيا تصل إلى 60 دقيقة لتخفيف سطح المخاطية من17،الأنسجة الكامنة وراء18. في هذا التركز يدتا وجدنا وقت حضانة من 30 دقيقة كانت كافية لتخفيف الأقبية من القولون الماوس. ومع ذلك، لعزل سرداب/زغابة الأمعاء حاولنا استخدام يدتا أكثر تركيزاً لفترة أقصر، التي ثبت أن اتباع نهج فعالة. وأجرى جميع الأعمال اللاحقة مع الأنسجة المستخرجة باستخدام تقنية يدتا 30 ملم توليد الكسور ذات الصلة للزوائد أو الأقبية. للأقبية، نحن عادة تجميع الكسور 3-5 قبل إصلاح لكن من المهم للتحقق من ما إذا كانت هذه هي الكسور المناسبة حسب التوقيت يعتمد على عدد من العوامل مثل موقف على طول القناة المعوية، وعمر الماوس، التهاب، والنظام الغذائي السابق ، إلخ وعلى نحو مماثل، قد يختلف طول الوقت الأنسجة يحتاج إلى أن تهتز بعد العلاج أدتا أن تكون فعالة تحت ظروف مختلفة. والنتيجة كسور الأنسجة المعزولة التي تحتوي على خليط من الزوائد والاقبية أو أساسا أما الزوائد أو الأقبية (الشكل 2). كما أن هناك لا الزوائد في القولون، استخراج سرداب قد يكون ممكن التحقيق في خطوة واحدة بالهز الأنسجة في أنبوب لمدة 30 ثانية. يمكن إصلاح هذه الكسور والمجهزة لوسم المناعية.
عزل أورجانويدس المعوية من مصفوفة الطابق السفلي
يمكن عزل أورجانويدس من الطابق السفلي القباب مصفوفة باستخدام حل الاسترداد الخلية. يعمل الحل عن طريق ديبوليميريزينج المصفوفة تبلور الطابق السفلي ولكن يلزم درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. الحذر من أن ميكروتوبوليس الحيوية قد لا يتم الاحتفاظ. وهكذا، لوسم المناعية لدينامية microtubules و + نصائح مثل الخلية الحديدية، لا يوصي بالانتعاش من مصفوفة الطابق السفلي قبل التثبيت. ومع ذلك، معظم microtubules في تمييز الخلايا أورجانويد مستقرة نسبيا وكانت هذه المحافظة (الشكل 6). كما أنها عملت جيدا للعلامات المناعية لبروتينات سينتروسومال وهالة، فضلا عن علامات خلية.
تثبيت البروتوكولات
فورمالدهايد (طازجة من منهاج عمل بيجين) كروسلينكس مثبت التصرف السريع نسبيا التي تشكل عكسها ونسبة 4 في المائة منهاج العمل يعمل جيدا على سبيل المثال، في وسم المناعية microtubules وغاما-tubulin وخيوط أكتين المصبوغة مع فالويدين. أكثر تمييع حلول منهاج العمل مثل 1% عملت جيدا بالنسبة وسم المناعية على سبيل المثال، مع علامات Lgr5 وبانيث الخلايا الجذعية علامة خلية CD24 داخل سرداب الخلايا الجذعية المتخصصة، في حين لم تنجح تركيزات أعلى من منهاج عمل بيجين.
إضافة glutaraldehyde يعطي أفضل الحفاظ على ميكروتوبوليس وما يسمى فيمو تثبيت البرنامج الذي يتكون من خليط من 3.7% منهاج عمل بيجين، جلوتارالديهيدي 0.05% والمنظفات 0.5% في فيمو المخزن المؤقت (أنابيب 68 مم، 25 مم هيبيس، 15 اجتا و 3 ملم MgCl2)2 يعطي المحافظة ممتازة من ميكروتوبوليس دون المساس أنتيجينيسيتي. كما أنها تعمل جيدا لوسم المناعية غاما-tubulin وبيتا-كاتينين، وهاء-كادهيرين وخيوط أكتين المصبوغة مع فالويدين. ومع ذلك، في أنسجة ثلاثية الأبعاد والثقافات أورجانويد، تثبيت فيمو تنتج نتائج غير متناسقة ولذلك لم يستخدم.
من الميثانول مثبت تخثر يعطي اختراق جيدة نسبيا، ويميل إلى الحفاظ على أنتيجينيسيتي. التثبيت مع 100 ٪ الميثانول (-20 درجة مئوية) يقدم بعض الانكماش ويتيح الحفاظ على مورفولوجيا معتدلة ويعمل microtubules، + نصائح، والعديد من الأجسام المضادة سينتروسومال بما في ذلك نينين في 2D خلية الثقافات. ومع ذلك، انهارت بعض أورجانويدس عند استخدام أسلوب التثبيت هذا. وباﻹضافة إلى ذلك، الاختراق من الأجسام المضادة من خلال أسرة الأقبية أو الزوائد أو أورجانويدس كان في البداية مشكلة ولكن إضافة المنظفات 0.1% إلى الحل الغسيل والغسيل طويلة حققت نتائج أفضل.
مزيج من الفورمالدهايد والميثانول كان يستخدمها سابقا روجرز et al. 20 إلى EB1 المناعية-التسمية في المورفولوجية. تثبيت بروتوكول يستند إلى مزيج فورمالدهايد والميثانول لذلك بوضع الأنسجة المعوية وأورجانويدس استناداً إلى 3% فورمالدهايد و 97 ٪ الميثانول مبردة إلى-20 درجة مئوية، ولكن إهمال كربونات الصوديوم 5 مم من الخليط التي تم استخدامها بواسطة روجرز وآخرون. كانت عينات 20 بالإضافة إلى ذلك، ثابتة في الثلاجة عند-20 درجة مئوية. هذا عملت لا سيما جيدا للعلامات المناعية + نصائح، مثل القصاصة-170 والحديدية، ولكن ثبت أيضا ممتازة لتحديد ووسم المناعية microtubules واكتين داخل الأنسجة و 3D أورجانويدس. الحفاظ على هيكلية جيدة جداً وكان واضحا والمحافظة على أنتيجينيسيتي لعدة بروتينات cytoskeletal والمرتبطة بها، فضلا عن البروتينات سينتروسومال مثل غاما-tubulin ونينين، على الرغم من أن وضع العلامات نينين عمل أكثر اتساقا مع الميثانول التثبيت.
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون بول توماس مجهر المشورة والمساعدة. أيد هذا العمل تشارك هنا بسرك (منحة لا. BB/J009040/1 M.M.M. و T.W.).
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |